Summary
PI (4,5) P2 regelt diverse cellulaire functies, maar de nanoschaal organisatie in de cel plasmamembraan wordt slecht begrepen. Etikettering PI (4,5) P2 met een dubbele-color fluorescent probe gefuseerd met het Pleckstrin homologie domein beschrijven we een nieuwe benadering voor het bestuderen PI (4,5) P2 ruimtelijke verdeling in het plasmamembraan op nanometerschaal .
Introduction
Phosphoinositides bijdragen tot een klein deel van de totale membraanlipiden, maar spelen cruciale rol in verschillende cellulaire processen. Zij omvatten zeven leden afkomstig zijn van omkeerbare fosforylering of defosforylering van de inositol ringen op de 3 e, 4 e en 5 e positie 1. Fosfatidylinositol-4-fosfaat (PI4P) en fosfatidylinositol-4,5-bisfosfaat (PI (4,5) P2) zijn twee belangrijke fosfoinositiden die relatief onafhankelijk functioneren als de determinant van lipiden celplasmamembraan (PM) 2,3. Fosfatidylinositol (3,4,5) -trisphosphate (PIP 3) veel minder overvloedig dan PI4P en PI (4,5) P2, maar het heeft unieke functies in verschillende cellulaire processen waaronder kanker 4 en 5 diabetes. Deze lipiden complexe moleculaire interacties met hun effectoren en vele andere proteïnen. Daarom is het cruciaal om de ruimtelijke organisatie van deze pho begrijpensphoinositides in de PM op nanometerschaal.
Steeds meer bewijs heeft aangetoond dat eiwitcomplexen of molecuul clusters in de beperkte PM gebieden signalering hotspots 6 kan dienen. Bijvoorbeeld, Syntaxin 1a, een belangrijk eiwit dat membraanfusie 7-9 regelt, geeft de cluster organisatie in de PM. Onderscheiden van de consensus van de cluster organisatie van Syntaxin 1a, de ruimtelijke verdeling van phosphoinositides in de PM controversieel. PI (4,5) P2 distributie patronen variëren van uniforme 10-12, grote stukken 13,14, clusters 14-18, afhankelijk van celtypen en experimentele methoden dicht. De ruimtelijke organisatie van PI (4,5) P2 bij hogere resolutie is inconsistent. Een onderzoek waarbij gestimuleerde emissie-depletie (STED) microscopie 19 heeft een groot aantal dichte PI (4,5) P2 nano-clusters geopenbaard (~ 73 nm in diameter) in de PM vellen PC-12 cellen 20 21,22, een benadering die de intacte PM structuur van levende cellen veel beter dan chemische fixatie behouden blijft. De laatste vertoonde verschillende pools van PI (4,5) P2; relatief geconcentreerd PI (4,5) P2 in caveolae en gecoate pits evenals uniforme verdeling op het vlakke gebied PM. Bovendien kan nanoschaal PI (4,5) P2 organisatie membraanlagen verschillen levende en gefixeerde cellen. Onze recente werk onderzocht dit probleem in zowel vaste en live INS-1-cellen met behulp van single-molecule lokalisatie microscopie (SMLM) 23.
SMLM is gebaseerd op stochastisch inschakelen slechts een klein deel van fluoroforen op een gegeven moment zodat afzonderlijke fluoroforen kunnen worden gelokaliseerd met hoge precisie. Veel superresolutie imaging benaderingen ontwikkeld met vergelijkbare beginselen op de diffractie limiet van conventionele lichtmicroscopie overtreffen dergelijkes fotoactivatie lokalisatie microscopie (PALM) 24, fluorescentie fotoactivatie lokalisatie microscopie (FPALM) 25, stochastische optische reconstructie microscopie (STORM) 26,27 en directe STORM (dSTORM) 28. Met foto-schakelbare of fotoactiveerbare fluoroforen (kleurstoffen of fluorescerende eiwitten), SMLM technieken kunnen wetenschappers het biologische structuren op nanometer resolutie 24,29,30 met video-tarief in levende cellen 31,32.
Gebruik PI (4,5) P2 als voorbeeld stelden we de SMLM benadering nanoschaal verdeling van phosphoinositides op de PM bestuderen. Het PH domein van PLCδ1 (fosfolipase C δ1) dat specifiek bindt PI (4,5) P2 een gevestigde probe voor beeldvorming PI (4,5) P2 subcellulaire distributie en dynamica 33,34 in de PM . We hebben genetisch gelabeld dit domein met twee fluorescerende eiwitten, PAmCherry1 35 en 36 iRFP PLCδ1) te produceren (Figuur 1A-B). PAmCherry1 dient als de fotoactiveerbare probe van PH-domein voor PALM en iRFP dient als een algemene indicator om getransfecteerde cellen te identificeren voordat PALM overname . We passen deze dual-color fluorescente probe voor SMLM beeldvorming in het vaste membraan vellen. Voor live PALM imaging, we hebben mEOS3 37 in plaats van PAmCherry1 aan de PH PLCδ1 domein naar het mEOS3.1-PH PLCδ1 probe voor het beter foton efficiency en helderheid (figuur 1C-D) te genereren.
SMLM beeldvorming met deze nieuwe probes in de PM van insuline uitscheidende INS-1-cellen 38 heeft homogene kenmerken van PI (4,5) P2 in de meeste PM regio's en geconcentreerd PI (4,5) P2 onbedekt microdomeinen dat dun zijn vermengd in de flat PM en sommige filopodia-achtige structuren 23. Dan eennoScale verdeling van de PI (4,5) P2 levert een structurele basis voor heroverwegen hoe het functioneert in levende cellen.
Protocol
1. Membraan Sheet Voorbereiding en Fixation
- Bereid membraan platen gemerkt met iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1
- Bereid de DNA plasmide coderend iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 23 met behulp van standaard moleculair biologische technieken.
- Cultuur INS-1 cellen op # 18 1,5 mm rond dekglaasjes vooraf bekleed met 30 ug / ml fibronectine tot 50-70% confluentie volgens standaard INS-1 celkweek protocollen 38,39. Transfecteren de cellen een dag nadat 50 tot 70% confluentie bereikt.
- Transfecteren cellen met iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 behulp liposoom transfectie reagens volgende protocollen van de fabrikant. Na transfectie laat de cellen groeien gedurende 48 uur.
- Op de dag van het experiment, laag dekglaasjes (aan één kant) met ~ 0,5-1 ml 500 ug / ml Poly-D-Lysine (PDL, verdund in dH 2 O) gedurende 1-2 uur. uitlekken dan PDL door het plaatsen van een papieren zakdoekje opde rand van het dekglaasje. Plaats de dekglaasjes van een vooraf gekoelde (4 ° C) metaalplaat voor later gebruik.
- Wassen pre-getransfecteerde INS-1 cellen die groeien op dekglaasjes met ~ 0,5-1 ml ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bevattende 1 mM EGTA. Herhaal het wassen drie keer en afvoer PBS.
- Plaats de dekglaasjes met gekweekte cellen (cell-zijde naar beneden) op de PDL-gecoate dekglaasjes van een vooraf gekoelde metalen plaat met een pincet. Laat de plaat in de koelkast (4 ° C) gedurende 7-10 minuten om cellen te hechten aan de PDL-gecoate dekglaasjes (figuur 2).
OPMERKING: De incubatietijd dient in het traject van 7-10 minuten voor betere hechting van de cellen aan de PDL-gecoate oppervlak. De koelkast milieu droog en incubatie moet niet te lang zijn. - Verwijder de metalen plaat uit de koelkast. Haal voorzichtig uit het dekglaasje met de pre-getransfecteerde cellen met een pincet. Dit levert een dunne laag celmembraan blad op dePDL-gecoate dekglaasje. Voorzichtig te wassen de membraanlagen met ~ 0,5-1 ml ijskoude PBS en bevestig met ~ 0,5-1 ml ijskoude 4% paraformaldehyde (PFA) + 0,2% glutaaraldehyd (GA) in PBS gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
Let op: Paraformaldehyde en glutaaraldehyde zijn giftig. Behandel ze in een zuurkast met de huid en oogbescherming. - Na fixatie, beeld het membraan vellen onmiddellijk (zie punt 3) of op te slaan in ~ 0,5-1 ml PBS bij 4 ° C.
LET OP: Na de vaststelling van het membraan plaat, zal er geen evenwicht binding van PH probes van cytosol naar PI (4,5) P2 zijn. De gebonden PH probes geleidelijk losmaken van de membraanplaat en diffunderen in de oplossing (hoewel het dagen kan duren voordat weken). Daarom is het raadzaam om de afbeelding van de vaste monsters direct na de bereiding van de monsters.
- Bereid membraan platen voor PI (4,5) P2 specifiek antilichaam labeling
- Cultuur INS-1 cellen op # 1,5, 18 mm rond dekglaasjes vooraf gecoat met 30 en# 181; g / ml fibronectine tot 50% -70% confluentie. Transfecteren van cellen met plasmide-DNA de volgende dag zoals beschreven in stap 1.1.3.
- Herhaal de stappen van 1.1.4 naar 1.1.7 zoals hierboven beschreven.
OPMERKING: Voer de volgende procedures bij 4 ° C. - Was de dekglaasjes met vaste PM platen driemaal met ~ 0,5-1 ml ijskoude PBS dat 50 mM NH4 Cl. Quench de platen met ~ 0,5-1 ml 0,1% natriumboorhydride in PBS gedurende 7 min, en was met ~ 0,5-1 ml PBS (zonder 50 mM NH4 Cl).
- Blokkeer de monsters met ~ 0,5-1 ml blokkeeroplossing (PBS bevattende 5% (v / v) normaal geit serum, 5% (v / v) runderserumalbumine en 50 mM NH4 Cl) gedurende 45 min. Vervolgens incuberen met ~ 0,5-1 ml primaire PI (4,5) P2-antilichaam (1: 300 verdunning) in blokkeeroplossing gedurende 1 uur. Was driemaal (10 minuten per keer) met ~ 0,5-1 ml PBS dat 50 mM NH4 Cl.
- Incubeer monsters met ~ 0,5-1 ml secundair F (ab ') 2-geit-anti-muisantilichaam geconjugeerd met fluoroforen (1: 300) in blokkeerbuffer gedurende 1 uur. Was driemaal met ~ 0,5-1 ml PBS.
- Post-fix monsters met 4% PFA + 0,2% GA van 15 minuten, daarna wassen monsters driemaal met PBS (7 min per keer). Ga verder sectie 3 voor imaging of op te slaan in ~ 0.5 ~ 1 ml PBS bij 4 ° C voor later gebruik.
OPMERKING: Bereid monsters bij 4 ° C. Met 4% PFA + 0,2% GA fixatief om de fysiologische verdeling van phosphoinositides in de PM behouden. RT preparaat of fixatie met 4% PFA alleen kan significante artefacten (figuur 4) veroorzaken.
2. Cultuur van de Cel Voorbereiding voor Live-cell imaging met mEOS3.1-PH PLC δ1
- Bereid de DNA-plasmide dat codeert voor het mEOS3.1-PH PLC δ1 zoals eerder 23 beschreven.
- Cultuur INS-1 cellen op # 1.5 18 mm rond coverslips pre-gecoat met 30 ug / ml fibronectine totdat ze 50% -70% confluency volgende standaard INS-1 celkweek protocollen 38,39.
- De volgende dag transfecteren INS-1-cellen met de mEOS3.1-PH PLC δ1 DNA-plasmide via liposoom transfectie reagens volgens het protocol fabrikant. Incubeer gedurende 48 uur voor beeldvorming.
3. PALM Image Acquisition van Membrane Lakens en levende cellen
- PALM afbeelding overname van membraan vellen
LET OP: Hier, een totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscoop gebaseerd SMLM systeem (100X olie, APO, NA = 1,49, WD 0,12 mm) 23 wordt gebruikt voor alle beeldacquisitie.- Voor de beeldvorming Verdun 1 pi fluorescerende kralen oplossing in 10 ml PBS + 50 mM MgCl2. Voeg 200 ul verdunde oplossing in de beeldvorming kamer met cel monsters (van stap 1.1.8 / 1.2.6) gedurende 10 min. Vervolgens, driemaal wassen met PBS.
- Start de PALM afbeeldingssysteem. In de bijbehorende imaging software, selecteert u de "iRFP kanaal &# 34; knop (642 nm laser excitatie, 700/75 nm emissie). Vind de celmembraan tot expressie PH probes in de iRFP kanaal.
NB: Het membraan blad moet een fluorescerende kraal de buurt te hebben. Dit is vereist voor drift correctie later. - Gebruik de "Capture" knop om een conventionele TIRF beeld van de celmembraan in iRFP kanaal te verzamelen als een referentie voor toekomstige beeldreconstructie. Stel een normaal TIRF hoek (dat wil zeggen, na het bereiken van de kritische hoek, draai nog eens 1,5 graden) door te typen in 2140 in de TIRF hoek instelling voor beeldvorming. Gebruik deze hoek instelling voor alle stappen, tenzij anders vermeld.
LET OP: In de TIRF systeem hier beschreven 3500 is de verticale up hoek, 2200 is de TIRF kritische hoek, en 2140 is de normale TIRF hoek, dat is 1,5 graden meer na TIRF kritische hoek. Onderstaande in 3.2.3 nauwe TIRF hoek 2120, wat een andere 2 graden na het bereiken TIRF grenshoek. - Schakel over naar PAmCherry1 kanaal door te klikken op the RFP kanaal toets (561 nm excitatie, 600/50 nm emissie filter). Stel de schuifbalk in het "AOTF" pad helemaal naar het recht op volledige kracht verlichting van 561 nm laser hebben gedurende 10-20 sec naar de achtergrond membraan fluorescentie bleken.
- Stel de optimale camera-instellingen (2x2 binning) in het tabblad "Format" en de snelle overname protocol in tab "ND sequentie overname" (typisch 10.000-40.000 beelden bij 20 Hz).
- Start acquisitie van PAmCherry1 beelden (561 nm laser op vol vermogen, 50 msec / kader) met gelijktijdige 405 nm laser activering op een laag niveau (0,1% - 1%) door te klikken op de "Run nu" knop. Pas de intensiteit van de 405 nm laser, zodat ruimtelijk geïsoleerde afzonderlijke punten in elk frame zijn gemakkelijk te herkennen.
LET OP: Het aantal activeerbare PAmCherry1 moleculen neemt geleidelijk af tijdens de acquisitie. 405 nm laserintensiteit moet geleidelijk worden verhoogd tot de optimale dichtheid van individuele moleculen signalen in elke houdenframe. - Ga door het verwerven van beelden tot er geen PAmCherry1 enkel molecuul signaal wordt geactiveerd.
- PALM beeldvorming in levende cellen
- Voor de beeldvorming Verdun fluorescerende korrels in de beeldvorming kamer voor 10 min zoals beschreven in stap 3.1.1. Dan beginnen PALM beeldvorming door het openen van de bijbehorende imaging software.
LET OP: Gebruik een magnetische quick-release beeldvorming kamer live-cell imaging. Handhaaf het centrum van het beeldveld bij 35 ° C met een temperatuurregelaar onder constante perfusie met extracellulaire buffer (extracellulaire oplossing: 135 mM NaCl, 5,6 mM KCI, 2,6 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2, 3 mM glucose en 20 mM HEPES, pH = 7,3). - Kies het GFP-kanaal toets (525/50 nm emissie). Identificeer de celmembraan tot expressie fluorescerende probes gebaseerd op groene fluorescerende van mEOS3 onder 488 nm laser excitatie. Zorg ervoor dat fluorescerende kralen in de omgeving zijn ook opgenomen tijdens de beeldvorming als deze hoger is vereist voor offline drift correctie.
- Klik op de "Capture" knop om een TIRF beeld van de celmembraan in mEOS3 (groen) kanaal te verzamelen als een referentiebeeld. Gebruik een ondiepe uitdovende golf excitatie verlichting (na het bereiken van de kritische hoek, draai nog eens 2 graden) door te typen in 2120 in de TIRF hoek instelling voor live cell imaging.
Opmerking: Dit minimaliseert de fluorescentie van de ongebonden mEos3-PH in de cytosol grenzend aan het plasmamembraan. - Schakel over naar de "RFP kanaal" knop (561 nm excitatie, 600/50 nm emissie). Gebruik de volledige kracht 561 nm laser op de achtergrond fluorescentie van het membraan platen voor 10 ~ 20 sec met de schuifbalk in de "AOTF pad" bleken (zie punt 3.1.4).
- Begin beeldacquisitie door te klikken op de "Run Now" knop in het rode kanaal (561 nm vol vermogen, vastgesteld op 10 msec / frame in de "camera" instelling tabblad) met gelijktijdige 405 nm laser activering. Pas de 405 nm laser intensiteit ruimtelijk gescheiden punten te activerenin elk frame.
LET OP: Als overname verloopt, niet-omgezet mEOS3.1-PH PLC δ1 molecule nummer langzaam af. Geleidelijk verhogen van de 405 nm laservermogen aan de enkel molecuul signaal te optimaliseren. De beeldopname lengte is afhankelijk van het experimentele doel. Acquire beelden continu gedurende 5 minuten onder normale omstandigheden. Als er een langere overname vereist is, verzamelen meerdere afbeeldingen stapels in plaats van één grote afbeelding stapel. De bestandsgrootte van elk beeld stapel mag niet groter zijn dan 4 GB of het zal software-analyse later beïnvloeden.
- Voor de beeldvorming Verdun fluorescerende korrels in de beeldvorming kamer voor 10 min zoals beschreven in stap 3.1.1. Dan beginnen PALM beeldvorming door het openen van de bijbehorende imaging software.
4. SMLM Beeldverwerking en Wederopbouw
- Breng de beeldbestanden (TIF image stacks) om een beeldanalyse station. Start het beeldreconstructie-programma (op maat geschreven) in Matlab zoals eerder beschreven 37 en laadt de afbeelding stapel door te klikken op de tab "File" in het hoofdmenu, dan "open" en vervolgens op "nieuw bestand".
- Identificeren en locaLize individuele moleculaire gebeurtenissen van elk frame. Stel filteren intensiteitsdrempel met een drempelwaarde (1-10) in de "wavelet". Controleer de optimale parameterinstellingen voor point detectie visueel voor de wederopbouw. Ga dan naar het tabblad "PALM" en klik op "een stap proces" op de foto om de wederopbouw te beginnen.
LET OP: Intensiteit drempel voor detectie punt is willekeurig en is afhankelijk van persoonlijke ervaring. Verschillende proeven kan nodig zijn om een optimale detectie drempel genereren dat noch pikt teveel ongekwalificeerde (dim) punten, noch filtert al te veel gekwalificeerde (licht) punten. Stel andere parameters gegevensanalyse optimaliseren. Hier wordt de omgeving afstand (fluorescentie punten in de naburige frames binnen een afstand worden gecombineerd) ingesteld als 65 nm (1/2 pixel breedte) en ingericht als een enkel molecuul. Gap frames (individueel molecuul gebeurtenissen die zich binnen deze kaders en de buurt afstand werden gecombineerd en uitgerust als een enkel molecuul event) isingesteld op 26 frames (1,3 sec) voor beeldvorming PAmCherry1 40. Pas deze parameter op basis van de eigenschappen van de single molecule sondes en overname tarief om te voorkomen dat over-het tellen van 40 in SMLM. Solliciteer drift correctie met fluorescerende kralen tijdens de reconstructies.- Voor het afbeelden van het vaste membraan vellen gelabeld door iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1, reconstrueren van het gehele beeld stacks van dezelfde membraan blad een enkel beeld super-resolutie van 37 in.
- Voor levende cel monsters gelabeld door mEOS3.1-PH PLC δ1, scheiden de hele afbeelding stapel in meerdere kleinere stapels van 1000 frames, zodat 1000-opeenvolgende frames stack wordt gereconstrueerd als een enkel beeld super-resolutie, die een tijdsresolutie van heeft 10 sec. Op het einde, een combinatie van alle tijdreeksen beelden, die in de uiteindelijke tijdreeks stack 23.
NB: in de live-cell imaging PALM, kan een klein aantal geactiveerde sondes te verplaatsen of te distantiërenvan PI (4,5) P2 in de PM voordat bleken. Ter compensatie van de overbemonstering van de probes combineren individuele molecule signalen in de aangrenzende frames binnen 130 nm (in plaats van 65 nm) in één emissie gebeurtenis tijdens beeldanalyse.
- Na het behalen van de gereconstrueerde beelden, uit te voeren verdere beeldanalyse met de op maat geschreven programma in Matlab te molecule dichtheid, micro-domein dichtheid / grootte en cluster-analyse met pair-correlatie 41 kwantificeren.
Representative Results
De lokalisatie onzekerheid (σ) van onze super-resolutie-systeem is 14.73 nm 23. Directe vergelijkingen tussen TIRF en PALM beelden toonden een significante verbetering van de ruimtelijke resolutie. Figuur 3A-B toont de vertegenwoordiger PI (4,5) P2 TIRF beelden gelabeld met PI (4,5) P2 antilichaam en iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 in de typische membraan lakens en levende cellen. De beelden met conventionele TIRF microscopie membraanlagen opmerkelijk overeen met die in intacte levende cellen gelabeld met het versterkt groen fluorescentie-eiwit (EGFP) hebben PH domeinen (EGFP-PH PLCδ1) (Figuur 3C). Alle monsters vertoonden een gelijkmatige verdeling van probes. Daarentegen vereist de niet-optimale fixatie van de monsters resulteerde in scherpe dichte PI (4,5) P2 clusters en een afname in signaalintensiteit (figuur 4). Onder optimale omstandigheden fixatie, thij super-resolutie beelden van PI (4,5) P2 in gefixeerde cellen (figuur 5) onthulde een homogene verdeling van probes in een aanzienlijk deel van de PM slechts beperkte concentratie gradiënten. Sommige membraan pleisters verrijkt met PI (4,5) P2 probes werden dun verspreid en had verschillende afmetingen. Levende cellen PALM afbeeldingen weer te geven een soortgelijke ruimtelijke verdeling als vaste cellen (Figuur 6). Gedetailleerde analyse van de PI (4,5) P2 signalen na verloop van tijd resulteert in een snelle dynamiek in lokale gebieden, zonder noemenswaardige veranderingen van hun overvloed in grote gebieden.
Figuur 1. Stelsel voor fluorescerende probes gebruikt in deze studie. (AB) iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 probe gebruikt in de vaste membraanplaat experimenten. Tijdens conventionele TIRF beeldvorming (A), een 640 nm laser wordt gebruikt om de iRFP wekken (Ex: 692 nm, Em: 713 nm). TIRF beeld dat in deze toestand dient beeld TIRF referentie voor de super-resolutie beeldvorming verkregen door PALM imaging (B). Een 405 nm laser wordt gebruikt om foto-activeren van de PAmCherry1 fluorofoor en een 561 nm laser wordt gebruikt om te prikkelen PAmCherry1 (Ex: 564 nm; Em: 595 nm) voor PALM beeldvorming. (CD) mEos3.1-PH PLCδ1 probe gebruikt in de levende cel experimenten. (C) Tijdens conventionele TIRF beeldvorming, is een 488 nm laser gebruikt om te prikkelen mEOS3.1 (Ex: 506 nm; Em: 519 nm). (D) Na photoconversion door een 405 nm laser, mEos3.1 verandert in de rode vorm (Ex: 573 nm; Em: 584 nm). En een 561 nm laser wordt gebruikt voor PALM acquisities Klik hier om een grotere versie te bekijken dit figuur.
s / ftp_upload / 54466 / 54466fig2.jpg "/>
Figuur 2. Regeling membraanlaag bereiding van INS-1-cellen. (A) Plaats het dekglaasje met gekweekte cellen naar beneden op een PDL-gecoate dekglaasje en wacht 7 ~ 10 minuten bij 4 ° C om celhechting aan de PDL- toestaan gecoate dekglaasje. (B) Verwijder de top dekglaasje met een pincet en bevestig het membraan plaat bevestigd aan de PDL pre-gecoate dekglaasje. (C) Afbeelding van de monsters met TIRFM en PALM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. PI (4,5) P2 ruimtelijke organisatie vergelijkbaar tussen membraanlagen en intacte levende cellen onder gebruikelijke TIRF microscoop. (A) Atypisch TIRF beeld van membraanlagen vastgesteld op 4 ° C met 4% PFA en 0,2% GA. PI (4,5) P2 werd gelabeld met PI (4,5) P2 specifiek antilichaam. (B) Een membraan vel uit de INS-1 cel die iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1. (C) TIRF beeld van twee intacte levende cellen die EGFP-PH PLCδ1 op verschillende niveaus. Schaalbalken: (A): 3 pm; (B) en (C):. 5 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. PI (4,5) P2 ruimtelijke organisatie membraanlagen gevoelig gemeenschappelijke fixatie omstandigheden. (A) membraanlagen vastgesteld bij 37 ° C met 4% PFA alleenen gelabeld met PI (4,5) P2 specifiek antilichaam (zoals in figuur 3A). (B) membraanlaag vastgesteld bij KT met PFA staan gelabeld met PI (4,5) P2 specifiek antilichaam. Merk op dat de dichte clusters van PI (4,5) P2 probes zijn duidelijk zichtbaar onder TIRF microscoop, in tegenstelling tot de veel gelijkmatiger fluorescentiebeelden figuur 3A. Schaal bars: AB:. 3 urn Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. PALM beeldvorming van PI (4,5) P2 sondes onthult hun nanometerschaal verspreiding in een INS-1 cel PM. (A) iRFP TIRF beeld van een membraan vel uit een INS-1 cel die iRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1. (B) PALM beeld van PM Overeenkomstige in dezelfde regio op basis van PAmCherry1 signaal wederopbouw. Let op de homogene PI (4,5) P2 ruimtelijke verdeling in de grote PM regio's en verschillende PI (4,5) P2 microdomeinen. (C) Een vergroot aanzicht van de doos gebied (B). Pijlen geven dun verspreid PM microdomeinen verrijkt met PI (4,5) P2 probes. Schaal bars: A en B: 3 micrometer; C: 500 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. PALM beeldvorming in levende INS-1-cellen. (A) TIRF beeld van PI (4,5) P2 in een live INS-1 cel die mEos3.1-PH PLCδ1. Het beeld werd snel in de groene kanaal voor PALM overname (35 ° C) verworven. (B) Sequential voor live-cell PALM afbeeldingen in 10 sec interval. Bijvoegsels tonen de intensiteitprofielen van de lokale PI (4,5) P2 dichtheid langs dezelfde rechte positie 1 op verschillende tijdstippen in (B) en (C). Let op hun grote lokale intensiteit veranderingen binnen 10 sec. (D) Tijdsverloop van de gemiddelde intensiteit veranderingen van PI (4,5) P2 in het grote gebied (box2, 3x3 um) en kleine cirkels (3, 4, en 5, 500 nm diameter) in (B) gedurende 5 min van PALM imaging (frame / 10 sec). Let op de snelle intensiteitsfluctuaties lokale PI (4,5) P2 probes (cirkel 3, 4 en 5) in vergelijking met zeer kleine veranderingen in het brede gebied (blok 2). (E) PALM vergrote afbeeldingen van de box2 gebied (B) bij bepaalde tijden. Pijlen geven PI (4,5) P2 verrijkt membraan plekken onder physiological omstandigheden. Schaal bars: C: 3 micrometer; E: 500 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Voor het oplossen van problemen, twee processen moeten extra aandacht: membraan productie blad en sample fixatie. Zoals beschreven in het protocol, de incubatietijd van de dekglaasjes in stap 1.1.6 is belangrijk membraanplaat productie. Optimale incubatietijd onder onze experimentele conditie 7-10 min (figuur 2). Langer dan 10 minuten incubatie worden intacte cellen in plaats van de membraanlagen op PDL dekglaasjes en kortere incubatie produceren leidt tot minder of geen membraanlagen op de PDL-gecoate dekglaasjes. Zoals beschreven in het protocol, de fixeermiddelen en temperatuur tijdens fixatie kritisch voor het handhaven van de PI (4,5) P2 verdeling in de PM. Fixatie bij RT of het gebruik van 4% -PFA alleen kon de normale lipide-verdeling in de PM verstoren.
Door het toepassen van PALM microscopie om lipide onderzoek membraan, zijn we in staat om de nanometerschaal verdeling van de PI in acht (4,5) P2, een belangrijke fosfoinositide dat m bemiddeltgeen fundamentele cellulaire activiteiten. Deze ruimtelijke verdeling van de PI (4,5) P2 met een beperkte concentratie gradiënten in INS-1-cellen biedt een kader voor heroverweging lipide-eiwit interacties en lokale signalering gebeurtenissen van PI (4,5) P2 in deze cellen. Bovendien ontwikkelde deze werkwijzen kunnen ook worden toegepast op andere membraanfosfolipide onderzoek met de juiste probes daardoor met nieuwe instrumenten te phosphoinositides in biologische processen te bestuderen.
Het gebruik van membraan bladen in dit werk omzeilt twee belangrijkste aandachtspunten in fosfolipiden morfologische studies: detergent behandeling en mogelijke signaal verontreiniging van het cytosol. Wasmiddelen veroorzaken vaak clustering en significant verlies van PM fosfolipiden signaal. De verontreiniging van cytosolische signaal bijzonder problematisch bij lage abundantie phosphoinositides de PM 23, zoals PI (3,4,5) P3 en PI (3,4) P2. Membraan sheet monsters zijn in staat om circumvent deze problemen zonder significante verstoring structuren geassocieerd met het plasmamembraan, zoals corticale actine vlechtwerk en clathrine gecoate pits 42,43. De relatieve homogene verdeling van PI (4,5) P2 in de PM is in goede overeenstemming met andere invriesapparaat EM studies met GST-PH PLC δ1 probes in de fibroblast membraan 44.
Het is belangrijk op te merken dat de onjuiste verwerking monster omstandigheden misleidende resultaten kan genereren. Ten eerste is het essentieel om de fixatie stappen uit te voeren bij een lagere temperatuur (4 ° C) en gebruik het fixeermiddel GA van membraanplaat productie. Zoals getoond in figuur 3, warme temperatuur en PFA fixatie zonder GA is niet voldoende om phosphoinositides in cel PM bevestigen. Dit zou de intacte PI (4,5) P2 distributie verstoren en het genereren van sterke clusters die niet zijn waargenomen in levende cellen onder fysiologische omstandigheden. Ten tweede, het gebruik van PAmCherry1 alsSMLM de probe in plaats van andere sondes, is cruciaal voor de kwantitatieve PALM beeldvorming. Het voordeel van PAmCherry1 verzoek komt uit de goed gekarakteriseerde moleculaire één foto-fysische eigenschappen 35,40,45, zoals helderheid, hoge fotoactivering efficiëntie en bovenal zeer beperkte foto-knipperen. Deze eigenschappen stellen ons in staat om potentiële cluster artefacten van foto-knipperen elimineren en kwantitatieve analyse van de moleculaire dichtheid van membraan PI (4,5) P2.
Deze aanpak heeft ook zijn beperkingen. Ten eerste kan de membraanlaag methode die in dit onderzoek niet volledig bootsen de fysiologische verdeling van PI (4,5) P2, omdat de cel wordt onderbroken voor de beeldvorming. Echter, onze live PALM imaging geeft zelfde relatief homogene verdeling van de PI (4,5) P2, het ondersteunen van de resultaten waargenomen met membraan blad monsters. Ten tweede, zoals we in onze vorige werk 23 besproken, SMLM vereist imaging expertise en extra opTENTION om imaging artefacten die kunnen voortvloeien uit verschillende processen, met inbegrip van de probes gebruikt, monstervoorbereiding en fixatie, afbeelding bemonstering en wederopbouw te vermijden. Tenslotte, hoewel de PH-domein probes en antilichamen zijn op grote schaal gebruikt in fosfoinositide studies 46,47 blijft het mogelijk dat niet alle PI (4,5) P2 in het membraan kan worden gedetecteerd door deze benadering. Bijvoorbeeld kan PI (4,5) P2 bindend andere endogene eiwitten niet toegankelijk PH probes of antilichamen, en dit kan een onderschatting van PI (4,5) P2 veroorzaken vanwege de ruimte belemmering van sonde zelf. Een alternatieve manier voor het merken PI (4,5) P2 zou gebruiken hoogst Fluor PI (4,5) P2 48 een gelabelde PI (4,5) P2 analoog met een modificatie op de staart van originele PI (4,5) P2. Het kan echter snel worden omgezet in andere fosfoinositide subtypes door snelle levende celmetabolisme sinds de inositol ring gelijk endogenous PI (4,5) P2. Dit kan ertoe leiden of deze gelabelde PI (4,5) P2 analogon in levende cellen getrouw kan vertegenwoordigen PI (4,5) P2 in plaats metabolieten daarvan. Daarom, ondanks bepaalde beperkingen, PH-domein probes nog steeds tot de beste probes die op grote schaal gebruikt voor het bewaken PI (4,5) P2 distributie en dynamiek op de PM van cellen.
De latere toepassing van deze methodologie kan worden uitgebreid tot andere studies fosfoinositide, zoals PI (3,4,5) P3 en PI (3,4) P2. Samengevat, de nieuwe benadering SMLM hier gebruikt opent nieuwe wegen om fosfoinositide bestuderen in cellen. Gebruik PI (4,5) P2 als voorbeeld tonen we de unieke eigenschappen van PALM beeldvorming in de morfologische en kwantitatief onderzoek van celmembraan moleculen en nadelen. Deze benadering kan worden aangepast aan andere moleculen van belang en brede toepassingen in celbiologie hebben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Nikon | Ti-U | |
| sCMOS camera | Andor | Neo | |
| Spinning disk | Yokogawa | CSU X-1, 10,000 rpm | |
| High Power Monolithic Laser Combiner SP with 405, 488, 561 and 642 nm lasers. | Agilent | MLC400 | laser original powers & powers at the end of optical fiber) 405 nm: 15 mW & 13 mW; 488 nm: 45 mW & 42 mW; 561 nm: 45 mW & 40 mW; 640 nm: 35 mW & 16 mW. |
| 100X Objective | Nikon | APO 100X Oil, NA 1.49, WD 0.12 mm | |
| Nikon acquisition and analysis software (NIS Element) | Nikon | ||
| Matlab | MathWorks | ||
| Coverslip | Warner | 64-0714 | Round 18 mm coverslip, #1.5 |
| Fibronectin | Millipore | FC010-5MG | |
| Lipofectamin 3000 (transfection reagent) | Invitrogen | L3000-008 | |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | #16120 | |
| PI(4,5)P2 1st antibody | Santa Cruz | sc-53412 | |
| secondary antibody F(ab’)2-goat-anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21237 | |
| Tetraspeck beads | Invitrogen | T7279 | |
| magnetic quick release imaging chamber | Warner Instruments | Cat#641994 | |
| temperature controller | Warner Instruments | TC-344C | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma | P4417-100TAB | |
| EGTA | Sigma | 3780 | |
| NH4Cl | Sigma | A0171 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| CaCl2•2H2O | Sigma | 223506 | |
| MgCl2•6H2O | Sigma | M9272 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Paraformaldyhyde | Sigma | P6148 |
References
- Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443, 651-657 (2006).
- Hammond, G. R. V., et al. PI4P And PI(4,5)P(2) Are Essential But Independent Lipid Determinants Of Membrane Identity. Science. 337, New York, N.Y. 727-730 (2012).
- Nakatsu, F., et al. PtdIns4P synthesis by PI4KIIIalpha at the plasma membrane and its impact on plasma membrane identity. J Cell Biol. 199, 1003-1016 (2012).
- Cantley, L. C.
- Czech, M. P. Dynamics of phosphoinositides in membrane retrieval and insertion. Annu Rev Physiol. 65, 791-815 (2003).
- Spira, F., et al. Patchwork organization of the yeast plasma membrane into numerous coexisting domains. Nat Cell Biol. 14, 640-648 (2012).
- Barg, S., Knowles, M. K., Chen, X., Midorikawa, M., Almers, W. Syntaxin clusters assemble reversibly at sites of secretory granules in live cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 20804-20809 (2010).
- Sieber, J. J., et al. Anatomy and dynamics of a supramolecular membrane protein cluster. Science. 317, 1072-1076 (2007).
- Knowles, M. K., et al. Single secretory granules of live cells recruit syntaxin-1 and synaptosomal associated protein 25 (SNAP-25) in large copy numbers. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 20810-20815 (2010).
- Milosevic, I., et al. Plasmalemmal phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate level regulates the releasable vesicle pool size in chromaffin cells. J Neurosci. 25, 2557-2565 (2005).
- van Rheenen, J., Jalink, K. Agonist-induced PIP(2) hydrolysis inhibits cortical actin dynamics: regulation at a global but not at a micrometer scale. Mol Biol Cell. 13 (2), 3257-3267 (2002).
- Hammond, G., Schiavo, G., Irvine, R. Immunocytochemical techniques reveal multiple, distinct cellular pools of PtdIns4P and PtdIns (4, 5) P2. Biochem J. 422, 23-35 (2009).
- Huang, S., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate-rich plasma membrane patches organize active zones of endocytosis and ruffling in cultured adipocytes. Mol Cell Biol. 24, 9102-9123 (2004).
- James, D. J., Khodthong, C., Kowalchyk, J. A., Martin, T. F. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate regulates SNARE-dependent membrane fusion. J Cell Biol. 182, 355-366 (2008).
- Laux, T., et al. GAP43, MARCKS, CAP23 modulate PI(4,5)P(2) at plasmalemmal rafts, and regulate cell cortex actin dynamics through a common mechanism. J Cell Biol. 149, 1455-1472 (2000).
- Aoyagi, K., et al. The activation of exocytotic sites by the formation of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate microdomains at syntaxin clusters. J Biol Chem. 280, 17346-17352 (2005).
- Kabachinski, G., Yamaga, M., Kielar-Grevstad, D. M., Bruinsma, S., Martin, T. F. CAPS and Munc13 utilize distinct PIP2-linked mechanisms to promote vesicle exocytosis. Mol Biol Cell. 25, 508-521 (2014).
- Wang, J., Richards, D. A. Segregation of PIP2 and PIP3 into distinct nanoscale regions within the plasma membrane. Biol Open. 1, 857-862 (2012).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19, 780-782 (1994).
- van den Bogaart, G., et al. Membrane protein sequestering by ionic protein-lipid interactions. Nature. 479, 552-555 (2011).
- van Rheenen, J., Achame, E. M., Janssen, H., Calafat, J., Jalink, K. PIP2 signaling in lipid domains: a critical re-evaluation. Embo J. 24, 1664-1673 (2005).
- Sato, K., et al. Differential requirements for clathrin in receptor-mediated endocytosis and maintenance of synaptic vesicle pools. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 1139-1144 (2009).
- Ji, C., Zhang, Y., Xu, P., Xu, T., Lou, X. Nanoscale Landscape of Phosphoinositides Revealed by Specific Pleckstrin Homology (PH) Domains Using Single-molecule Superresolution Imaging in the Plasma Membrane. J of Biol Chem. 290, 26978-26993 (2015).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
- Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, spectrin, and associated proteins form a periodic cytoskeletal structure in axons. Science. 339, 452-456 (2013).
- Wombacher, R., et al. Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates. Nat Methods. 7, 717-719 (2010).
- Szymborska, A., et al. Nuclear pore scaffold structure analyzed by super-resolution microscopy and particle averaging. Science. 341, 655-658 (2013).
- Pertsinidis, A., et al. Ultrahigh-resolution imaging reveals formation of neuronal SNARE/Munc18 complexes in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 2812-2820 (2013).
- Shim, S. -H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proc Natl Acad Sci. 109, 13978-13983 (2012).
- Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
- Balla, T., Várnai, P. Visualization of Cellular Phosphoinositide Pools with GFP-Fused Protein-Domains. Curr Protoc Cell Biol. 24, 24 (2009).
- Xu, C., Watras, J., Loew, L. M. Kinetic analysis of receptor-activated phosphoinositide turnover. J Cell Biol. 161, 779-791 (2003).
- Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nat Methods. 6, 153-159 (2009).
- Filonov, G. S., et al. Bright and stable near infra-red fluorescent protein for in vivo imaging. Nature Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
- Zhang, M., et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins. Nat Methods. 9, 727-729 (2012).
- Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49, 424-430 (2000).
- Dyachok, O., Isakov, Y., Sågetorp, J., Tengholm, A. Oscillations of cyclic AMP in hormone-stimulated insulin-secreting β-cells. Nature. 439, 349-352 (2006).
- Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 18519-18524 (2013).
- Sengupta, P., et al. Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis. Nat Methods. 8, 969-975 (2011).
- Morone, N., et al. Three-dimensional reconstruction of the membrane skeleton at the plasma membrane interface by electron tomography. J Cell Biol. 174, 851-862 (2006).
- Peters, K. R., Carley, W. W., Palade, G. E. Endothelial plasmalemmal vesicles have a characteristic striped bipolar surface structure. J Cell Biol. 101, 2233-2238 (1985).
- Fujita, A., Cheng, J., Tauchi-Sato, K., Takenawa, T., Fujimoto, T. A distinct pool of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in caveolae revealed by a nanoscale labeling technique. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 9256-9261 (2009).
- Durisic, N., Laparra-Cuervo, L., Sandoval-Álvarez, Á, Borbely, J. S., Lakadamyali, M. Single-molecule evaluation of fluorescent protein photoactivation efficiency using an in vivo nanotemplate. Nat Methods. 11, 156-162 (2014).
- Thomas, C. L., Steel, J., Prestwich, G. D., Schiavo, G. Generation of phosphatidylinositol-specific antibodies and their characterization. Biochem Soc Trans. 27, 648-652 (1999).
- Várnai, P., Balla, T. Live cell imaging of phosphoinositides with expressed inositide binding protein domains. Methods. 46, 167-176 (2008).
- Honigmann, A., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate clusters act as molecular beacons for vesicle recruitment. Nature Struct Mol Biol. 20, 679-686 (2013).
