Neurala stamceller (NSCs) avser celler som kan själv förnya och differentiera in de tre neurala linjerna. Här beskriver vi ett protokoll för att bestämma NSC frekvens i en given cellpopulation med hjälp av neurosfären bildning och differentiering i klonala betingelser.
Neurala stamceller (NSCs) har förmågan att själv förnya och generera de tre stora neurala härstamningar – astrocyter, nervceller och oligodendrocyter. NSCs och neurala stamceller (NPS) är vanligtvis odlas in vitro som neuro. Detta protokoll beskriver i detalj hur man bestämmer NSC frekvensen i en given cellpopulation enligt klonala betingelser. Protokollet börjar med ympning av cellerna vid en densitet som möjliggör generering av klonala neurosfärer. Neurosfärerna överförs sedan till chambered täckglas och differentieras enligt klonala betingelser i konditionerat medium, som maximerar differentieringspotential av neurosfärerna. Slutligen NSC frekvensen beräknas utifrån neurosfärbildning och multipotens kapacitet. Nytta av det här protokollet inbegripa en utvärdering av kandidat NSC markörer, rening av NSCs, och förmågan att skilja NSCs från NPS. Denna metod tar 13 dagar att utföra, vilket är mycket shorter än nuvarande metoder för att räkna upp NSC frekvens.
Neurala stamceller (NSCs) är celler i det centrala nervsystemet (CNS) som kan själv förnya och är multipotenta. NSCs först specificeras under utvecklingen av embryonala framhjärnan och fortsätter att framhärda i den vuxna hjärnan på specifika regioner såsom subventrikulära zonen (SVZ) av de laterala ventriklarna och dentate gyrus (GD) i hippocampus. Ett antal NSC linjer används i kliniska prövningar för behandling av stroke och andra neurologiska sjukdomar såsom Batten sjukdom 1.
NSCs och neurala stamceller (NPS) förökas i kulturen som flytande tre-dimensionella sfäroida strukturer som kallas neuro. Neurosphere kultur Systemet har utvecklats av Reynolds och Weiss i början av 1990-talet, när de fann att embryonala och vuxna kortikala celler kan dela i närvaro av epidermal tillväxtfaktor (EGF) och basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) 2-4. Neuro består av en heterogen blandning av calnar bestående av underklasser i olika utvecklingsstadier 5. Det är en utmaning att specifikt studera NSCs med hjälp av data som erhållits från neuro på grund av förekomsten av NPS. Därför är det viktigt att berika NSCs från neuro. För närvarande har fyra huvudsakliga metoder använts för att anrika för NSCs in vitro. Första är användningen av cellytemarkörer. Lewis-X (LEX) och CD133 (även känd som Prominin1) är den mest framträdande cellytan NSC markörer 6-9. Syndekan-1, Notch-1 och integrin-beta1 är andra ytproteiner som berikar för NSCs 10. Andra är färgämnet utslagning. Det har visat sig att sidobefolknings celler, som har en unik förmåga att pumpa ut den fluorescerande DNA-bindande färgämnet Hoechst 33342, anrikas för NSCs 11. Tredje är användningen av morfologisk selektion. Det har visats att celler med ökad cellstorlek och kornighet hamn mer NSCs än sina motsvarigheter 5,12,13. Fjärde är tillägget av NSC SUrvival faktorer till odlingsmediet. Det har visats att tillsats av Kondroitinsulfat proteoglykan och Apolipoprotein E förhöjer NSC överlevnad och ökar således NSC frekvens 14,15. Även om många markörer inklusive transkriptionsfaktorer har förknippats med NSCs 16,17, ingen av dessa markörer har möjlighet att berika NSCs till renhet. På grund av bristen på definitiva NSC markörer, är det fortfarande en utmaning att kvantifiera NSCs och skilja dem från NP in vitro.
Initiala studier använde neurosphere bildningsanalys (NFA) att kvantifiera NSCs 7,11,13. I denna analys, dissocierade celler odlas för att bilda neurosfärer, och antalet neurosfärer som genereras för varje 100 celler utstrukna bestäms. Detta värde kallas den paketbildande enheten neurosphere (NFU). NFU är lika med NSC frekvens om alla neuro uppstår från NSCs. Emellertid visades det att NFU skattar NSC frekvens som neurosfärer bildas genom båda NSCs och tidig NP 5. Således är det fel att räkna NSCs baserat enbart på neurosphere bildning. Det kan vara möjligt att kvantifiera NSCs baserat på deras förmåga att själv förnya, föröka sig mycket och generera multineuro.
NSCs, som är EGF och bFGF lyhörd, vanligtvis överleva åtminstone tio passager och därmed visa omfattande självförnyelse kapacitet i kultur 4,18-20. NP, som är EGF och bFGF reagerar också, kan också generera neuro för ett par passager men inte för en längre tid. Därför har det varit allmänt accepterat att bona fide NSCs kan räknas upp med rättvis noggrannhet baserad på neurosfärbildning under minst tio passager. I de flesta studier har dock självförnyelse mäts vanligtvis baserat på sekundär eller tertiär neurosphere bildning på grund av den långa experimentella tid som krävs för tio passager. Följaktligen kan den sekundära NFA användas för att i stort sett jämföra självförnyelse förmåga betlan populationer, men kan inte användas för att exakt räkna NSC frekvens.
NSCs har en större förmåga att föröka sig jämfört med NP. Denna egenskap hos NSCs användes av Louis et al. att utveckla en analys för NSC uppräkning – neurala kolonibildande cellanalys (NCFCA) 21,22. I denna analys, enskilda celler odlas i 3 veckor i ett kollageninnehållande halvfast matris. Under dessa odlingsbetingelser, visade det sig att celler som bildar neurosfärer över 2 mm i diameter är tripotent och kan själv förnya för lång sikt. Dessa celler definieras som NSCs. Därför är NSCs effektivt skiljas från NPS.
NSCs har förmågan att differentiera till astrocyter, oligodendrocyter och neuroner. För differentiering av neurosfärer, är tillväxtfaktorer avlägsnas och serum sättes till odlingsmediet. Om alla tre neurala linjer observeras i en neurosphere, då cellen som initierade det neurosphere iär en NSC. Emellertid har differentieringsanalysen vissa begränsningar. För det första kan de odlingsbetingelser som används för differentiering inte optimalt för generation av alla tre neurala härstamningar. I själva verket i en enda neurosfär differentieringsprocessen, sker signifikant celldöd och mestadels astrocyt generering inträffar (Tham M och Ahmed S, opublicerad). För det andra är frågan om clonality. För exakt uppräkning av NSCs, bildning och differentiering av neurosfärer måste utföras under klon förhållanden, där varje neurosphere uppstår från en enda cell. I bulksuspensionsodlingar sker aggregering på både cellulära och neurosfärnivåer 23-25. Följaktligen är det möjligt för var och neurosfär härröra från flera celler eller neurosfärer, vilket komplicerar neurosfären räkning och utvärdering av multipotens. Nya rön visar att aggregering av celler inte förekommer vid låga plätering densitet av 0,5 celler / mikroliter eller lägre, och när odlingsplattor inte flyttas under neurosphere bildningen 15. Således odling av celler vid en sådan låg densitet skulle säkerställa clonality.
För närvarande är NCFCA den vanligaste metoden för att skilja NSCs från NP och räkna NSC frekvens. Den NCFCA kräver emellertid en relativt lång tid på tre veckor. Här beskriver vi ett protokoll för att räkna NSC frekvens baserad på förmågan hos NSCs att bilda multineuro. Detta protokoll tar bara 13 dagar att utföra. Den NCFCA säkerställer clonality som kollagenmatrisen förhindrar förflyttning av neuro. De odlingsbetingelser som används i detta protokoll kan också clonality upprätthållas hela tiden. Till exempel användning av 50-brunnars kammarförsedda täckglas säkerställer att neurosfärerna kommer att skilja utan att kontakta varandra. Vidare använder vi konditionerat medium som levererar neurotrofa faktorer under differentiering för att maximera differentieringspotential av neurosfärer (Figur 1).
Vi beskriver Hee räkning av NSCs i klonala betingelser. Kritiska steg innefattar användning av färska NSC tillväxt och differentieringsmedium, och även användningen av nyberedd PLL / Laminin lösning för att belägga chambered täckglas, såväl som odlingsskålarna. Detta säkerställer optimal tillväxt och differentierings villkoren för neuro. Användningen av god kvalitet antikroppar för att effektivt upptäcka nervceller och glia, samt selektiv plockning av klonala neuro som inte är i kontakt med andra neuro, är kritisk. Dessutom är det viktigt att se till att plockas neuro inte torkar upp. Det rekommenderas att lägga till 10 mikroliter av differentiering medium till varje brunn efter plockning var 10 neuro. Det är viktigt att använda ett kamrar täck i en 10 cm skål per prov för att undvika överhörning mellan neuro från olika prover. Om två täck (var och en innehåller neuro från olika prover) placeras iSamma 10 cm skål, neuro från en täck kan frigöra faktorer som kan påverka benägenheten av neuro i den andra täck att differentiera till specifika linjer. Två täckglas i samma 10 cm skål kan också resultera i blandning upp mellan prover.
I händelse av NFU eller NSC frekvensen är lägre än väntat, att lågt passagenummer neuro används. Det är också viktigt att friska låga passageneurosfärer används för generering av konditionerat medium. Nästa, om neuro odlas i brunnar med liten diameter, såsom i 96-bra maträtt, då blir det svårt att manövrera och plocka neuro med hjälp av en mikropipett. I detta fall överför neurosfärerna till en större odlingsskål, såsom en 6-brunnsskål, före plockning. Några av de plockade neuro kan lyfta från kammartäck under kultur och immunfärgning. Minimera rörelse kammartäck under odling, och mindre intensiv tvätting under immunfärgning, skulle bidra till att undvika avlossning av neuro.
Inledande studier kvantifieras NSCs enbart med hjälp av NFA 7,11,13. Men Livsmedelsverket överskattar NSC frekvens som både NSCs och tidiga NP genererar neuro 5. Louis et al. Utvecklat en annan metod för att kvantifiera NSCs kallas NCFCA 21,22. Den NCFCA involverar odling av enstaka celler i en kollagenbaserad matris för att säkerställa klonalitet, och det visade sig att neurosfärer över 2 mm i diameter bildas genom endast NSCs. I likhet med NCFCA är clonality garanteras i hela detta protokoll. Detta uppnås genom att generera neuro på klonal täthet och differentierande neurosfärerna i kammartäck. Användningen av chambered täckglas ger ett antal fördelar. Chambered täck tillåter varje prov neurosphere att differentiera utan fysisk kontakt med andra provneuro därigenom säkerställa clonality under differentiering.Chambered täck kan placeras upphängd på differentieringsmedium för att tillåta provneuro kontinuerligt rade och för att säkerställa maximal differentiering. I frånvaro av konditionerat medium och serum under differentiering, överlevnad neuro minskar och neuro mestadels generera astrocyter (Tham M och Ahmed S, opublicerade). Dessutom kan de immunneuro lämpligen lagras under lång tid och kammartäck kan monteras direkt på mikroskopglas. Dessutom är avbildning av immunneuro görs enkelt som man kan snabbt hitta neurosphere i den lilla kammare väl, ta en bild och gå vidare till nästa brunn.
Vi har bestämt NSC frekvensen i E14.5 mus neurosphere kultur med hjälp av både det protokoll som beskrivs i detta manuskript 27 och NCFCA 28. NSC frekvensen i E14.5 mus neuro bestäms av både migthods är jämförbara. Den NCFCA räknar NSCs som är multipotenta och har långsiktiga självförnyelse kapacitet. Eftersom NSC frekvensen från vår metod är jämförbar med den från NCFCA, betyder utläsningen från våra protokoll verkar inte att överskatta NSC frekvensen. Den NCFCA kräver tre veckor som skall slutföras och främst innebär cell plätering och medel påfyllning. Protokollet som beskrivs här kräver 13 dagar att utföra och innebär en annan serie av steg, till exempel, neurosphere plockning och immunfärgning. Detta protokoll skulle kunna tjäna som en alternativ metod för att räkna NSCs. Forskare kan använda både NCFCA och detta protokoll för att kontrollera NSC frekvens i sina prover.
En begränsning av detta protokoll är att en rad viktiga steg måste alla utförs på dagen 8. Beredningen av konditionerat medium, bestämning av NFU av provneuro, och överföring av provneuro till 50 brunnar chambered täck måste vara utförs på day 8. Man kan ta tid att slutföra de här stegen. Dessutom kräver det praxis att utföra dessa steg på ett effektivt sätt.
Neurosfärer har använts i stor utsträckning för att studera NSC funktion och beteende. Men neuro består av både NSCs och NPS. Därför är det viktigt att berika NSCs från neuro att studera NSC biologi. För närvarande har cellytmarkörer, färgexklusion egendom samt cellstorlek och kornighets använts för att anrika för NSCs 6,7,9-13,29,30. Detta protokoll kan användas för att kvantifiera anrikning av NSCs potentiella NSC markörer, och för att underlätta sökandet efter en slutgiltig NSC markör. Fyra nya studier har använt detta protokoll för att räkna NSC frekvens 5,14,15,26.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar byrån för vetenskap, teknologi och forskning (A * STAR), Singapore för att finansiera denna forskning.
15 ml conical centrifuge tubes | BD | 352096 | |
50 ml conical centrifuge tubes | BD | 352070 | |
20 ml sterile syringe | BD | 300141 | |
50 ml sterile syringe | BD | 300144 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody | Covance | MMS-435P-100 | |
Rabbit anti-GFAP IgG antibody | Dako | Z033401 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
Microscope fitted to laminar flow hood | Leica | MZ6 | |
Glass slides | Marienfeld-superior | 1000200 | |
Mouse anti-O4 IgM antibody | Merck Millipore | MAB345 | |
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | |
Microscope | Nikon Eclipse | TS100-F | |
Laminar flow hood | NuAire | NU-543 | |
96-well culture dishes | NUNC | 167008 | |
10-cm culture dishes | NUNC | 150350 | |
Paraffin film | Parafilm | PM999 | |
Human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
0.2 µm filter | Sartorius Stedim | 16534-K | |
0.45 µm filter | Sartorius Stedim | 16555-K | |
1.0 N Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S2770 | |
1.0 N Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | H9892 | |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
Paraformaldehyde (PFA) powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Toxic |
Bovine serum albumin (BSA) powder | Sigma-Aldrich | A7906 | |
50-well chambered coverslips | Sigma-Aldrich | C7735 | |
Stir plate with heat function | Stuart | UC152 | |
DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
B27 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
1x phosphate buffered saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | A21042 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific | A21135 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A31573 | |
4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
Cell culture centrifuge | Thermo Fisher Scientific | RT1 75002383 | |
Pasteur pipettes | Thermo Fisher Scientific | 10006021 | |
CO2 incubator | |||
Ventilated fume hood | |||
Aspirator | |||
Confocal microscope | |||
Micropipettes | |||
Micropipette tips | |||
Plastic pipettes | |||
Multichannel pipettes | |||
Glass beaker | |||
Sterile forceps | |||
pH meter |