Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Single-molekyl Super-Resolution Imaging of phosphatidylinositol 4,5-bisfosfat i plasmamembranen med Novel fluorescerende prober

Published: October 15, 2016 doi: 10.3791/54466
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neuroscience, University of Wisconsin-Madison

Summary

PI (4,5) P 2 regulerer ulike cellulære funksjoner, men nanoskala organisasjon i cellen plasmamembranen er dårlig forstått. Ved merking PI (4,5) P-2 med en to-farge fluorescerende probe sammensmeltet til Pleckstrin Homologi domene, beskriver vi en ny tilnærming for å studere PI (4,5) P to romlig fordeling i plasmamembranen til nanometerskala .

Introduction

Phosphoinositides bidra til en liten del av de totale membranlipider, men spiller avgjørende roller i en rekke forskjellige cellulære prosesser. De omfatter syv medlemmer som stammer fra reversibel fosforylering eller defosforylering av inositol ringene på 3., 4. og 5. posisjon 1. Fosfatidylinositol 4-fosfat (PI4P) og fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat (PI (4,5) P 2) er to viktige phosphoinositides som fungerer relativt uavhengig som de avgjørende lipider av celleplasmamembran (PM) 2,3. Fosfatidylinositol (3,4,5) -trisphosphate (PIP 3) er mye mindre enn rikelig PI4P og PI (4,5) P 2, men det har unike funksjoner i ulike cellulære prosesser, inkludert kreft 4 og diabetes fem. Disse lipider har komplekse molekylære interaksjoner med sine effektbokser og mange andre proteiner. Derfor er det viktig å forstå den romlige organiseringen av disse phosphoinositides i PM på nanometer skala.

Montering bevis har vist at proteinkomplekser eller molekyl klynger i trange PM områder kan tjene som signaliserer hotspots 6. For eksempel syntaxin 1a, et nøkkelprotein som regulerer membranfusjon 7-9, viser klynge organisasjon i PM. Til forskjell fra konsensus visningen av klyngen organisering av syntaxin 1a, er den romlige fordelingen av phosphoinositides i PM kontroversielt. PI (4,5) P to fordelingsmønstre varierer fra uniform 10-12, store oppdateringer 13,14, for å tette klynger 14-18, avhengig av celletyper og eksperimentelle metoder som brukes. Den romlige organiseringen av PI (4,5) P 2 ved høyere oppløsning er også inkonsekvent. En undersøkelse ved hjelp av stimulert-utslipps uttømming (STED) mikroskopi 19 har avdekket et stort antall tett PI (4,5) P 2 nano-klynger (~ 73 nm i diameter) i PM ark av PC-12-celler 20 21,22, en tilnærming som bevarer intakt PM strukturen i levende celler mye bedre enn kjemisk fiksering. Sistnevnte viste tydelige bassenger av PI (4,5) P 2; relativt konsentrert PI (4,5) P 2 i caveolae og belagte groper samt jevn fordeling på flat PM regionen. Videre kan nanoskala PI (4,5) P 2 organisasjon i membranplater varierer i levende og fikserte celler. Vår siste arbeid utredet saken, både faste og bor INS-1 celler ved hjelp av enkelt-molekyl lokalisering mikroskopi (SMLM) 23.

SMLM er basert på stokastisk å bytte på bare en liten undergruppe av fluoroforer til enhver tid, slik at de enkelte fluoroforer kan lokaliseres med stor nøyaktighet. Mange super-Resolution Imaging tilnærminger har blitt utviklet ved hjelp av tilsvarende prinsipper for å overgå diffraksjon grensen av konvensjonell lysmikroskopi, sliks fotoaktivering lokalisering mikroskopi (PALM) 24, fluorescens fotoaktivering lokalisering mikroskopi (FPALM) 25, stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM) 26,27 og direkte STORM (dSTORM) 28. Med foto valgbar eller photoactivatable fluoroforer (fargestoffer eller fluorescerende proteiner), SMLM teknikker tillate forskere til bilde biologiske strukturer på nanometer oppløsning 24,29,30 med video-rate i levende celler 31,32.

Bruke PI (4,5) P 2 som et eksempel, introduserte vi SMLM tilnærming for å studere nanoskala fordelingen av phosphoinositides på PM. PH domenet PLCδ1 (fosfolipase C δ1) som binder seg til PI (4,5) P 2 er et veletablert probe for bildebehandling PI (4,5) P to sub-cellulære distribusjon og dynamikk 33,34 i PM . Vi har genetisk merket dette domenet med to fluorescerende proteiner, PAmCherry1 35 og iRFP 36 PLCδ1) (figur 1A-B). PAmCherry1 fungerer som photoactivatable probe av PH domene for PALM og iRFP fungerer som en generell indikator for å identifisere transfekterte celler før PALM oppkjøp . Vi bruker denne dual-farge fluorescerende probe for SMLM bildebehandling i de faste membraner. For levende PALM bildebehandling, merket vi mEOS3 37 i stedet for PAmCherry1 til PH PLCδ1 domene for å generere mEOS3.1-PH PLCδ1 probe for sin bedre foton effektivitet og lysstyrke (figur 1C-D).

SMLM avbildning med disse nye prober i PM av insulin-sekresjon INS-1 celler 38 har avdekket homogen merking av PI (4,5) P 2 i flertallet av PM regioner, samt konsentrert PI (4,5) P 2 mikroområder som er tynt insprängda i leiligheten PM og noen filopodia-lignende strukturer 23. Så ennoscale fordeling av PI (4,5) P 2 gir en strukturell utgangspunkt for å tenke nytt om hvordan den fungerer i levende celler.

Protocol

1. Membran Sheet Forberedelse og Fiksering

  1. Forbered membraner merket med iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1
    1. Klargjør DNA plasmid som koder iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 23 ved hjelp av standard molekylærbiologiske teknikker.
    2. Kultur INS-1 celler på # 1,5 18 mm runde dekkglass pre-belagt med 30 mikrogram / ml fibronektin til 50-70% konfluens følgende standard INS-1 cellekultur protokoller 38,39. Transfektere cellene en dag etter 50 til 70% konfluens er nådd.
    3. Transfektere celler med iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 bruker liposomer transfeksjon reagens følge produsentens protokoller. Etter transfeksjon, tillate cellene å vokse i 48 timer.
    4. På dagen for forsøket, belegge dekkglass (på én side) med ~ 0,5 til 1 ml 500 ug / ml poly-D-lysin (PDL; fortynnet i dH 2 O) i 1-2 timer. Deretter drenere PDL ved å plassere et silkepapir påkanten av dekkglass. Plassere objektglassene på en pre-avkjølt (4 ° C) metallplate for senere bruk.
    5. Vask pre-transfektert Ins-1-celler som vokser på dekkglass med ~ 0,5 til 1 ml iskald fosfatbufret saltløsning (PBS) inneholdende 1 mM EGTA. Gjenta vask tre ganger og avløp PBS.
    6. Plasser Dekk med dyrkede celler (cellesiden ned) på PDL-belagte dekkglass på en pre-kjølt metallplate med en pinsett. La platen i et kjøleskap (4 ° C) i 7 - 10 minutter for å tillate cellene å feste til PDL-belagte dekkglass (figur 2).
      MERK: Inkubasjonstiden bør være i området på 7 - 10 min for bedre festing av cellene til PDL-belagte overflate. Kjøleskapet miljø er tørr og inkubasjonen bør ikke være for lang.
    7. Fjern metallplaten fra kjøleskapet. Forsiktig skrelle av dekkglass som inneholder de forhånds transfekterte celler ved hjelp av pinsett. Dette gir et tynt lag av cellemembranen arket påPDL-belagt dekkglass. Vask forsiktig membranplater med ~ 0,5 til 1 ml iskald PBS og deretter løse med ~ 0,5 til 1 ml iskald 4% paraformaldehyd (PFA) + 0,2% glutaraldehyd (GA) i PBS i 15 min ved 4 ° C.
      Forsiktig: Paraformaldehyde og glutaraldehyd er giftige. Håndtere dem i et avtrekksskap med hud og vernebriller.
    8. Etter fiksering, bilde membranplater umiddelbart (se pkt 3) eller oppbevare i ~ 0,5 til 1 ml PBS ved 4 ° C.
      MERK: Etter å feste membranen, vil det ikke være noen likevekt binding av PH prober fra cytosol til PI (4,5) P 2. De bundne PH sondene vil gradvis dissosiere fra membranarket og diffundere inn i oppløsningen (selv om det kan ta dager eller uker). Derfor anbefales det å avbilde de faste prøvene rett etter prøveopparbeidelse.
  2. Forbered membraner for PI (4,5) P 2 spesifikt antistoff merking
    1. Kultur INS-1 celler på # 1.5, 18 mm runde dekkglass pre-belagt med 30 &# 181; g / ml fibronektin til 50% -70% konfluens. Transfektere celler med DNA-plasmid den neste dag som beskrevet i trinn 1.1.3.
    2. Gjenta trinn fra 1.1.4 til 1.1.7 som beskrevet ovenfor.
      MERK: Utfør følgende prosedyrer ved 4 ° C.
    3. Vask Dekk inneholder faste PM ark tre ganger med ~ 0,5 til 1 ml iskald PBS inneholdende 50 mM NH4Cl. Slukke arkene med ~ 0,5 til 1 ml 0,1% natrium-hydrid i PBS i 7 minutter, og vaskes med ~ 0,5 til 1 ml PBS (uten 50 mM NH4CI).
    4. Blokkere prøvene med ~ 0,5 - 1 ml blokkeringsoppløsning (PBS-løsning inneholdende 5% (volum / volum) normalt geiteserum, 5% (v / v) bovint serumalbumin og 50 mM NH4CI) i 45 min. Deretter inkuberes med ~ 0,5 - 1 ml primær PI (4,5) P-2-antistoff (1: 300 fortynning) i blokkeringsløsning i 1 time. Vask tre ganger (10 min hver gang) med ~ 0,5 - 1 ml PBS inneholdende 50 mM NH4CI.
    5. Inkuber prøver med ~ 0,5 - 1 ml sekundært F (ab ') 2-geit-anti-musantistoff konjugert med fluoroforer (1: 300) i blokkeringsbuffer i 1 time. Vask tre ganger med ~ 0,5 til 1 ml PBS.
    6. Post-fix prøver med 4% PFA + 0,2% GA i 15 minutter, deretter vaske prøvene tre ganger med PBS (7 min hver gang). Fortsett til avsnitt 3 for avbildning eller lagre i ~ 0,5 ~ 1 ml PBS ved 4 ° C for senere bruk.
      MERK: Forbered prøver ved 4 ° C. Bruk 4% PFA + 0,2% GA fiksativ for å bevare den fysiologiske fordelingen av phosphoinositides i PM. RT forberedelse eller fiksering med 4% PFA alene kan forårsake betydelige gjenstander (figur 4).

2. Cell Culture Forberedelse for Live-celle bildebehandling med mEOS3.1-PH PLC δ1

  1. Klargjør DNA plasmid som koder for mEOS3.1-PH PLC δ1 som beskrevet tidligere 23.
  2. Kultur INS-1 celler på # 1,5 18 mm runde dekkglass pre-belagt med 30 mikrogram / ml fibronektin til de når 50% -70% confl-frekvensen følgende standard INS-1 cellekultur protokoller 38,39.
  3. Dagen etter transfektere INS-1 celler med mEOS3.1-PH PLC δ1 DNA plasmid bruker liposomer transfeksjon reagens følgende produksjon protokoll. Inkuber i 48 timer før avbilding.

3. PALM Image Acquisition av membraner og levende celler

  1. PALM image oppkjøpet av membraner
    MERK: Her en total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskop basert SMLM system (100X olje, APO, NA = 1,49, WD 0,12 mm) 23 brukes for alle image oppkjøpet.
    1. Før avbildning, fortynnet 1 mL av fluorescerende vulst oppløsning i 10 ml PBS + 50 mM MgCl2. Tilsett 200 ul fortynnet oppløsning inn i avbildnings kammer inneholdende celleprøver (fra trinn 1.1.8 / 1.2.6) i 10 min. Deretter, vask med PBS tre ganger.
    2. Start PALM imaging system. I den tilhørende bildebehandlingsprogrammer, velg "iRFP kanal &# 34; knappen (642 nm laser eksitasjon, 700/75 nm utslipp). Finn cellemembranen uttrykker PH sonder i iRFP kanal.
      MERK: Membranen arket skal ha et fluorescerende perle i nærheten. Dette er nødvendig for korreksjon av drifting senere.
    3. Bruk "Capture" -knappen for å samle en konvensjonell TIRF bilde av cellemembranen i iRFP kanalen som en referanse for fremtidig bilde gjenoppbygging. Sett en normal TIRF vinkel (dvs. etter å ha nådd den kritiske vinkel, skru en annen 1,5 grader) ved å skrive inn 2140 i TIRF vinkelen for bildebehandling. Bruk denne vinkelen for alle trinn, med mindre annet er angitt.
      MERK: I TIRF system som beskrives her, er 3500 den vertikale opp vinkel, 2200 er TIRF kritisk vinkel, og 2140 er den normale TIRF vinkel, noe som er 1,5 grader mer etter TIRF kritisk vinkel. Den smale TIRF vinkel som er nevnt nedenfor i 3.2.3 er 2120, som er en annen 2 grad etter å ha nådd TIRF kritisk vinkel.
    4. Bytt til PAmCherry1 kanal ved å klikke på the RFP kanalknappen (561 nm eksitasjon, 600/50 nm utslipp filter). Juster rullefeltet i "AOTF" pad hele veien til retten til å ha full effekt belysning av 561 nm laser for 10-20 sek å bleke bakgrunnen membran fluorescens.
    5. Sett den optimale kamerainnstillingen (2x2 binning) i "Format" -fanen og den raske oppkjøp protokollen i "ND sekvens oppkjøp" -kategorien (typisk 10,000-40,000 bilder på 20 Hz).
    6. Begynn oppkjøpet av PAmCherry1 bilder (561 nm laser ved full effekt, 50 msek / ramme) med samtidig 405 nm laser aktivering på et lavt nivå (0,1% - 1%) ved å klikke på "Kjør nå" -knappen. Justere intensiteten på 405 nm laser slik at romlig isolerte enkeltpunkter i hver ramme er lett identifiserbare.
      MERK: Antallet aktiverbare PAmCherry1 molekyler avtar gradvis i løpet av oppkjøpet. 405 nm laserintensiteten økes gradvis for å holde den optimale tetthet av individuelle signaler i hvert molekylramme.
    7. Fortsett skaffe bilder til det ikke PAmCherry1 enkelt molekyl signal aktiveres.
  2. PALM bildebehandling i levende celler
    1. Før avbildning, fortynnet fluoriserende perler i bildekammeret i 10 minutter som beskrevet i trinn 3.1.1. Deretter starter PALM bildebehandling ved å åpne den tilhørende bildebehandlingsprogrammer.
      MERK: Bruk en magnetisk quick-release bildebehandling kammeret for live-cell imaging. Opprett midten av bildefeltet ved 35 ° C med en temperaturregulator under konstant perfusjon med ekstracellulær buffer (Ekstracellulær Løsning: 135 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 2,6 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2, 3 mM glukose og 20 mM HEPES; pH = 7,3).
    2. Velg GFP kanalknappen (525/50 nm utslipp). Identifiser cellemembranen uttrykker fluorescerende prober basert på grønn fluorescerende fra mEOS3 etter 488 nm laser eksitasjon. Kontroller at fluoriserende perler i nærheten er også inkludert i bildebehandling, da dette er nødvendig senere for offline drift korreksjon.
    3. Klikk på "Capture" for å samle inn en TIRF bilde av cellemembranen i mEOS3 (grønn) kanal som et referansebilde. Bruk en grunne flyktig bølgeeksitering belysning (etter å ha nådd den kritiske vinkel, skru ytterligere 2 grader) ved å skrive inn 2120 i TIRF vinkel innstilling for live-cell imaging.
      MERK: Dette minimaliserer fluorescens fra den ubundne mEos3-PH i cytosol ved siden av plasmamembranen.
    4. Bytt til "RFP kanal" -knappen (561 nm eksitasjon, 600/50 nm utslipp). Bruk av full kraft 561 nm laser til å bleke bakgrunn fluorescens av membraner for 10 ~ 20 sek med rullefeltet i "AOTF pad" (se 3.1.4).
    5. Begynn bilde oppkjøpet ved å klikke på "Kjør nå" -knappen i den røde kanalen (561 nm full effekt, satt til 10 ms / ramme i "kamera" innstilling tab) med samtidig 405 nm laser aktivering. Juster 405 nm laser intensitet for å aktivere romlig atskilte punkteri hver ramme.
      MERK: Som anskaffelses utbytte, un-konvertert mEOS3.1-PH PLC δ1 molekyl nummer langsomt avtar. Øk gradvis 405 nm laser kraft for å optimalisere enkelt molekyl signal. The Imaging Acquisition lengde avhenger av eksperimentelle formål. Hente bilder kontinuerlig i fem minutter under normale forhold. Hvis en lengre oppkjøp er nødvendig, samle flere bilde stabler i stedet for en enkelt, stor bildestakk. Filstørrelsen på hvert bilde stabel bør ikke overstige 4 GB eller det vil påvirke programvare analyse senere.

4. SMLM Bildebehandling og Reconstruction

  1. Overfør bildefiler (.tif bildestakker) til en bildeanalyse stasjon. Start bilde rekonstruksjon program (custom-skrevet) i Matlab som beskrevet tidligere 37 og laste bildet stabelen ved å klikke på "File" fanen i hovedmenyen, deretter "åpne", deretter "ny fil".
  2. Identifisere og locagående stabiliserer enkelte molekylære hendelser fra hver ramme. Satt filtrering intensitet terskel med et terskelnummer (1-10) i "wavelet". Kontroller de optimale parameterinnstillingene for punkt deteksjon visuelt før gjenoppbyggingen. Deretter går du til "PALM" og klikk "ett skritt prosess" for å starte bilde gjenoppbygging.
    MERK: Intensitet terskel for punkt deteksjon er vilkårlig, og avhenger av personlig erfaring. Flere studier kan være nødvendig for å generere en optimal deteksjonsgrensen som verken tar for mange ukvalifiserte (dim) peker heller ikke filtrerer ut for mange kvalifiserte (lyse) poeng. Justere andre parametere for å optimalisere dataanalyse. Her er nabolaget avstand (fluorescens punkter i nabo rammer innenfor en avstand kombineres) satt som 65 nm (1/2 pixel bredde) og utstyrt som et enkelt molekyl. Gap rammer (enkelte molekyl hendelser som fant sted innenfor disse rammene og nabolag avstand ble kombinert og utstyrt som et enkelt molekyl hendelse) erangitt som 26 rammer (1,3 sek) for PAmCherry1 bildebehandling 40. Juster disse parameter i henhold til egenskapene til enkelt molekyl sonder og oppkjøp hastighet for å unngå over telle 40 i SMLM. Påfør korreksjon av drifting med fluoriserende perler i løpet av rekonstruksjoner.
    1. For bildebehandling de faste membraner merket med iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1, rekonstruere hele bildestakker fra samme membran i en enkelt super-oppløsning 37.
    2. For levende celle prøver merket ved mEOS3.1-PH PLC δ1, separere hele bildet stabelen i flere mindre stabler av 1,000 rammer, slik at 1000-rad-ramme stabelen blir rekonstruert som en ett super-oppløsning, som har en tidsmessig oppløsning av 10 sek. Til slutt, kombinere alle de tidsseriebilder i den endelige tidsserier stabelen 23.
      MERK: I levende celle PALM bildebehandling, kan et lite antall aktiverte prober flytte eller distanserefra PI (4,5) P 2 i PM før bleking. Å ta hensyn til oversampling av sondene, kombinere individuelle molekyl signaler i nabo rammer innenfor 130 nm (i stedet for 65 nm) i en enkelt utslipp hendelse i løpet bildeanalyse.
  3. Etter å ha fått de rekonstruerte bilder, gjennomføre ytterligere bildeanalyse med spesial skrevet program i Matlab for å kvantifisere molekyl tetthet, mikro-domene tetthet / størrelse, og cluster analyse med par-korrelasjon 41.

Representative Results

Lokaliseringen usikkerhet (σ) av vår super-oppløsning system er 14,73 nm 23. Direkte sammenligninger mellom TIRF og Palm bildene viser en signifikant forbedring av romlig oppløsning. 3A-B viser representative PI (4,5) P 2 TIRF bilder merket med PI (4,5) P 2 antistoff og iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 i typiske membraner og levende celler. Bildene med konvensjonell TIRF mikros i membraner er bemerkelsesverdig lik de i intakte levende celler merket med den forbedrede grønn fluorescens protein (EGFP) merket PH domener (EGFP-PH PLCδ1) (figur 3C). Alle prøver viste en jevn fordeling av prober. I motsetning til ikke-optimal fiksering av prøvene resulterte i skarp tett PI (4,5) P 2 klynger og en reduksjon i signalintensitet (figur 4). Under optimale festeforhold, than super oppløsning av PI (4,5) P 2 i fikserte celler (figur 5) viste en homogen fordeling av sondene i en betydelig del av PM med bare begrenset konsentrasjonsgradienter. Noen membran flekker anriket med PI (4,5) P 2 prober ble tynt fordelt og hadde forskjellige størrelser. Live-celle PALM bildene viser en tilsvarende romlig fordeling som anleggs celler (figur 6). Detaljert analyse av PI (4,5) P 2 signaler over tid fører til raske dynamikken i lokale områder, uten vesentlige endringer av sin overflod i brede områder.

Figur 1
Figur 1. Skjema for fluorescerende prober som brukes i denne studien. (AB) iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 probe brukes i de faste eksperimenter membran ark. Under konvensjonelle TIRF imaging (A), en 640 nm laser brukes til å opphisse iRFP (Ex: 692 nm; Em: 713 nm). TIRF bilde tatt i denne tilstanden fungerer som en TIRF referansebilde for super oppløsning bildebehandling oppnås ved PALM imaging (B). En 405 nm laser brukes til foto aktivere PAmCherry1 fluoroforen og en 561 nm laser brukes til å opphisse PAmCherry1 (Ex: 564 nm; Em: 595 nm) for PALM bildebehandling. (CD) mEos3.1-PH PLCδ1 probe anvendt i de levende celleforsøk. (C) Under vanlig TIRF imaging, er en 488 nm laser brukes til å opphisse mEOS3.1 (Ex: 506 nm; Em: 519 nm). (D) Etter photoconversion av en 405 nm laser, slår mEos3.1 inn i den røde form (Ex: 573 nm; Em: 584 nm). Og en 561 nm laser brukes for PALM oppkjøp Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

s / ftp_upload / 54466 / 54466fig2.jpg "/>
Figur 2. Reaksjonsskjema for membranarket preparat fra Ins-1-celler. (A) Plasser dekkglass med dyrkede celler som vender ned på en PDL-belagte dekkglass og vente på 7 ~ 10 minutter ved 4 ° C for å tillate cellefesting til PDL- belagt dekkglass. (B) Ta av toppdekkglass med pinsett og fikse membran festet til PDL pre-belagt dekkglass. (C) Bilde prøvene med TIRFM og PALM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. PI (4,5) P to romlige organiseringen er lik mellom membraner og intakte levende celler under vanlig TIRF mikroskop. (A) Atypisk TIRF bilde av membraner fiksert ved 4 ° C med 4% PFA og 0,2% GA. PI (4,5) P-2 ble merket med PI (4,5) P-2 spesifikt antistoff. (B) En membran ark fra INS-en celle som uttrykker iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1. (C) TIRF bilde av to intakte levende celler som uttrykker EGFP-PH PLCδ1 på ulike nivåer. Skala barer: (A): 3 mikrometer; (B) og (C). 5 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. PI (4,5) P to romlig organisasjon i membraner er følsomme overfor vanlige festeforhold. (A) Membran ark fast ved 37 ° C med 4% PFA aleneog merket med PI (4,5) P-2 spesifikt antistoff (som i figur 3A). (B) Membran ark fast ved RT med PFA alene og merket med PI (4,5) P-2 spesifikt antistoff. Legg merke til at den tette klynger av PI (4,5) P 2 prober er tydelige under TIRF mikroskop, i motsetning til de mye mer med fluorescens bilder vist i figur 3A. Skala barer: AB:. 3 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. PALM avbildning av PI (4,5) P 2 prober avslører deres nanometer skala distribusjon i en INS-en celle PM. (A) iRFP TIRF bilde av en membran fra en INS-en celle som uttrykker iRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1. (B) Tilsvarende PALM bilde av PM i samme region basert på PAmCherry1 signal gjenoppbygging. Legg merke til den homogene PI (4,5) P to romlige fordelingen i store PM regioner og flere PI (4,5) P 2 mikroområder. (C) Et forstørret riss av den eske regionen i (B). Pilene viser tynt fordelt PM mikroområder beriket med PI (4,5) P 2 prober. Skala barer: A og B: 3 mikrometer; C: 500 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. PALM bildebehandling i levende INS-1 celler. (A) TIRF bilde av PI (4,5) P 2 i en live INS-en celle som uttrykker mEos3.1-PH PLCδ1. Bildet ble raskt kjøpt opp i den grønne kanalen før PALM oppkjøp (35 ° C). (B) sekvensielle levende celle PALM bilder med 10 sek intervall. Innfellinger viser intensitets profiler av den lokale PI (4,5) P 2 tetthet langs den samme rette linje en posisjon til forskjellige tider i (B) og (C). Merk sine store lokale intensitet endringer innen 10 sek. (D) Tidsforløp av den gjennomsnittlige intensitetsforandringer PI (4,5) P 2 i det store området (BOX2, 3x3 um) og små sirkler (3, 4, og 5, 500 nm diameter) i (B) i løpet av fem min av PALM imaging (ramme / 10 sek). Legg merke til den raske intensitetsvariasjoner av lokal PI (4,5) P 2 sonder (sirkel 3, 4 og 5) sammenlignet med meget små endringer i bredt område (boks 2). (E) Forstørret PALM bilder av BOX2 regionen i (B) på angitte tider. Pilene viser PI (4,5) P 2 beriket membran flekker under physiological forhold. Skala barer: C: 3 mikrometer, E: 500 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

For feilsøking, to prosesser trenger ekstra oppmerksomhet: membran produksjon og prøve fiksering. Som beskrevet i protokollen, er det inkubasjonstid på objektglassene i trinn 1.1.6 viktig for membranarket produksjon. Optimal inkubasjonstid i henhold til vårt eksperimentelle betingelse er 7-10 min (figur 2). Lenger enn 10 min inkubasjon vil produsere intakte celler i stedet for membraner i PDL-dekkglass og kortere inkubasjonstid vil føre til mindre eller ingen membran ark på PDL-belagte dekkglass. Som beskrevet i protokollen, den fiksativer og temperatur under fiksering er kritisk for å opprettholde den PI (4,5) P 2 fordeling i pm. Fiksering ved RT eller bruk av 4% -PFA alene kan forvrenge normal lipid fordelingen i PM.

Ved å bruke PALM mikros til membran lipid forskning, er vi i stand til å observere nanometer skala distribusjon av PI (4,5) P 2, en nøkkel phosphoinositide som formidler mnoen grunnleggende cellulære aktiviteter. Denne romlige fordelingen av PI (4,5) P 2 med begrensede konsentrasjons gradienter i INS-1 celler gir et rammeverk for å tenke nytt lipid-protein interaksjoner og lokale signal hendelsene i PI (4,5) P 2 i disse cellene. Videre kan metoder som er utviklet i dette arbeidet også anvendes for andre membranfosfolipid forskning med passende prober, for derved, å tilby nye verktøy for å studere phosphoinositides i biologiske prosesser.

Bruk av membraner i dette arbeidet omgår to store bekymringer i fosfolipid morfologiske studier: vaskemiddel behandling og potensielle signal forurensning fra cytosol. Vaskemidler ofte føre clustering og betydelig tap av PM fosfolipid signal. Forurensning av cytosolisk signal er spesielt problematisk når det gjelder lav overflod phosphoinositides på PM 23, for eksempel PI (3,4,5) P3 og PI (3,4) P-2. Membranen plateprøvene er i stand til å sirkuleremvent disse problemene uten i vesentlig grad å forstyrre strukturer forbundet med plasmamembranen, så som kortikal aktin nettverket og det klatrin-belagte groper 42,43. Den relative homogene fordeling av PI (4,5) P 2 i PM er i god overensstemmelse med andre raske frysing EM studier ved hjelp av GST-PH PLC δ1 sonder i fibroblast membran 44.

Det er viktig å merke seg at feil utvalgets behandling som kan danne misvisende resultater. For det første er det viktig å utføre festetrinn ved en lavere temperatur (4 ° C) og bruke den fiksativ GA for membranarket produksjon. Som vist i figur 3, er varm temperatur og PFA fiksering uten GA ikke er tilstrekkelig til å feste phosphoinositides i cellen PM. Dette kan forvrenge intakt PI (4,5) P 2 distribusjon og generere skarpe klynger som ikke er observert i levende celler under fysiologiske forhold. For det andre, bruk av PAmCherry1 somden SMLM sonde, snarere enn andre sonder, er avgjørende for kvantitativ PALM bildebehandling. Fordelen med PAmCherry1 søknaden kommer fra sine veldefinerte enkle molekylære foto fysiske egenskaper 35,40,45, som lysstyrke, høy fotoaktivering effektivitet og mest av alt, svært begrenset foto blinke. Disse egenskapene gjør oss i stand til å eliminere potensielle klase gjenstander fra foto blinker og kvantitativt analysere molekylær tetthet av membran PI (4,5) P 2.

Denne tilnærmingen har også sine begrensninger. For det første kan membranen arket fremgangsmåten anvendt i denne studien ikke fullt ut etterligner den fysiologiske fordelingen av PI (4,5) P 2 fordi cellen blir forstyrret før avbildning. Imidlertid viser vår live PALM bildebehandling lignende relativt homogen fordeling av PI (4,5) P 2, støtter resultatene observert med membran ark prøver. For det andre, som vi diskuterte i vår tidligere arbeid 23, krever SMLM Ekspertise og ekstra påtention å unngå bilde gjenstander som kan oppstå fra forskjellige prosesser, inkludert sondene brukes, prøveopparbeidelse og feste, bilde prøvetaking og gjenoppbygging. Til slutt, selv om PH domenebaserte prober og antistoffer er blitt mye brukt i fosfoinositid studier 46,47 er det fortsatt mulig at ikke alle PI (4,5) P 2 i membranen kan detekteres ved denne fremgangsmåten. For eksempel kan PI (4,5) P-2 bundet til andre endogene proteiner ikke være tilgjengelig for PH-prober eller antistoffer, og dette kan føre til en undervurdering av PI (4,5) P-2 på grunn av den plass hindring av sonde seg selv. En alternativ måte å merking PI (4,5) P 2 ville være med Top-Fluor PI (4,5) P 2 48, en pre-merket PI (4,5) P 2 analog med en modifikasjon på halen av originale PI (4,5) P 2. Imidlertid kan den omdannes hurtig til andre undertyper av fosfoinositid rask levende cellemetabolisme siden inositol ingen er den samme som endogenous PI (4,5) P 2. Dette reiser bekymring om denne pre-merket PI (4,5) P 2 analoge i levende celler kan trofast representere PI (4,5) P 2 snarere enn sine metabolske produkter. Derfor, til tross for noen begrensninger, PH domene basert sonder er fortsatt blant de beste sonder som har blitt mye brukt til å overvåke PI (4,5) P 2 fordeling og dynamikk på PM av celler.

Den fremtidig anvendelse av denne metoden kan utvides til andre phosphoinositide studier, for eksempel PI (3,4,5) P3 og PI (3,4) P-2. Oppsummert romanen SMLM tilnærmingen som brukes her åpner nye måter å studere phosphoinositide i celler. Bruke PI (4,5) P 2 som et eksempel viser vi de unike egenskapene til PALM bildebehandling i den morfologiske og kvantitativ studie av cellemembranmolekyler, samt sine ulemper. Denne tilnærmingen kan tilpasses til andre molekyler steder og vil ha brede programmer i cellebiologi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope Nikon Ti-U
sCMOS camera Andor Neo
Spinning disk Yokogawa CSU X-1, 10,000 rpm 
High Power Monolithic Laser Combiner SP with 405, 488, 561 and 642 nm lasers. Agilent MLC400 laser original powers & powers at the end of optical fiber)
405 nm: 15 mW & 13 mW;
488 nm: 45 mW & 42 mW;
561 nm: 45 mW & 40 mW;
640 nm: 35 mW & 16 mW.
100X Objective Nikon APO 100X Oil, NA 1.49, WD 0.12 mm
Nikon acquisition and analysis software (NIS Element) Nikon
Matlab MathWorks
Coverslip Warner 64-0714 Round 18 mm coverslip, #1.5
Fibronectin Millipore FC010-5MG
Lipofectamin 3000 (transfection reagent) Invitrogen L3000-008
Glutaraldehyde Electron Microscopy Science #16120
PI(4,5)P2 1st antibody Santa Cruz sc-53412
secondary antibody  F(ab’)2-goat-anti-mouse Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21237
Tetraspeck beads Invitrogen T7279
magnetic quick release imaging chamber  Warner Instruments Cat#641994
temperature controller Warner Instruments TC-344C
Poly-D-Lysine Sigma P6407
Phosphate buffer saline Sigma P4417-100TAB
EGTA Sigma 3780
NH4Cl Sigma A0171
Goat serum Sigma G9023
bovine serum albumin Sigma A7906
NaCl Sigma S5886
KCl Sigma P5405
CaCl2•2H2O Sigma 223506
MgCl2•6H2O Sigma M9272
Glucose Sigma G7021
HEPES Sigma H4034
Paraformaldyhyde Sigma P6148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443, 651-657 (2006).
  2. Hammond, G. R. V., et al. PI4P And PI(4,5)P(2) Are Essential But Independent Lipid Determinants Of Membrane Identity. Science. 337, New York, N.Y. 727-730 (2012).
  3. Nakatsu, F., et al. PtdIns4P synthesis by PI4KIIIalpha at the plasma membrane and its impact on plasma membrane identity. J Cell Biol. 199, 1003-1016 (2012).
  4. Cantley, L. C. The phosphoinositide 3-kinase pathway. Science. 296, 1655-1657 (2002).
  5. Czech, M. P. Dynamics of phosphoinositides in membrane retrieval and insertion. Annu Rev Physiol. 65, 791-815 (2003).
  6. Spira, F., et al. Patchwork organization of the yeast plasma membrane into numerous coexisting domains. Nat Cell Biol. 14, 640-648 (2012).
  7. Barg, S., Knowles, M. K., Chen, X., Midorikawa, M., Almers, W. Syntaxin clusters assemble reversibly at sites of secretory granules in live cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 20804-20809 (2010).
  8. Sieber, J. J., et al. Anatomy and dynamics of a supramolecular membrane protein cluster. Science. 317, 1072-1076 (2007).
  9. Knowles, M. K., et al. Single secretory granules of live cells recruit syntaxin-1 and synaptosomal associated protein 25 (SNAP-25) in large copy numbers. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 20810-20815 (2010).
  10. Milosevic, I., et al. Plasmalemmal phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate level regulates the releasable vesicle pool size in chromaffin cells. J Neurosci. 25, 2557-2565 (2005).
  11. van Rheenen, J., Jalink, K. Agonist-induced PIP(2) hydrolysis inhibits cortical actin dynamics: regulation at a global but not at a micrometer scale. Mol Biol Cell. 13 (2), 3257-3267 (2002).
  12. Hammond, G., Schiavo, G., Irvine, R. Immunocytochemical techniques reveal multiple, distinct cellular pools of PtdIns4P and PtdIns (4, 5) P2. Biochem J. 422, 23-35 (2009).
  13. Huang, S., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate-rich plasma membrane patches organize active zones of endocytosis and ruffling in cultured adipocytes. Mol Cell Biol. 24, 9102-9123 (2004).
  14. James, D. J., Khodthong, C., Kowalchyk, J. A., Martin, T. F. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate regulates SNARE-dependent membrane fusion. J Cell Biol. 182, 355-366 (2008).
  15. Laux, T., et al. GAP43, MARCKS, CAP23 modulate PI(4,5)P(2) at plasmalemmal rafts, and regulate cell cortex actin dynamics through a common mechanism. J Cell Biol. 149, 1455-1472 (2000).
  16. Aoyagi, K., et al. The activation of exocytotic sites by the formation of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate microdomains at syntaxin clusters. J Biol Chem. 280, 17346-17352 (2005).
  17. Kabachinski, G., Yamaga, M., Kielar-Grevstad, D. M., Bruinsma, S., Martin, T. F. CAPS and Munc13 utilize distinct PIP2-linked mechanisms to promote vesicle exocytosis. Mol Biol Cell. 25, 508-521 (2014).
  18. Wang, J., Richards, D. A. Segregation of PIP2 and PIP3 into distinct nanoscale regions within the plasma membrane. Biol Open. 1, 857-862 (2012).
  19. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19, 780-782 (1994).
  20. van den Bogaart, G., et al. Membrane protein sequestering by ionic protein-lipid interactions. Nature. 479, 552-555 (2011).
  21. van Rheenen, J., Achame, E. M., Janssen, H., Calafat, J., Jalink, K. PIP2 signaling in lipid domains: a critical re-evaluation. Embo J. 24, 1664-1673 (2005).
  22. Sato, K., et al. Differential requirements for clathrin in receptor-mediated endocytosis and maintenance of synaptic vesicle pools. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 1139-1144 (2009).
  23. Ji, C., Zhang, Y., Xu, P., Xu, T., Lou, X. Nanoscale Landscape of Phosphoinositides Revealed by Specific Pleckstrin Homology (PH) Domains Using Single-molecule Superresolution Imaging in the Plasma Membrane. J of Biol Chem. 290, 26978-26993 (2015).
  24. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  25. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
  26. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
  27. Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, spectrin, and associated proteins form a periodic cytoskeletal structure in axons. Science. 339, 452-456 (2013).
  28. Wombacher, R., et al. Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates. Nat Methods. 7, 717-719 (2010).
  29. Szymborska, A., et al. Nuclear pore scaffold structure analyzed by super-resolution microscopy and particle averaging. Science. 341, 655-658 (2013).
  30. Pertsinidis, A., et al. Ultrahigh-resolution imaging reveals formation of neuronal SNARE/Munc18 complexes in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 2812-2820 (2013).
  31. Shim, S. -H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proc Natl Acad Sci. 109, 13978-13983 (2012).
  32. Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
  33. Balla, T., Várnai, P. Visualization of Cellular Phosphoinositide Pools with GFP-Fused Protein-Domains. Curr Protoc Cell Biol. 24, 24 (2009).
  34. Xu, C., Watras, J., Loew, L. M. Kinetic analysis of receptor-activated phosphoinositide turnover. J Cell Biol. 161, 779-791 (2003).
  35. Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nat Methods. 6, 153-159 (2009).
  36. Filonov, G. S., et al. Bright and stable near infra-red fluorescent protein for in vivo imaging. Nature Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
  37. Zhang, M., et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins. Nat Methods. 9, 727-729 (2012).
  38. Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49, 424-430 (2000).
  39. Dyachok, O., Isakov, Y., Sågetorp, J., Tengholm, A. Oscillations of cyclic AMP in hormone-stimulated insulin-secreting β-cells. Nature. 439, 349-352 (2006).
  40. Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 18519-18524 (2013).
  41. Sengupta, P., et al. Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis. Nat Methods. 8, 969-975 (2011).
  42. Morone, N., et al. Three-dimensional reconstruction of the membrane skeleton at the plasma membrane interface by electron tomography. J Cell Biol. 174, 851-862 (2006).
  43. Peters, K. R., Carley, W. W., Palade, G. E. Endothelial plasmalemmal vesicles have a characteristic striped bipolar surface structure. J Cell Biol. 101, 2233-2238 (1985).
  44. Fujita, A., Cheng, J., Tauchi-Sato, K., Takenawa, T., Fujimoto, T. A distinct pool of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in caveolae revealed by a nanoscale labeling technique. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 9256-9261 (2009).
  45. Durisic, N., Laparra-Cuervo, L., Sandoval-Álvarez, Á, Borbely, J. S., Lakadamyali, M. Single-molecule evaluation of fluorescent protein photoactivation efficiency using an in vivo nanotemplate. Nat Methods. 11, 156-162 (2014).
  46. Thomas, C. L., Steel, J., Prestwich, G. D., Schiavo, G. Generation of phosphatidylinositol-specific antibodies and their characterization. Biochem Soc Trans. 27, 648-652 (1999).
  47. Várnai, P., Balla, T. Live cell imaging of phosphoinositides with expressed inositide binding protein domains. Methods. 46, 167-176 (2008).
  48. Honigmann, A., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate clusters act as molecular beacons for vesicle recruitment. Nature Struct Mol Biol. 20, 679-686 (2013).

Tags

Biokjemi Super-Resolution Imaging PALM phosphatidylinositol 4,5-bisfosfat (PI (4,5) P2) cellemembranen ark phosphoinositide betaceller
Single-molekyl Super-Resolution Imaging of phosphatidylinositol 4,5-bisfosfat i plasmamembranen med Novel fluorescerende prober
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ji, C., Lou, X. Single-molecule… More

Ji, C., Lou, X. Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes. J. Vis. Exp. (116), e54466, doi:10.3791/54466 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter