Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Enda molekyl Super-upplösning avbildning av Fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat i plasmamembranet med nya fluorescerande Probes

Published: October 15, 2016 doi: 10.3791/54466
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neuroscience, University of Wisconsin-Madison

Summary

PI (4,5) P2 reglerar olika cellulära funktioner, men dess nanoskala organisation i cellplasmamembranet är dåligt kända. Genom märkning PI (4,5) P2 med en dual-färg fluorescerande sond fuserad till pleckstrinhomologidomän beskriver vi en ny metod för att studera PI (4,5) P2 rymdfördelning i plasmamembranet på nanometerskala .

Introduction

Fosfoinositider bidrar till en liten del av den totala membranlipider, men spelar kritiska roller i en mångfald cellulära processer. De omfattar sju medlemmar som härrör från reversibel fosforylering eller defosforylering av inositol ringar på den 3: e, 4: e och 5: e positionerna 1. Fosfatidylinositol 4-fosfat (PI4P) och fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat (PI (4,5) P2) är två viktiga fosfoinositider som fungerar relativt oberoende som de avgörande lipider cellplasmamembran (PM) 2,3. Fosfatidylinositol (3,4,5) -trisphosphate (PIP 3) är mycket mindre riklig än PI4P och PI (4,5) P2, men det har unika funktioner i olika cellulära processer, inklusive cancer 4 och diabetes 5. Dessa lipider har molekylära interaktioner komplex med sina effektorer och många andra proteiner. Därför är det viktigt att förstå den rumsliga organisationen av dessa phosphoinositides i PM på nanometerskala.

Montera bevis har visat att proteinkomplex eller molekylkluster i de trånga PM områden kan fungera som signal hotspots 6. Till exempel, syntaxin 1a, ett nyckelprotein som reglerar membranfusion 7-9 visar klusterorganisation i PM. Skiljer sig från konsensussynen av klustret organisation syntaxin 1a, är den geografiska fördelningen av fosfoinositider i PM kontroversiell. Mönster PI (4,5) P2 utbredningsområde från enhetlig 10-12, stora fläckar 13,14 för att täta kluster 14-18, beroende på celltyper och experimentella metoder som används. Den rumsliga organisationen av PI (4,5) P2 vid högre upplösning är också inkonsekvent. En studie med stimulerad-utsläpp utarmning (STED) mikroskopi 19 har avslöjat ett stort antal tät PI (4,5) P 2 nanokluster (~ 73 nm i diameter) i PM ark PC-12-celler 20 21,22, en metod som bevarar den intakta PM strukturen av levande celler mycket bättre än kemisk fixering. Den senare visade tydliga pooler av PI (4,5) P2; relativt koncentrerad PI (4,5) P2 i caveolae och belagda gropar samt jämn fördelning på plan PM regionen. Dessutom kan nanoskala PI (4,5) P2 organisation i membran ark skiljer sig i levande och fixerade celler. Vårt senaste arbete undersökte denna fråga i både fasta och lever INS-1-celler med hjälp av en enda molekyl lokalisering mikroskopi (SMLM) 23.

SMLM baseras på stokastiskt inkoppling endast en liten delmängd av fluoroforer vid varje given tidpunkt, så att enskilda fluoroforer kan lokaliseras med hög precision. Många super-upplösning avbildning har utvecklats med hjälp av liknande principer att överträffa diffraktionsgränsen av konventionell Ijusmikroskopi, en sådans fotoaktivering lokalisering mikroskopi (PALM) 24, fluorescens fotoaktiverings lokalisering mikroskopi (FPALM) 25, stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi (STORM) 26,27 och direkt STORM (dSTORM) 28. Med fotoomkopplings eller fotoaktiverbara fluoroforer (färgämnen eller fluorescerande proteiner), SMLM tekniker tillåter forskare att bild biologiska strukturer på nanometerupplösning 24,29,30 med video-rate i levande celler 31,32.

Använda PI (4,5) P2 som ett exempel, introducerade vi SMLM strategi för att studera nanofördelningen fosfoinositider på PM. PH-domänen hos PLCδ1 (Fosfolipas C δ1) som specifikt binder till PI (4,5) P2 är en väletablerad sond för avbildning PI (4,5) P2 sub-cellulära distributionen och dynamik 33,34 i PM . Vi har genetiskt märkt denna domän med två fluorescerande proteiner, PAmCherry1 35 och iRFP 36 PLCδ1) (Figur 1A-B). PAmCherry1 tjänar som fotoaktiverbar prob av PH-domän för PALM och iRFP fungerar som en allmän indikator för att identifiera transfekterade celler innan PALM förvärvet . Vi tillämpar denna tvåfärgad fluorescerande prob för SMLM avbildning i de fasta membranblad. För levande PALM avbildning, märkt vi mEOS3 37 i stället för PAmCherry1 till PH PLCδ1 domänen för att generera mEOS3.1-PH PLCδ1 prob för dess bättre foton effektivitet och ljusstyrka (Figur 1C-D).

SMLM avbildning med dessa nya prober i PM av insulinproducerande INS-1-celler 38 har avslöjat homogen märkning av PI (4,5) P2 i de flesta PM regionerna samt koncentrerad PI (4,5) P2 mikrodomäner som är glest blandade i lägenheten PM och vissa filopodia liknande strukturer 23. Då ennoScale fördelning av PI (4,5) P2 ger en strukturell bas för nytänkande hur den fungerar i levande celler.

Protocol

1. Membranblad Förberedelse och Fixering

  1. Förbereda membranark märkta med iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1
    1. Förbered DNA-plasmid som kodar iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 23 användning av standardmässiga molekylärbiologiska tekniker.
    2. Kultur INS-1-celler på # 1,5 18 mm runda täck förbelagda med 30 mikrogram / ml fibronektin till 50-70% konfluens enligt standard INS-1 cellodlingsprotokoll 38,39. Transfektera cellerna en dag efter 50 till 70% sammanflytning har uppnåtts.
    3. Transfektera celler med iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 använder liposomer transfektionsreagens enligt tillverkarens protokoll. Efter transfektion tillåta cellerna att växa under 48 h.
    4. På dagen för experimentet, coat täckglas (på en sida) med ~ 0,5-1 ml 500 | ig / ml Poly-D-lysin (PDL; utspädd i dH 2 O) under 1-2 timmar. Låt rinna av PDL genom att placera en mjukpapper påkanten av täckglas. Placera täckglasen på en i förväg kyld (4 ° C) metallplatta för senare användning.
    5. Tvätta i förväg transfekterade INS-1-celler som växer på täckglas med ~ 0,5-1 ml iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 1 mM EGTA. Upprepa tvätta tre gånger och dränera PBS.
    6. Placera täckglas med odlade celler (cellsidan nedåt) på PDL-belagda täck på en pre-kyld metallplatta med en pincett. Lämnar plattan i kylskåp (4 ° C) under 7 - 10 min för att tillåta cellerna att fästa till PDL-belagda täck (Figur 2).
      OBS: Inkubationstiden bör vara inom intervallet 7-10 min för bättre vidhäftning av cellerna till PDL-belagda ytan. Kylskåpet miljön är torr och inkubering bör inte vara för lång.
    7. Avlägsna metallplattan från kylskåpet. Dra försiktigt av täck innehåller pre-transfekterade celler med användning av pincett. Detta ger ett tunt skikt av cellmembranarket påPDL-belagda täck. Försiktigt tvätta membran ark med ~ 0,5-1 ml iskall PBS och sedan fixa med ~ 0,5-1 ml iskall 4% paraformaldehyd (PFA) + 0,2% glutaraldehyd (GA) i PBS under 15 minuter vid 4 ° C.
      Varning: Paraformaldehyd och glutaraldehyd är giftiga. Hantera dem på ett dragskåp med hud och ögonskydd.
    8. Efter fixering, bild membran ark omedelbart (se avsnitt 3) eller förvara i ~ 0,5-1 ml PBS vid 4 ° C.
      OBS: Efter fixering membranarket, blir det ingen jämviktsbindning av PH-sonder från cytosolen till PI (4,5) P2. De bundna PH sonder kommer gradvis dissociera från membranarket och diffundera in i lösningen (även om det kan ta dagar eller veckor). Därför rekommenderas det att bilden de fasta proverna direkt efter provberedning.
  2. Förbered membranblad för PI (4,5) P2 särskild märkning antikropp
    1. Kultur INS-1-celler på # 1,5, 18 mm runda Täckglas i förväg belagda med 30 &# 181; g / ml fibronektin till 50% -70% konfluens. Transfektera celler med DNA-plasmid nästa dag såsom beskrivs i steg 1.1.3.
    2. Upprepa steg från 1.1.4 till 1.1.7 som beskrivits ovan.
      OBS: Utför följande procedurer vid 4 ° C.
    3. Tvätta täckglasen som innehåller fasta PM arken tre gånger med ~ 0,5-1 ml iskall PBS innehållande 50 mM NH4CI. Släcka arken med ~ 0,5-1 ml 0,1% natriumborhydrid i PBS under 7 min och tvätta med ~ 0,5-1 ml PBS (utan 50 mM NH4CI).
    4. Blockera proverna med ~ 0,5 - 1 ml blockeringslösning (PBS-lösning innehållande 5% (volym / volym) normalt getserum, 5% (volym / volym) bovint serumalbumin och 50 mM NH4CI) under 45 min. Då, inkubera med ~ 0,5 - 1 ml primär PI (4,5) P2-antikropp (1: 300 spädning) i blockeringslösning under 1 timme. Tvätta tre gånger (10 min varje gång) med ~ 0,5 - 1 ml PBS innehållande 50 mM NH4CI.
    5. Inkubera proverna med ~ 0,5 - 1 ml sekundär F (ab ') 2-get-anti-musantikropp konjugerad med fluoroforer (1: 300) i blockeringsbuffert under 1 timme. Tvätta tre gånger med ~ 0,5-1 ml PBS.
    6. Post-fix prover med 4% PFA + 0,2% GA under 15 minuter, tvätta sedan proverna tre gånger med PBS (7 min varje gång). Fortsätt till Avsnitt 3 för avbildning eller lagra i ~ 0,5 ~ 1 ml PBS vid 4 ° C för senare användning.
      OBS: Förbered prover vid 4 ° C. Använd 4% PFA + 0,2% GA fixativ för att bevara den fysiologiska fördelningen av fosfoinositider i PM. RT beredning eller fixering med 4% PFA ensamt kan orsaka betydande artefakter (Figur 4).

2. Cell Culture Förberedelse för Live-cell imaging med mEOS3.1-PH PLC δ1

  1. Förbereda DNA-plasmid som kodar för mEOS3.1-PH PLC δ1 såsom beskrivits tidigare 23.
  2. Kultur INS-1-celler på # 1,5 18 mm runda täck förbelagt med 30 mikrogram / ml fibronektin tills de når 50% -70% confluency enligt standard INS-1 cellodlingsprotokoll 38,39.
  3. Följande dag transfektera INS-1-celler med den mEOS3.1-PH PLC δ1 DNA-plasmid med användning av liposom transfektionsreagens efter tillverkarens protokoll. Inkubera under 48 h före avbildning.

3. PALM Image Acquisition av membranark och levande celler

  1. PALM bild förvärv av membran ark
    OBS: Här, en total inre reflektion fluorescens (TIRF) mikroskop baserad SMLM systemet (100X olja, APO, NA = 1,49, WD 0,12 mm) 23 används för alla bildtagning.
    1. Innan avbildning, späd 1 pl fluorescent pärla lösning i 10 ml PBS + 50 mM MgCl2. Tillsätt 200 pl utspädda lösningen i avbildning kammare som innehåller cellprover (från steg 1.1.8 / 1.2.6) under 10 minuter. Då, tvätta med PBS tre gånger.
    2. Starta PALM avbildningssystemet. I den tillhörande bildbehandlingsprogram, välj "iRFP kanal &# 34; knappen (642 nm laser excitation, 700/75 nm emission). Hitta cellmembranet uttrycker PH sonder i iRFP kanalen.
      OBS: Membranet ark bör ha en självlysande pärla i närheten. Detta krävs för drift korrigering senare.
    3. Använd "Capture" -knappen för att samla in en konventionell TIRF bild av cellmembranet i iRFP kanal som en referens för framtida bildrekonstruktion. Ställ en normal TIRF vinkel (dvs efter att ha nått den kritiska vinkeln, vrid ytterligare 1,5 grader) genom att skriva in 2140 i TIRF vinkel för avbildning. Använd den här vinkel för alla steg, om inte annat anges.
      OBS: I TIRF system som beskrivs här, är 3500 den vertikala upp vinkeln, 2200 är TIRF kritiska vinkeln, och 2140 är den normala TIRF vinkel, vilket är 1,5 grad mer efter TIRF kritiska vinkeln. Den smala TIRF vinkel nämns nedan i 3.2.3 är 2120, vilket är en annan två grad efter att ha nått TIRF kritiska vinkeln.
    4. Växla till PAmCherry1 kanal genom att klicka på the RFP kanalknappen (561 nm excitation, 600/50 nm emissionsfilter). Justera rullningslisten i "AOTF" pad hela vägen till höger för att få full effekt belysning av 561 nm laser för 10-20 sekunder för att bleka bakgrunden membran fluorescens.
    5. Ställ in optimal kamerans inställningar (2x2 binning) i "Format" -fliken och den snabba förvärvsprotokollet i "ND sekvens förvärv" -fliken (typiskt 10,000-40,000 bilder vid 20 Hz).
    6. Starta förvärv av PAmCherry1 bilder (561 nm laser med full effekt, 50 msek / ram) med samtidig 405 nm laseraktivering på en låg nivå (0,1% - 1%) genom att klicka på "Kör nu" -knappen. Justera intensiteten hos 405 nm laser så att rumsligt isolerade enskilda punkter i varje ram är lätta att identifiera.
      OBS: Antalet aktiverbara PAmCherry1 molekyler minskar gradvis under förvärv. 405 nm laser intensitet bör gradvis ökas för att hålla den optimala densiteten hos enskilda molekyl signaler i varjeram.
    7. Fortsätt att förvärva bilder tills ingen PAmCherry1 enda molekyl signalen aktiveras.
  2. PALM avbildning i levande celler
    1. Innan avbildning, utspädd fluorescerande pärlor in i avbildningskammaren under 10 minuter såsom beskrivs i steg 3.1.1. Starta sedan PALM avbildning genom att öppna den tillhörande bildprogram.
      OBS: Använd en magnetisk snabbkoppling avbildning kammare för levande cell imaging. Behåll i mitten av bildfältet vid 35 ° C med en temperaturregulator under konstant perfusion med extracellulärt buffert (extracellulära lösning: 135 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 2,6 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2, 3 mM glukos och 20 mM HEPES, pH = 7,3).
    2. Välj GFP kanalknappen (525/50 nm emission). Identifiera cellmembranet som uttrycker fluorescerande prober baserade på grönt fluorescerande från mEOS3 enligt 488 nm laser excitation. Se till att fluorescerande pärlor i närheten ingår också under avbildning eftersom det krävs senare för offline drift korrigering.
    3. Klicka på "Capture" -knappen för att samla in en TIRF bild av cellmembranet i mEOS3 (grön) kanal som en referensbild. Använd en ytlig evanescent våg excitation belysning (efter att ha nått den kritiska vinkeln, vrid ytterligare 2 grader) genom att skriva in 2120 i TIRF vinkel för levande cell imaging.
      OBS: Detta minimerar fluorescensen från den obundna mEos3-PH i cytosolen i anslutning till plasmamembranet.
    4. Växla till "RFP kanal" knappen (561 nm excitation, 600/50 nm emission). Använd full effekt 561 nm laser för att bleka bakgrundsfluorescens av membranblad för 10 ~ 20 sekunder med rullningslisten i "AOTF pad" (se 3.1.4).
    5. Börja bild förvärv genom att klicka på "Kör nu" -knappen i den röda kanalen (561 nm full effekt, inställd på 10 ms / ram i "kameran" inställning flik) med samtidig 405 nm laseraktivering. Justera 405 nm laser intensitet för att aktivera rumsligt separerade punkteri varje ram.
      OBS: Som förvärvsfortskrider, un-konverterade mEOS3.1-PH PLC δ1 molekyl nummer minskar långsamt. Gradvis öka 405 nm lasereffekt för att optimera enda molekyl signalen. Den scanning längd beror på den experimentella ändamål. Hämta bilder kontinuerligt under 5 minuter under normala förhållanden. Om en längre förvärv krävs samla flera bildstaplar i stället för en enda stor bild stack. Filstorleken för varje bild stack bör inte överstiga 4 GB eller det kommer att påverka programvara analys senare.

4. SMLM bildbehandling och återuppbyggnad

  1. Överför bildfiler (.tif bildstaplar) till en bildanalys station. Starta bildåteruppbyggnadsprogrammet (anpassad skrivna) i Matlab som beskrivits tidigare 37 och ladda bildstapel genom att klicka på "File" fliken i huvudmenyn och sedan "öppna", sedan "ny fil".
  2. Identifiera och locaLize individuella molekylära händelser från varje ram. Ställ filtrering intensitetströskel med ett gränsvärde (1-10) i "wavelet". Kontrollera de optimala parameterinställningar för punkt upptäckt visuellt innan återuppbyggnaden. Gå sedan till "PALM" -fliken och klicka på "ett steg" för att starta bildrekonstruktion.
    OBS: Intensitet tröskeln för punkt upptäckt är godtycklig och beror på personlig erfarenhet. Flera försök kan krävas för att generera en optimal detekteringströskel som varken tar upp alltför många okvalificerade (dim) poäng eller filtrerar ut för många kvalificerade (ljus) poäng. Justera andra parametrar för att optimera dataanalys. Här är stadsdel avstånd (fluorescens punkter i grann ramar inom ett avstånd kombineras) anges som 65 nm (1/2 pixelbredd) och monteras som en enda molekyl. Gap ramar (enskilda molekyler händelser som inträffat inom dessa ramar och grannskap avstånd kombinerades och monteras som en enda molekyl händelse) ärin som 26 bildrutor (1,3 sek) för PAmCherry1 avbildning 40. Justera dessa parametrar i enlighet med egenskaperna hos enskilda molekyl prober och förvärvstakt för att undvika över räknar 40 i SMLM. Applicera driftkorrigering med fluorescerande pärlor under rekonstruktioner.
    1. För att avbilda de fasta membran ark märkta av iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1, rekonstruera hela bildstaplar från samma membranarket till en enda super upplösning 37.
    2. För levande cellprover märkta av mEOS3.1-PH PLC δ1, separera hela bildstapel i flera mindre högar av 1000 ramar, så att 1000-rad-frame stack rekonstrueras som en enda super-upplösning, som har en tidsupplösning av 10 sek. I slutändan, kombinera alla tidsseriebilder de i den slutliga tidsserier stack 23.
      OBS: I live-cell PALM imaging, kan ett litet antal aktiverade prober flytta eller dissocierafrån PI (4,5) P2 i PM före blekningen. Redogöra för översampling av sonderna, kombinera enskilda molekyler signaler i grann ramar inom 130 nm (i stället för 65 nm) i en enskild händelse utsläpp under bildanalys.
  3. Efter att ha fått de rekonstruerade bilderna, utföra ytterligare bildanalys med specialskrivet program i Matlab för att kvantifiera molekyl densitet, mikro-domän densitet / storlek, och klusteranalys med par-korrelation 41.

Representative Results

Lokaliseringen osäkerhet (σ) av vår super-upplösning systemet är 14,73 nm 23. Direkta jämförelser mellan TIRF och PALM bilder visade en signifikant förbättring av rumslig upplösning. Figur 3A-B visar representativa PI (4,5) P 2 TIRF bilder märkta med PI (4,5) P 2-antikropp och iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 i typiska membranblad och levande celler. Bilderna med konventionell TIRF mikroskopi i membran ark är anmärkningsvärt liknar dem i intakta levande celler märkta med förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) taggade PH-domäner (EGFP-PH PLCδ1) (Figur 3C). Alla prover uppvisade en jämn fördelning av prober. I motsats, icke-optimal fixering av proverna resulterade i skarp tät PI (4,5) P 2 kluster och en minskning i signalintensiteten (Fig 4). Under optimala fixeringsbetingelser, than super-högupplösta bilder av PI (4,5) P2 i fixerade celler (figur 5) visade en homogen fördelning av prober i en betydande del av PM som endast har begränsade gradienter koncentrations. Vissa membranplåster berikade med PI (4,5) P2 prober glest fördelade och hade olika storlekar. Levande cell PALM bilder visar en liknande rumslig fördelning som fixerade celler (Figur 6). Detaljerad analys av PI (4,5) P 2 signaler över tiden resulterar i snabba dynamik i lokala områden, utan betydande förändringar av sitt överflöd i stora områden.

Figur 1
Figur 1. System för fluorescerande sönder som används i denna studie. (AB) iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 prob som användes i de fasta experiment membranark. Under konventionell TIRF avbildning (A), en 640 nm laser används för att excitera iRFP (Ex: 692 nm; Em: 713 nm). TIRF bild tagen i detta tillstånd tjänar som en TIRF referensbild för superupplösning erhålls genom PALM imaging (B). En 405 nm laser används för att fotoaktivera PAmCherry1 fluorofor och en 561 nm laser används för att excitera PAmCherry1 (Ex: 564 nm; Em: 595 nm) för PALM avbildning. (CD) mEos3.1-PH PLCδ1 sond som används i de levande cellförsök. (C) Vid konventionell TIRF avbildning, är en 488 nm laser används för att excitera mEOS3.1 (Ex: 506 nm; Em: 519 nm). (D) Efter photoconversion av en 405 nm laser, vänder mEos3.1 i den röda formen (Ex: 573 nm; Em: 584 nm). Och en 561 nm laser används för PALM förvärv Klicka här för att se en större version av denna siffra.

s / ftp_upload / 54466 / 54466fig2.jpg "/>
Figur 2. System för beredning membranarket från INS-1-celler. (A) Placera täckglas med odlade celler som vetter ned på en PDL-belagd täckglas och vänta på 7 ~ 10 min vid 4 ° C för att tillåta cellbindning till PDL- belagd täck. (B) Skala bort den övre täck med pincett och fixera membranet blad som bifogas PDL förbelagda täck. (C) Bild proven med TIRFM och PALM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. PI (4,5) P2 rumslig organisation är likartad mellan membran lakan och intakta levande celler under konventionell TIRF mikroskop. (A) Atypiska TIRF bild av membranark fixerad vid 4 ° C med 4% PFA och 0,2% GA. PI (4,5) P2 märktes med PI (4,5) P2-specifik antikropp. (B) Ett membran ark från INS-1 cell som uttrycker iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1. (C) TIRF bild av två intakta levande celler som uttrycker EGFP-PH PLCδ1 på olika nivåer. Skalstrecken: (A): 3 ^ m; (B) och (C). 5 pm klicka god här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. PI (4,5) P2 spatial organisation i membranark är känslig för vanliga fixeringsförhållanden. (A) membranark fixerad vid 37 ° C med 4% PFA ensamoch märktes med PI (4,5) P2-specifik antikropp (som i figur 3A). (B) Membran ark fäst vid RT med PFA ensam och märkt med PI (4,5) P2-specifik antikropp. Notera att de täta kluster av PI (4,5) P 2 prober är tydligt synliga under TIRF mikroskop, i motsats till de mycket jämnare fluorescens bilder som visas i fig 3A. Skala barer: AB:. 3 mikrometer klicka god här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5. PALM avbildning av PI (4,5) P 2 sonder avslöjar deras nanometerskala distribution i en INS-1 cell PM. (A) iRFP TIRF bild av ett membran ark från en INS-1 cell som uttrycker iRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1. (B) Motsvarande PALM bild av PM i samma region baserat på PAmCherry1 signalrekonstruktion. Notera den homogena PI (4,5) P2 rumsliga fördelning i stora PM regioner och flera PI (4,5) P 2 mikroområden. (C) En förstorad vy av den inramade regionen i (B). Pilar indikerar glest fördelade PM mikrodomäner berikade med PI (4,5) P 2 sonder. Skala barer: A och B: 3 m; C: 500 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6. PALM avbildning i levande INS-1-celler. (A) TIRF bild av PI (4,5) P2 i en levande INS-1 cell som uttrycker mEos3.1-PH PLCδ1. Bilden var snabbt förvärvats i den gröna kanalen innan PALM förvärv (35 ° C). (B) Sekventiell levande cell PALM bilder med 10 sek intervall. Inläggningar visar intensitetsprofiler för den lokala PI (4,5) P2 densitet längs samma raka linje en position vid olika tidpunkter i (B) och (C). Notera sina stora lokala intensitetsförändringar inom 10 sekunder. (D) Tidsförlopp för de genomsnittliga intensitetsförändringar av PI (4,5) P2 i det stora området (box2, 3x3 im) och små cirklar (3, 4, och 5, 500 nm i diameter) i (B) under 5 min av PALM imaging (ram / 10 sek). Notera den snabba intensitet fluktuationer i lokala PI (4,5) P 2 sonder (cirkel 3, 4 och 5) jämfört med mycket små förändringar i det breda området (fält 2). (E) utvidgade PALM bilder av box2 regionen i (B) vid angivna tider. Pilar indikerar PI (4,5) P 2 berikade membran fläckar under physiological villkor. Skala barer: C: 3 pm; E: 500 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

För felsökning, två processer behöver extra uppmärksamhet: membranplåtproduktionen och provfixering. Som beskrivs i protokollet, är viktigt för produktion membranark inkubationstiden av täck i steg 1.1.6. Optimala inkubationstiden under vårt experimentella tillstånd är 7-10 min (fig 2). Längre än 10 min inkubation kommer att producera intakta celler i stället för membran bladen på PDL täck och kortare inkubation kommer att leda till mindre eller ingen membran blad på PDL-belagda täck. Som beskrivs i protokollet, de fixerings och temperatur under fixering är avgörande för att upprätthålla PI (4,5) P2 fördelning i PM. Fixering vid RT eller användning av 4% -PFA ensam kunde snedvrida den normala lipid fördelningen i PM.

Genom att tillämpa PALM mikroskopi till membran Lipid Research, har vi möjlighet att observera nanometerskala distributionen av PI (4,5) P2, en nyckel fosfoinositid som förmedlar mnågra grundläggande cellulära aktiviteter. Denna geografiska fördelningen av PI (4,5) P2 med begränsade gradienter koncentrations i INS-1-celler ger en ram för nytänkande lipid-proteininteraktioner och lokala signaleringshändelser av PI (4,5) P2 i dessa celler. Dessutom kan de metoder som utvecklats i detta arbete också tillämpas på andra membranfosfolipid forskning med lämpliga prober, därmed erbjuda nya verktyg för att studera fosfoinositider i biologiska processer.

Användningen av membran ark i detta arbete förbi två stora problem i fosfolipid morfologiska studier: tvättmedel behandling och potentiell förorenings signal från cytosolen. Rengöringsmedel orsakar ofta klustring och betydande förlust av PM fosfolipid signal. Föroreningen av cytosoliska signal är särskilt problematiskt när det gäller låga förekomst fosfoinositider på PM 23, såsom PI (3,4,5) P3 och PI (3,4) P2. prov membranarket kan circumvent dessa problem utan att signifikant störa konstruktioner i samband med plasmamembranet, såsom kortikal aktin meshwork och clathrin-belagda gropar 42,43. Den relativa homogen fördelning av PI (4,5) P2 i PM är i god överensstämmelse med andra snabba frysning EM studier med användning av GST-PH PLC δ1 prober i fibroblast membranet 44.

Det är viktigt att notera att felaktiga provbearbetningsbetingelser kan generera missvisande resultat. För det första är det viktigt att utföra fixeringsstegen vid en lägre temperatur (4 ° C) och använda fixativ GA för produktion membranark. Såsom visas i fig 3, är varm temperatur och PFA fixering utan GA inte tillräcklig för att fixera fosfoinositider i cellen PM. Detta skulle kunna snedvrida den intakta PI (4,5) P2 distribution och generera skarpa kluster som inte observeras i levande celler under fysiologiska förhållanden. För det andra, användningen av PAmCherry1 somden SMLM sonden, snarare än andra sönder, är avgörande för kvantitativ PALM avbildning. Fördelen med PAmCherry1 ansökan kommer från dess väldefinierade enkla molekylära foto fysiska egenskaper 35,40,45, som ljusstyrka, hög effektivitet fotoaktivering och mest av allt, mycket begränsad foto blinka. Dessa egenskaper gör det möjligt för oss att eliminera potentiella kluster artefakter från foto blinka och kvantitativt analysera den molekylära tätheten av membran PI (4,5) P2.

Detta tillvägagångssätt har också sina begränsningar. Först kan membranet räkningsmetoden som används i denna studie inte helt härma den fysiologiska fördelningen av PI (4,5) P2 eftersom cellen bryts innan avbildning. Emellertid visar vår live PALM avbildning liknande relativt homogen fördelning av PI (4,5) P2, stödjer resultaten som observerats med prover membran ark. För det andra, som vi diskuterade i vårt tidigare arbete 23, kräver SMLM imaging kompetens och extra påsamhet att undvika avbildningsartefakter som kan uppstå från olika processer, inklusive sonderna som används, provberedning och fixering, bild sampling och rekonstruktion. Slutligen, även om PH-domänen baserade prober och antikroppar har använts i stor utsträckning i fosfoinositid studier 46,47 är det fortfarande möjligt att inte alla PI (4,5) P2 i membranet kan detekteras genom denna metod. Till exempel kan PI (4,5) P2 bunden av andra endogena proteiner inte vara tillgängliga för PH sönder eller antikroppar, och detta kan orsaka en underskattning av PI (4,5) P2 på grund av utrymmet hinder av sond sig. Ett alternativt sätt att märkning PI (4,5) P2 skulle användning av Top-Fluor PI (4,5) P2 48, en pre-märkt PI (4,5) P2-analog med en modifiering på svansen på original PI (4,5) P2. Emellertid kan den omvandlas snabbt till andra fosfoinositid subtyper av snabb levande cell metabolism eftersom dess inositolringen är samma som endogenous PI (4,5) P2. Detta väcker oro om detta i förväg märkt PI (4,5) P2 analog i levande celler troget kan representera PI (4,5) P2 snarare än dess metaboliska produkter. Därför, trots vissa begränsningar, PH domänbaserade prober är fortfarande bland de bästa sonder som har använts i stor utsträckning för att övervaka PI (4,5) P2 distribution och dynamik på PM av celler.

Den framtida tillämpningen av denna metod kan utvidgas till andra fosfoinositid studier, till exempel PI (3,4,5) P3 och PI (3,4) P2. Sammanfattningsvis, det nya SMLM metod som används här öppnar nya vägar för att studera fosfoinositid i celler. Använda PI (4,5) P2 som ett exempel, visar vi de unika egenskaperna hos PALM avbildning i morfologiska och kvantitativ studie av cellmembranmolekyler, liksom dess nackdelar. Detta tillvägagångssätt kan anpassas till andra molekyler av intresse och kommer att ha breda tillämpningar inom cellbiologi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope Nikon Ti-U
sCMOS camera Andor Neo
Spinning disk Yokogawa CSU X-1, 10,000 rpm 
High Power Monolithic Laser Combiner SP with 405, 488, 561 and 642 nm lasers. Agilent MLC400 laser original powers & powers at the end of optical fiber)
405 nm: 15 mW & 13 mW;
488 nm: 45 mW & 42 mW;
561 nm: 45 mW & 40 mW;
640 nm: 35 mW & 16 mW.
100X Objective Nikon APO 100X Oil, NA 1.49, WD 0.12 mm
Nikon acquisition and analysis software (NIS Element) Nikon
Matlab MathWorks
Coverslip Warner 64-0714 Round 18 mm coverslip, #1.5
Fibronectin Millipore FC010-5MG
Lipofectamin 3000 (transfection reagent) Invitrogen L3000-008
Glutaraldehyde Electron Microscopy Science #16120
PI(4,5)P2 1st antibody Santa Cruz sc-53412
secondary antibody  F(ab’)2-goat-anti-mouse Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21237
Tetraspeck beads Invitrogen T7279
magnetic quick release imaging chamber  Warner Instruments Cat#641994
temperature controller Warner Instruments TC-344C
Poly-D-Lysine Sigma P6407
Phosphate buffer saline Sigma P4417-100TAB
EGTA Sigma 3780
NH4Cl Sigma A0171
Goat serum Sigma G9023
bovine serum albumin Sigma A7906
NaCl Sigma S5886
KCl Sigma P5405
CaCl2•2H2O Sigma 223506
MgCl2•6H2O Sigma M9272
Glucose Sigma G7021
HEPES Sigma H4034
Paraformaldyhyde Sigma P6148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443, 651-657 (2006).
  2. Hammond, G. R. V., et al. PI4P And PI(4,5)P(2) Are Essential But Independent Lipid Determinants Of Membrane Identity. Science. 337, New York, N.Y. 727-730 (2012).
  3. Nakatsu, F., et al. PtdIns4P synthesis by PI4KIIIalpha at the plasma membrane and its impact on plasma membrane identity. J Cell Biol. 199, 1003-1016 (2012).
  4. Cantley, L. C. The phosphoinositide 3-kinase pathway. Science. 296, 1655-1657 (2002).
  5. Czech, M. P. Dynamics of phosphoinositides in membrane retrieval and insertion. Annu Rev Physiol. 65, 791-815 (2003).
  6. Spira, F., et al. Patchwork organization of the yeast plasma membrane into numerous coexisting domains. Nat Cell Biol. 14, 640-648 (2012).
  7. Barg, S., Knowles, M. K., Chen, X., Midorikawa, M., Almers, W. Syntaxin clusters assemble reversibly at sites of secretory granules in live cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 20804-20809 (2010).
  8. Sieber, J. J., et al. Anatomy and dynamics of a supramolecular membrane protein cluster. Science. 317, 1072-1076 (2007).
  9. Knowles, M. K., et al. Single secretory granules of live cells recruit syntaxin-1 and synaptosomal associated protein 25 (SNAP-25) in large copy numbers. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 20810-20815 (2010).
  10. Milosevic, I., et al. Plasmalemmal phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate level regulates the releasable vesicle pool size in chromaffin cells. J Neurosci. 25, 2557-2565 (2005).
  11. van Rheenen, J., Jalink, K. Agonist-induced PIP(2) hydrolysis inhibits cortical actin dynamics: regulation at a global but not at a micrometer scale. Mol Biol Cell. 13 (2), 3257-3267 (2002).
  12. Hammond, G., Schiavo, G., Irvine, R. Immunocytochemical techniques reveal multiple, distinct cellular pools of PtdIns4P and PtdIns (4, 5) P2. Biochem J. 422, 23-35 (2009).
  13. Huang, S., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate-rich plasma membrane patches organize active zones of endocytosis and ruffling in cultured adipocytes. Mol Cell Biol. 24, 9102-9123 (2004).
  14. James, D. J., Khodthong, C., Kowalchyk, J. A., Martin, T. F. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate regulates SNARE-dependent membrane fusion. J Cell Biol. 182, 355-366 (2008).
  15. Laux, T., et al. GAP43, MARCKS, CAP23 modulate PI(4,5)P(2) at plasmalemmal rafts, and regulate cell cortex actin dynamics through a common mechanism. J Cell Biol. 149, 1455-1472 (2000).
  16. Aoyagi, K., et al. The activation of exocytotic sites by the formation of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate microdomains at syntaxin clusters. J Biol Chem. 280, 17346-17352 (2005).
  17. Kabachinski, G., Yamaga, M., Kielar-Grevstad, D. M., Bruinsma, S., Martin, T. F. CAPS and Munc13 utilize distinct PIP2-linked mechanisms to promote vesicle exocytosis. Mol Biol Cell. 25, 508-521 (2014).
  18. Wang, J., Richards, D. A. Segregation of PIP2 and PIP3 into distinct nanoscale regions within the plasma membrane. Biol Open. 1, 857-862 (2012).
  19. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19, 780-782 (1994).
  20. van den Bogaart, G., et al. Membrane protein sequestering by ionic protein-lipid interactions. Nature. 479, 552-555 (2011).
  21. van Rheenen, J., Achame, E. M., Janssen, H., Calafat, J., Jalink, K. PIP2 signaling in lipid domains: a critical re-evaluation. Embo J. 24, 1664-1673 (2005).
  22. Sato, K., et al. Differential requirements for clathrin in receptor-mediated endocytosis and maintenance of synaptic vesicle pools. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 1139-1144 (2009).
  23. Ji, C., Zhang, Y., Xu, P., Xu, T., Lou, X. Nanoscale Landscape of Phosphoinositides Revealed by Specific Pleckstrin Homology (PH) Domains Using Single-molecule Superresolution Imaging in the Plasma Membrane. J of Biol Chem. 290, 26978-26993 (2015).
  24. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  25. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
  26. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
  27. Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, spectrin, and associated proteins form a periodic cytoskeletal structure in axons. Science. 339, 452-456 (2013).
  28. Wombacher, R., et al. Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates. Nat Methods. 7, 717-719 (2010).
  29. Szymborska, A., et al. Nuclear pore scaffold structure analyzed by super-resolution microscopy and particle averaging. Science. 341, 655-658 (2013).
  30. Pertsinidis, A., et al. Ultrahigh-resolution imaging reveals formation of neuronal SNARE/Munc18 complexes in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 2812-2820 (2013).
  31. Shim, S. -H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proc Natl Acad Sci. 109, 13978-13983 (2012).
  32. Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
  33. Balla, T., Várnai, P. Visualization of Cellular Phosphoinositide Pools with GFP-Fused Protein-Domains. Curr Protoc Cell Biol. 24, 24 (2009).
  34. Xu, C., Watras, J., Loew, L. M. Kinetic analysis of receptor-activated phosphoinositide turnover. J Cell Biol. 161, 779-791 (2003).
  35. Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nat Methods. 6, 153-159 (2009).
  36. Filonov, G. S., et al. Bright and stable near infra-red fluorescent protein for in vivo imaging. Nature Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
  37. Zhang, M., et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins. Nat Methods. 9, 727-729 (2012).
  38. Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49, 424-430 (2000).
  39. Dyachok, O., Isakov, Y., Sågetorp, J., Tengholm, A. Oscillations of cyclic AMP in hormone-stimulated insulin-secreting β-cells. Nature. 439, 349-352 (2006).
  40. Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 18519-18524 (2013).
  41. Sengupta, P., et al. Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis. Nat Methods. 8, 969-975 (2011).
  42. Morone, N., et al. Three-dimensional reconstruction of the membrane skeleton at the plasma membrane interface by electron tomography. J Cell Biol. 174, 851-862 (2006).
  43. Peters, K. R., Carley, W. W., Palade, G. E. Endothelial plasmalemmal vesicles have a characteristic striped bipolar surface structure. J Cell Biol. 101, 2233-2238 (1985).
  44. Fujita, A., Cheng, J., Tauchi-Sato, K., Takenawa, T., Fujimoto, T. A distinct pool of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in caveolae revealed by a nanoscale labeling technique. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 9256-9261 (2009).
  45. Durisic, N., Laparra-Cuervo, L., Sandoval-Álvarez, Á, Borbely, J. S., Lakadamyali, M. Single-molecule evaluation of fluorescent protein photoactivation efficiency using an in vivo nanotemplate. Nat Methods. 11, 156-162 (2014).
  46. Thomas, C. L., Steel, J., Prestwich, G. D., Schiavo, G. Generation of phosphatidylinositol-specific antibodies and their characterization. Biochem Soc Trans. 27, 648-652 (1999).
  47. Várnai, P., Balla, T. Live cell imaging of phosphoinositides with expressed inositide binding protein domains. Methods. 46, 167-176 (2008).
  48. Honigmann, A., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate clusters act as molecular beacons for vesicle recruitment. Nature Struct Mol Biol. 20, 679-686 (2013).

Tags

Biokemi Super-upplösning avbildning PALM fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat (PI (4,5) P2) cellmembranarket fosfoinositid betaceller
Enda molekyl Super-upplösning avbildning av Fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat i plasmamembranet med nya fluorescerande Probes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ji, C., Lou, X. Single-molecule… More

Ji, C., Lou, X. Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes. J. Vis. Exp. (116), e54466, doi:10.3791/54466 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter