Introduction
A corto raggio (in tandem) splicing alternativo, in cui si alternano i siti accettori o donatori sono in stretta vicinanza l'uno all'altro, è comune nei mammiferi, invertebrati 1 2 e 3 piante. Si stima che il 20% dei geni dei mammiferi contiene siti di splicing alternativi 2-12 nucleotidi Apart 4. Molti di questi siti sono 3 nucleotidi a parte e risultato in inclusione o l'esclusione di un singolo codone. C'è dibattito sulla natura del regolamento splicing in questi siti 5,6 con alcuni sostenendo che le differenze motivo splicing sono così sottili che la selezione è stocastico 7, mentre altri dedurre regolamentazione basata sul tessuto specificità 8.
Tandem scelta del sito di splicing è stato analizzato semi-quantitativa utilizzando modificato elettroforesi capillare 7, e ad alta risoluzione elettroforesi su gel 8. RNA-Seq (RNA sequencing) legge può essere usato per quantificare i rapporti di splicing in ciascuna giunzioneluogo. In questo modo, i dati RNA-Seq ha fornito informazioni nella regolamentazione dei siti di splicing tandem 9. Essa ha anche permesso la previsione di rapporti di variante di splicing previsti in base nucleotidica motivo 10. La maggior parte del enfasi su splicing che include o esclude un singolo codone è stato sulle più comunemente si verificano splice siti accettori tandem, noti come NAGNAGs (dove N = qualsiasi nucleotide).
Tandem donatori siti di splicing alternativo includendo o escludendo un singolo codone (motivo riconoscimento GYNGYN, dove Y = pirimidina) sono meno comuni di accettori tandem. Trasduttore di segnale e attivatore di trascrizione 3 (STAT3) è un gene chiave in fase di tandem donatore splicing alternativo 1,11. I siti tandem donatore di splicing uniscono esoni 21 e 22 e determinano l'inclusione o l'esclusione del codone per serina-701 (S o ΔS rispettivamente) 1,11. A valle siti accettori alternativi (40 nucleotidi di distanza gli uni dagli altri) esoni giunzione 22 e23a / b risultato nell'inclusione sia dei 55 residui terminali del dominio di transattivazione (α) o di un dominio di transattivazione troncato con 7 residui C-terminale unici (beta) 11. Pertanto, quattro varianti di splicing sono possibili.
Proteina STAT3 è un fattore di trascrizione e importante integratore di segnale in numerosi tipi di cellule 12 e quando mutato la sua attivazione costitutiva contribuisce a diversi fenotipi tumorali (recensito in riferimento 13). Sindrome di lavoro, una malattia da immunodeficienza caratterizzata da elevati livelli di IgE, è anche causata da mutazioni nel STAT3 (recensione in riferimento 14). Ruoli distinti per α STAT3 e proteine β giunzione variante sono stati precedentemente descritto 15. Inizialmente, STAT3 β è stato pensato per agire in modo dominante negativo 16, inimicarsi l'attività trascrizionale di STAT3 di α, ma il lavoro successivo suggerito ha geni bersaglio indipendenti 17 18), ma un recente studio suggerisce che STAT3 S e ΔS varianti di splicing sono entrambi necessari per la vitalità di STAT3-addicted diffuso a grandi cellule B linfoma (DLBLCL) cellule 19. La rilevanza biologica rimane da esplorare. Dato che la composizione di splicing variante potrebbe influenzare la funzione, abbiamo cercato di scoprire se il rapporto è stato turbato dalla stimolazione di citochine in eosinofili.
Inizialmente abbiamo cercato di esplorare il collegamento tra i due eventi di splicing tramite PCR specifico per α STAT3 e varianti di splicing β, seguita dalla scissione di prodotti con un enzima di restrizione specifica per le varianti di splicing S, AFEI. La densitometria dei prodotti indicati inclusione di Ser701 era rdi allenamento intenso e dieci volte più comune di quanto la sua omissione (ΔS) in entrambi i α STAT3 e β (dati non riportati). Tuttavia, questo approccio semi-quantitativo non era sufficientemente riproducibile, e non può essere utilizzato efficacemente per misurare tutti e quattro splice varianti simultaneamente. Per analizzare proporzioni di ciascuna delle quattro varianti di splicing, era necessario stabilire un protocollo PCR quantitativa (qPCR) che ha dato stretti tecnici (diversi dosaggi di un dato campione) replica.
Relativa qPCR si basa sul confronto di un gene di interesse per un gene standard o di pulizia noti per essere espresso in un determinato livello 20 ed è appropriata quando il gene di interesse e gene housekeeping vengono amplificati con efficienza simile. Un filamento (ds) fluorescente (cianina) dye doppio legame al DNA si lega alla PCR ampliconi 21, e dopo un certo numero di cicli di amplificazione sufficiente è verificata a fluorescenza per essere rilevabili. Più alto è il livello inizialedella trascrizione, minore è il valore di ciclo soglia (Ct). Poiché la concentrazione di preparazioni di cDNA differisce, bisogna confrontare la concentrazione del trascritto con la concentrazione di una trascrizione noto per essere espressa ad un livello costante in tutti i campioni, come glucuronidasi-β (GUSB) in eosinofili 22.
Relativa qPCR non è fattibile per sequenze altamente simili, come si vede nella varianti di splicing derivanti dal tandem splicing. Le rigorose condizioni necessarie per amplificare specificamente le varianti di splicing risultato in diminuzione dell'efficienza. Invece, la quantificazione assoluta deve essere utilizzato 23. Questo comporta la preparazione di una curva standard con concentrazioni note di trascrizione impiombato di interesse, e assicurando condizioni di PCR ottimizzare specificità 24. Come descritto, i dati assoluti e relativi qPCR per un particolare gene possono essere uniti per informare comprensione dell'espressione del gene in un particolare tipo di cellula, inquesto caso STAT3 in eosinofili variamente stimolati 25.
Qui, STAT3 splice variante quantificazione è descritto con l'aspettativa che il metodo può essere adattato a studi mirati di altri eventi tandem splicing. Ottimizzazione era un processo lungo, dove diverse coppie di primer a varie concentrazioni e numerose iterazioni di parametri ciclismo sono stati testati nel corso di pochi mesi. Le caratteristiche principali del protocollo sono di validazione fondo specificità e la quantificazione in base a curve standard con concentrazioni note delle varianti di splicing. qPCR Relativa congiuntamente dimostrato utile per la nostra applicazione, ma non è necessario.
Protocol
NOTA: eosinofili nel sangue periferico sono stati ricevuti senza identificare le informazioni in accordo con un protocollo approvato (# 2013-1570) dalla University of Wisconsin-Madison Center for Health Sciences Institutional Review Board. Firmata consenso informato del donatore è stato ottenuto per l'uso di ciascun campione nella ricerca.
1. La creazione di plasmidi come Modello Standard
- Crea primer per un amplicone che abbracciano entrambi i siti di splicing STAT3, con 5'- siti KpnI e NheI di restrizione (e 5'-estensioni) come da Tabella 1 bis.
NOTA: sono stati scelti i siti KpnI e NheI per consentire inserti di essere legata in un vettore che accetta animali 28a modificato con resistenza alla kanamicina 25,26 sito KpnI era stato aggiunto nel sito di clonazione multiplo.. - Utilizzando eosinofili appena donati, preparare campioni duplicate di 2,5 x 10 6 cellule / ml nel terreno di coltura cellulare (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640). Incubare per 1 ora a 37 ° C sotto 5% di CO 2 e il 10% di umidità.
- Preparare complementare (c) il DNA da campioni (almeno 1 x 10 6 cellule per la preparazione) secondo le istruzioni del costruttore, utilizzando l'estrazione di RNA e kit di sintesi del DNA.
- Da modello cDNA preparato al punto 1.2.1, amplificare STAT3 giunzione varianti utilizzando l'amplificazione PCR come da tabella 2a.
- Risolvere ampliconi a 2% agarosio Tris-acetato-etilendiamminatetraacetato (TAE) Gel 27. bande accise dal gel e purificare in base alle istruzioni del kit di gel di escissione.
- Ampliconi taglio e plasmide con opportuni enzimi di restrizione (panoramica di restrizione di riferimento 27), utilizzando volumi, tempi di incubazione e le temperature consigliate dal fornitore degli enzimi; e purificare come al punto 1.4. Legare ampliconi ristrette in plasmide in condizioni di provider raccomandato.
- Preparare una cont negativorol (DNA plasmide limitato senza inserto ma con ligasi) e un controllo positivo (plasmide senza restrizioni con resistenza alla kanamicina). Eseguire trasformazioni plasmide standard di E. competente coli DH5α 28 utilizzando miscele legatura 27.
- Incubare trasformato E. coli in 1 ml di Luria-Broth (LB) medio (preparato come indicato 27) agitazione per 1 ora a 37 ° C. trasformanti Diffusione su piastre LB contenenti 50 mg / ml kanamicina e incubare a 37 ° C durante la notte.
- Scegliere diverse colonie dalle α STAT3 e piastre di STAT3 beta usando gli stuzzicadenti sterili 27. Trasferimento ciascuno per 2 ml LB. Grow culture notte a 37 ° C in un incubatore agitazione.
- Purificare plasmidi da colture batteriche seguendo le istruzioni fornite in un kit di purificazione del DNA. plasmidi conservare a -20 o -80 ° C.
- plasmidi sequenza di diverse colonie di preparazione 20 microlitri reazioni di sequenziamento. pipetta 3tampone di reazione di sequenziamento ml, 2 ml mix di reazione di sequenziamento, acqua ultrapura 12 ml, 1 ml plasmide come modello e 2 ml di sequenziamento primer.
NOTA: Se si utilizza PET-28a vettoriale, utilizzare il sequenziamento di primer 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG-3 '.- Valutare electrophoretograms di plasmidi che codificano per ogni variante: Sα, Sβ, ΔSα e ΔSβ 25.
- la concentrazione Misura del DNA plasmide puro in ng / ml. Se la lettura di assorbanza a 260 nm utilizzando uno spettrofotometro, calcolare la concentrazione del DNA utilizzando la legge di Beer-Lambert 29:
Dove c = concentrazione, A = assorbanza, ε (coefficiente di estinzione) = 0,02 (mg / ml) -1 cm -1 per doppia elica del DNA e L = Lunghezza del percorso della luce (di solito 1 cm). - Utilizzando i pesi molecolari di STAT3 giunzione variante cDNA amplicons e il vettore, calcolare il numero di copie per ml.
NOTA: Peso molecolare per coppia di basi (bp) è stimato in 650 Da.
2. Analizzando Primer Specificità per Absolute qPCR
- Preparare 1 a 10 serie di diluizioni di plasmidi STAT3, con ~ 10 8 a 10 3 copie per ml (20 l) con acqua ultrapura. La concentrazione di misura più concentrati (~ 10 8 copie per ml, vedere il punto 1.11).
- Utilizzare plasmidi diluito per preparare quattro miscele "non bersaglio" (cioè., STAT3 ΔSβ controllo negativo contenente uguali concentrazioni di STAT3 Sα, ΔSα, Sβ ma non ΔSβ) a 10 6 copie per ml ciascuna. Preparare un mix "bersaglio" con uguali concentrazioni di tutti e quattro i modelli ogni 6 a 10 copie per ml.
- Preparare la soluzione coppia di primers per ogni variante di splicing (vedi Tabella 1B e Figura 1) facendo ~ 60 ml di primer ciascuno al 7 concentrazione uM (concentrazione finale nel campione sarà 560 nm).
- Diluire DNA polimerasi / dsDNA vincolante mix colorante 7: 5 con puro H 2 O.
- Impostare Assay 1 in una piastra a 96 pozzetti PCR come mostrato in template (Tabella 3).
- Aggiungere 21 ml diluito DNA polimerasi / dsDNA vincolante mix colorante, poi 2 pl di miscela di primer e 2 ml di modello (come da Tabella 2b). Invece di template, aggiungere 2 ml filtrati H 2 O al controllo no template (NTC) bene. Reazioni allestito in duplice copia per valutare la ripetibilità 30.
- piastra di tenuta qPCR con copertura adesiva e centrifugare per 5 min a 1200 xga 12 ° C.
- Se si utilizza software elencato sulle sostanze, istituito esperimento come descritto.
- Accendere la macchina qPCR e inserto sigillato piatto qPCR. Fare clic su File &# 62; Nuova> Avanti> Selezionare "Nuovo rivelatore", scegliere il giornalista, dissetante e fornire nome. Impostare un "nuovo rivelatore" per ogni variante di splicing.
- Selezionare Avanti e impostare norme come richiesto nella pagina di Set Up Campione Piatto, garantendo quantità sono iscritte nella tabella e rilevatori appropriati vengono selezionati. Fare clic su Fine.
- Impostare bicicletta come da Tabella 2b. Assicurarsi che la fluorescenza lettura (per determinare Ct) avviene durante la fase C 72 ° di ogni ciclo. Selezionare Esegui.
- Quando corsa è completa, fare clic sulla> scheda plot di amplificazione scheda Risultati. Valutare plot di amplificazione di uscita per valutare la qualità dei dati (cercare una trama esponenziale, come in Figura 2).
NOTA: Assicurare grafici di amplificazione sono per lo più esponenziale e che la soglia di ciclo può essere impostato nella parte esponenziale della trama. Assicurarsi NTC non sono amplificati e altri punti standard dimostrano un valore basso Ct con un alto ΔRn. - a export risulta software foglio di calcolo, fare clic su File> Esporta> Risultati.
3. Valutare assoluta qPCR Assay Specificità e ripetibilità
- ripetibilità
- Utilizzare i dati dal punto 2.7.5 per calcolare la deviazione standard di Ct (ciclo soglia per fluorescenza) valori.
Dove N = numero di campioni (2 se redatta in duplice copia),
= Ct e del campione 
= Campione Ct media. Verificare che la deviazione standard dei valori Ct dei duplicati è ≤0.2. Verificare che i valori Ct a tutti, ma i pozzi NTC sono più piccoli di 38. - Se ripetibilità è povera parametri ottimizzare bicicletta per aumentare o diminuire il tempo di ricottura.
- Utilizzare i dati dal punto 2.7.5 per calcolare la deviazione standard di Ct (ciclo soglia per fluorescenza) valori.
- Plot log copia insensibileER (come determinato nel passaggio 1.12 e preparata nella fase 2.1) vs valore Ct per creare una curva standard; ottiene il seguente equazione:
Dove Y è Ct, m è il gradiente, x è log (numero di copie) e b è il valore dell'intercetta.
NOTA: Il valore R 2 della regressione lineare sarà ≥0.95 per buoni dati. - Calcolare efficienza di amplificazione usando curva standard e l'equazione:
NOTA: Obiettivo per l'efficienza ≥75%. - Calcolare la specificità da qPCR test 1 usando la formula di troppo:
Dove bersaglio Δ Ct Troppo = Ct - Ct non bersaglio, che descrive la differenza di numero di ciclo soglia per amplificatore specifico e non specificolification
NOTA: Specificità deve superare quattro ordini di grandezza (cioè, fattore specificità ≥4.).- Se la specificità è povero, ottimizzare abbassando la concentrazione di primer. Impostare saggi (come descritto nei passaggi 2,5-2,7) con concentrazioni dei primer finali che vanno da 100 nM a 500 nM.
= Ct e del campione 
= Campione Ct media. Verificare che la deviazione standard dei valori Ct dei duplicati è ≤0.2. Verificare che i valori Ct a tutti, ma i pozzi NTC sono più piccoli di 38. 
4. L'esecuzione relativi qPCR saggi
- Il trattamento di cellule con citochine per promuovere la trascrizione.
- Per eosinofili appena donati, preparare i campioni duplicati di 2,5 x 10 6 cellule / ml nel terreno di coltura cellulare (RPMI 1640 medium) e trattare con 50 ng / ml di interleuchina-3 (IL3) e / o di 50 ng / ml fattore di necrosi tumorale α ( TNFa) per periodi di 3, 6, 9 e 20 ore a 37 ° C sotto 5% di CO 2 e il 10% di umidità.
- Preparare cDNA da campioni degli eosinofili (almeno 1 x 10 6 cellule per la preparazione) secondo le istruzioni del costruttore, utilizzando il kit di estrazione di RNA e sintesi del DNA. Preparare diluizioni seriali di due aliquote del campione di cDNA (controllo o campioni di riposo), con una gamma di diluizioni da "1" per diluizione "1 nel 1024".
- Per la 1 a 4 di diluizione, pipetta 1 ml di cDNA e 3 ml di acqua ultrapura.
- Per la diluizione 1 a 16, pipette 1 ml di 1 a 4 di diluizione e acqua ultrapura 3 ml, etc.
- Impostare PCR in piastra a 96 pozzetti con 25 microlitri reazioni come passi descritti 2,3-2,5 ma con diverse concentrazioni di primer per STAT3 pan e GUSB (vedere il modello Tabella 4).
- Aggiungi "nuovo rivelatore" per GUSB e seguire i passi 2.6-2.7, utilizzando i parametri di ciclismo descritti nella Tabella 2 quater.
- Generare curve standard (vedere i passi 3.2 e 3.3) per determinare quali concentrazioni dei primer risultato in termini di efficienza di amplificazione 95-100%.
- Impostare piastra con campioni preparati cDNA (dal punto 4.2) e le concentrazioni di primer ottimizzati(vedi Tabella 2c per i parametri di ciclismo, reagenti e Tabella 5 modello piastra da 96 pozzetti).
- Eseguire i passaggi 2,6-2,7. Ripetere il test almeno una volta e verificare la qualità dei dati.
- Calcolare il valore medio Ct di campione duplicato Cts sia per STAT3 e gene housekeeping GUSB.
- Ottenere valori Δ Ct per ogni campione.
- Designare campione di riposo (di solito ha più bassa concentrazione di trascrizione di interesse) come campione 0. Calcolare ΔΔ Ct 31 per ogni campione (qui indicato come campione X):
- Calcolare fold-aumento per ogni campione:
- Riproducibilità
- Calcolare il coefficiente di variazione (CV) del numero di copie per il pan-STAT3 e GUSB.
Dove N = numero di campioni, = numero di copie calcolata del campione e = media campionaria. Controllare che CV di ogni campione (più saggi) è ≤10%.
- Calcolare il coefficiente di variazione (CV) del numero di copie per il pan-STAT3 e GUSB.
5. Analisi assoluta qPCR dati per campioni sconosciuti
- Confronto valori Ct ottenuti in relativa qPCR (come descritto al punto 4.9) per il gene housekeeping GUSB per garantire concentrazioni di cDNA dei campioni 'sono all'interno di un ordine di grandezza.
- Diluire cDNA di conseguenza (per esempio, se il campione 1 ha un valore Ct di ~ 17,5 e valori Ct altri campioni 'sono ~ 21, il campione 1 è di circa 2 (21-17.5) = 11 volte più concentrato Eseguire un 1:. Diluizione 1 con acqua ultrapura nella stessa gamma senza diluire più del necessario).
NOTA: notevolmente differenti concentrazioni di partenza saranno pregiudizi l'analisi di regressione lineare (passo 4.12).
- Diluire cDNA di conseguenza (per esempio, se il campione 1 ha un valore Ct di ~ 17,5 e valori Ct altri campioni 'sono ~ 21, il campione 1 è di circa 2 (21-17.5) = 11 volte più concentrato Eseguire un 1:. Diluizione 1 con acqua ultrapura nella stessa gamma senza diluire più del necessario).
- Impostare saggio qPCR assoluta dei campioni. Preparare saggio Piastra modello 2a per Sα e Sβ come da Tabella 6; e preparare 2b saggio per ΔSα e ΔSβ come da Tabella 7. Effettuare test come descritto nei punti 2.6-2.7.3 (e Tabella 2b). Ripetere saggi almeno una volta.
- Controllare la qualità e l'esportazione dei dati come descritto nei punti 2.7.4-2.7.5.
- Impostare qPCR 96 pozzetti assoluto con 25 microlitri reazioni utilizzando primer pan-STAT3 (primer nella Tabella 1c, modello nella tabella 8) a 400 micron e un mix di tutti e quattro i plasmidi o un singolo plasmide a concentrazioni totali elencati.
NOTA: L'efficienza non ha importanza per assoluta qPCR, ma ottimizzando l'efficienza di questi primer è importante per la relativa qPCR (fase 4). - piastra di tenuta qPCR con copertura adesiva e centrifugare per 5 min a 1200 xga 12 ° C.
- Impostare "nuovo rivelatore" per Pan- STAT3 come nei passaggi 2.7.1-2.7.3.
- Impostare in bicicletta per Pan STAT3 come da Tabella 2c (stesse condizioni di relativa qPCR). Assicurarsi che la fluorescenza lettura (per determinare Ct) avviene durante la fase C 72 ° di ogni ciclo. Ripetere il test almeno una volta al fine di garantire la riproducibilità.
- Controllare la qualità e l'esportazione dei dati (vedere i passaggi 2.7.4-2.7.5).
- Se grafici di amplificazione non sono esponenziale (vedi figura 2), diluire cDNA campione (1,10) e ripetere test come descritto (passo 5.7).
- Utilizzando l'equazione della curva standard (vedi 3.2, figura 3) ed i valori Ct dei campioni, calcolare il numero di copie di ogni variante di splicing e di STAT3 pan in ogni campione.
- Log Plot (qPCR valori del numero di copie assoluti ottenuti per pan STAT3) vs log (qPCR valori numerici assoluti copia cumulativi per STAT3 giunzione varianti).
NOTA: regressione lineare ideale e pendenza valori sarebbero entrambi ~ 1. - Calcola ripetibilità (Passo 3.1) e riproducibilità (Step 4.13).
6. La fusione assoluta e relativa qPCR dati
- Moltiplicare la percentuale di variante con il totale STAT3 fold-aumento per calcolare fold-aumento di ogni variante di splicing.
- Calcolare le deviazioni standard (vedere il punto 3.1.1) dei valori assoluti e relativi per tenere conto di propagazione dell'errore. Determinare l'errore di misura standard (SEM), come mostrato:
Representative Results
Buone dati qPCR qualità genereranno una trama di amplificazione sigmoidale (Figura 2a), che significa esponenziale aumento di trascrizioni nel corso del ciclismo. La presenza di troppa modello può risultare in uno sfondo di fluorescenza, cioè una baseline contenuti è stabilito nei primi cicli. Se i dati non forniscono una curva esponenziale (figura 2b), ulteriore ottimizzazione è necessario (indicato dal passo 3.1 e 3.4). Per ulteriori informazioni sulla risoluzione qPCR risultati, fare riferimento al riferimento 32. Le curve standard generati per i plasmidi template calibratore indicherà l'efficienza dell'amplificazione (curva STAT3 Sα mostrato in Figura 3). Efficienze tra 83 e 95% sono state osservate nelle condizioni descritte. L'equazione per la specificità (punto 3.4) assume uguale efficienza, che è improbabile 25, così la specificitàè probabile che sia maggiore di fattore di specificità suggerisce.
Per valutare la congruenza dei livelli STAT3, sono stati misurati i valori assoluti di ciascuna delle quattro varianti di splicing nonché il livello totale STAT3, quest'ultimo utilizzando primer che amplificano una regione comune a tutte le quattro varianti di splicing (Figura 4). Idealmente la regressione lineare (indicazione di correlazione) e la pendenza (rapporto di STAT3 pan di varianti di splicing sommate) dovrebbero entrambi essere vicino a 1.
I dati assoluti qPCR sono presentati come grafici a torta per mostrare le proporzioni delle quattro varianti di splicing nel tempo post-stimolazione con citochine (figura 5a). Eosinofili Riposo (0 ore) hanno avuto la percentuale più piccola di STAT3 Sα, anche se questa variante è sempre stato il più abbondante. Moltiplicando la frazione di STAT3 varianti di β splicing (S ^6; + ΔSβ) dalla frazione di STAT3 ΔS varianti di splicing (ΔSα + ΔSβ) ha costantemente un valore inferiore al valore sperimentalmente registrato per ΔSβ. Se gli eventi di splicing erano indipendenti, ci si aspetterebbe che moltiplicando frazione del ΔS varianti dalla frazione di varianti beta darebbe un valore che è d'accordo con il valore sperimentalmente determinato. Livelli più elevati di ΔSβ del previsto da eventi di splicing indipendenti suggerisce esiste una polarizzazione co-splicing.
La fusione dei dati assoluto e relativo qPCR ha dimostrato che i livelli di tutte le varianti di splicing STAT3 aumentato post-stimolazione con citochine IL3 e TNF-alfa, con livelli di picco 6 ore post-stimolazione (Figura 5b - e). Per tre dei quattro varianti di splicing, livelli di trascrizione erano circa 3 volte superiore a eosinofili trattati IL3 + TNF-alfa (6 ore) rispetto ai eosinofili nei mediaallo stesso punto di tempo. livelli STAT3 Sα erano 3,5 volte superiore in IL3 + TNFa eosinofili trattati rispetto ai eosinofili nei mezzi a questo punto di tempo. La maggiore incertezza (grande errore standard di misura) è stato visto in ΔSβ (Figura 5e), che comprende la più piccola frazione del totale STAT3 in tutti i campioni. Ciò non è sorprendente, poiché livelli più bassi sono associati a valori Ct elevati. Richiedono più cicli per raggiungere il ciclo soglia composti incertezza dovuta a variazioni da ciclo a ciclo efficienza dell'amplificazione.
Figura 1: Schema di coppie di primer utilizzato per eseguire qPCR di varianti di splicing STAT3 e primer utilizzati per amplificare specificamente ciascuna delle varianti di splicing STAT3 (Sα, Sβ, ΔSα e ΔSβ rispettivamente) sono s-STAT3 pan.hown. Primer forward (STAT3 "S" e "ΔS") coprono la giunzione tra esoni 21 e 22. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Grafici di amplificazione di dati qPCR (a) grafici di amplificazione del sigma significa amplificazione affidabile. Questi dati sono stati ottenuti da qPCR di due diluizioni seriali di plasmide contenente STAT3 Sα, con ciascuna coppia di linee colorate rappresentano i livelli di fluorescenza di campioni duplicati diluito nel corso di 40 cicli (asse x). Il campione più concentrato (verde-grigio) è stato sufficientemente amplificato dal ciclo 17 (con la tintura proporzionale alla fluorescenza, mostrato l'asse y dsDNA-vincolante) per superare il valore di fluorescenza di soglia (BaseliNe indicato come freccia verde). Il suo valore Ct sarebbe 17. (b) piazzole non esponenziali suggeriscono che la soglia bassa fluorescenza non è stata stabilita correttamente nei primi cicli. Questo potrebbe essere dovuto alla presenza di un inibitore, o un modello altamente concentrato o primer. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Curva standard di log (numero di copie di STAT3 Sα) vs Ct Esiste una relazione lineare tra il log di numero di copie e la soglia ciclo ogni STAT3 della variante di splicing (Ct).. Creazione di una curva standard da DNA plasmidico imita il cDNA dei campioni e, quindi,fornisce una misura migliore di una curva creata da ampliconi della PCR diluito. I dati presentati sono valori Ct ottenuti da qPCR di due diluizioni seriali di plasmidi contenenti STAT3 Sα. Da questa curva, il numero di copie presenti in ciascun campione può essere interpolata, ed efficienza di amplificazione calcolato (83,9%). Anche se intercetta y- sono meno riproducibili di pendenza, l'intercetta suggerisce sarebbero necessari 42,2 cicli per essere certi non DNA bersaglio è presente. Le barre di errore indicano SEM, n = 3. curve comparabili sono state costruite per STAT3 Sβ, ΔSα e ΔSβ (non mostrato). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Confronto tra pan quantificato
Figura 5:. STAT3 livelli variante di splicing oscillato nel corso del trattamento di citochine (a) grafici a torta che indicano percentuali di ogni variante di splicing STAT3in eosinofili durante il trattamento con IL3 e TNF-alfa. (B - e) Le variazioni di varianti di splicing STAT3 in eosinofili trattati con varie combinazioni di citochine, misurata combinando i dati relativi e assoluti qPCR Sα (B), Sβ (c), ΔSα (d), e ΔSβ (e) livelli di STAT3. oscillato nel corso del tempo post-stimolazione. Livelli inizialmente aumentato, con un picco di 6 ore post-stimolazione. La combinazione IL3 + TNF suscitato più alta espressione di tutte le varianti di splicing quattro STAT3 rispetto al solo IL3. SEM calcolato per ogni punto di dati contabili per la propagazione dell'errore. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Primers utilizzati per l'amplificazione (a), assoluta (b) e relativo (c) PCR quantitativa. Primer clonazione hanno sequenze di restrizione e 5'-estensioni per il taglio efficiente. KpnI e NheI siti di restrizione sono indicati in grassetto. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa tabella.
Tabella 2. Parametri PCR in bicicletta (a sinistra) e dei volumi dei reagenti (a destra) per l'amplificazione (a), relativa (b), assoluta (c) PCR quantitativa. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa tabella.
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Tabella 3:. Modello per dosaggio calibrazione plasmide assoluta qPCR Questo dosaggio è necessario valutare la riproducibilità ed efficienza, oltre a generare curve standard da cui interpolare i dati. Le miscele "non bersaglio" darà una stima di specificità. L'ottimizzazione può essere necessario per garantire la coerenza. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa tabella.
Tabella 4:. Modello per il parente qPCR (STAT3 pan e le pulizie gene GUSB) test di calibrazione A differenza assoluta qPCR, il punto di questo test è quello di determinare le condizioni in cui l'efficienza di amplificazione è di ~ 100%.tp_upload / 54473 / 54473tbl4large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa tabella.
Tabella 5:.. Modello per relativa analisi del campione qPCR per la misurazione pan STAT3 e gene housekeeping GUSB curve standard sono ripetute insieme con i campioni di garantire l'efficienza comparabile dei saggi Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa tabella.
Tabella 6: Modello per l'analisi del campione qPCR assoluto per misurare le varianti S curve standard sono ripetute insieme con i campioni per garantire eff comparabili. icienza dei saggi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa tabella.
Tabella 7:.. Modello per saggio campione qPCR assoluto per misurare le varianti ΔS curve standard sono ripetute insieme con i campioni di garantire l'efficienza comparabile dei saggi Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa tabella.
Tabella 8: Modello per l'analisi del campione qPCR assoluto per la misurazione STAT3 pan.large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa tabella.
Discussion
Abbiamo sviluppato questo protocollo, al fine di valutare i livelli e le proporzioni di STAT3 splicing trascrizioni variante di eosinofili e cellule di linfoma e imparare se la stimolazione delle citochine influenzato i livelli e le proporzioni. STAT3 è di particolare interesse per la sua funzionalità pleiotropico e incerta, con rapporti conflittuali che agisca come oncoproteina o soppressore tumorale nel cancro (recensione riferimento 33). Le differenze di STAT3 funzione α e β variante di splicing sono stati caratterizzati in precedenza 34,35, e il nostro protocollo facilitato un knock-down / ri-espressione di analisi che suggerisce la necessità di un rapporto ottimale di S e ΔS trascrizioni 19.
quantificazione accurata di varianti di splicing distinte faciliterà ulteriori indagini relative funzioni STAT3 eterogenea impiombare composizione variante. Il protocollo integra i dati assoluti e relativi qPCR, che unisce la capacità di absoluto qPCR per calcolare le proporzioni giunzione variante, e relativa qPCR per misurare variazioni di espressione complessiva STAT3. Questo approccio consente di distinguere le sottili differenze in sequenza e contemporaneamente misurare i rapporti di giunzione a due siti di splicing alternativi più di 50 nucleotidi a parte. Determinare i rapporti degli eventi di splicing singolarmente non avrebbe dato il notevole constatazione che un bias co-splicing esisteva tale che i livelli ΔSβ sono più alti del previsto, se usi dei due siti sono giuntati in modo casuale 25.
Criticamente, assoluta qPCR con l'uso di curve di taratura plasmide consente una quantificazione (ad efficienza sub-ottimale) delle variazioni di giunzione che si traducono in sequenze altamente simili. Prevediamo un romanzo sottile splicing saggio qPCR dovrebbe prendere circa due mesi per ottimizzare. Passaggi chiave per lo sviluppo del test sono la creazione di plasmidi STAT3 utilizzati nella generazione di curve standard per assoluta qPCR; sperimentalmentedeterminare le sequenze di primer ottimali e parametri di ciclismo per garantire la specificità e riproducibilità; e l'integrazione dei dati relativi qPCR derivato da quantificare pan-STAT3 di espressione rispetto al espressione GAPDH. La correlazione del numero di copie da Pan quantificato STAT3 rispetto quantificazione cumulativo (Sα + ΔSα + Sβ + ΔSβ) mostra che il protocollo produce risultati affidabili.
Un avvertimento della tecnica è l'ampio processo di convalida. E 'necessario valutare la variabilità intra-saggio (ripetibilità), la variabilità interassay (riproducibilità) e specificità. Il protocollo delinea modi per ottenere risultati numerici per questi parametri. Abbiamo ritenuto efficienza ≥75%, fattore di specificità ≥4, coefficiente di variazione (riproducibilità) ≤10% e la deviazione standard di Ct (ripetibilità) ≤0.2 soglie adeguate 30. Le mutazioni o delezioni in aminoacidi sequenza STAT3 1-690 non saranno discoveRed di questo protocollo, anche se possono influenzare rapporti di splicing. Proporzioni trascrizione potrebbero non essere proporzionale alla proteoform proporzioni 36.
Dal momento che i campioni hanno differenti importi di base delle cDNA totale, assoluto qPCR è adatto per il confronto numero di copie di varianti di splicing all'interno di un campione, ma non per il confronto inter-campione a meno che accoppiato con relativa qPCR utilizzando un gene housekeeping stabilita. Il metodo descritto conforme alle linee guida MIQE qPCR per la riproducibilità 30. potrebbero dover essere modificati per ottenere dati riproducibili se si utilizza altre apparecchiature parametri di ciclismo PCR e concentrazioni dei primer. Perfetto specificità non è possibile senza compromettere l'efficienza drasticamente, ma l'obiettivo è stato amplificato in modo efficiente, maggiore di quattro ordini di grandezza.
Linear DNA è più facilmente amplificata che circolare. Se un plasmide alternativo non fornisce curve standard soddisfacenti (R 2 <; 0.95), considerano la linearizzazione del plasmide da sola restrizione sito prima di quantificazione. Ottimizzazione qPCR è fondamentale per ottenere dati di buona qualità (Figura 1). La maggior parte dei protocolli di qPCR si affidano a due fasi in bicicletta, e le macchine sono ottimizzate di conseguenza. riscaldamento non uniforme del blocco di riscaldamento può essere aggravata in tre fasi il ciclismo, contribuendo alla scarsa ripetibilità. I dosaggi devono essere impostati in condizioni sterili con punte di filtro per pipette e acqua ultrapura, idealmente in una cappa a flusso laminare dedicato. Poiché i contaminanti possono portare a risultati inconsistenti, le analisi dovrebbero essere istituiti in condizioni sterili con punte di filtro per pipette e acqua ultrapura, idealmente in una cappa a flusso laminare dedicato. Per ulteriori informazioni sulla ottimizzazione qPCR, fare riferimento a Bustin et al. 32
Quantificare STAT3 può portare ad una maggiore comprensione in una serie di contesti. STAT3 auto-regola la propria espressione 37, e il protocollo di cui sopra può aiutareper chiarire se i rapporti di varianti di splicing STAT3 contribuiscono a regolare questo ciclo di feedback positivo. Il protocollo può essere usato per studiare variazioni in rapporti varianti di splicing come osservato in cellule a quote differenziate 38 o nel corso dello sviluppo: è noto che le α / β rapporto STAT3 cambiamenti a livello proteico durante ematopoiesi 16. Sundin et al. trovato che un intronic polimorfismo a singolo nucleotide splicing di parte dell'esone 12 in STAT3 di un paziente con la sindrome di Giobbe 39. È concepibile che uno dei tanti SNP presenti negli introni tra esone 21 e 22, o esone 22 e 23 può contribuire a rapporti splicing di ΔS / S e α / β rispettivamente. Il test potrebbe essere utilizzato per quantificare le trascrizioni STAT3 in cellule cancerose, in cui mutazioni o cambiamenti nella regolamentazione splicing possono introdurre bias al processo di splicing 40. Le mutazioni dei fattori di splicing (come SF3B1), come observEd in sindromi mielodisplastiche 41 può anche portare a cambiamenti che possono essere misurati da questo protocollo.
Più in generale, questo approccio rileva specificamente co-associazione in splicing, che non è fattibile con convenzionale RNA-Seq, nè di serie qPCR. Mentre il fenomeno della mutuamente esclusive splicing esone dimostra coordinamento delle decisioni splicing, la co-associazione di altri eventi di splicing non è stato ben studiato. Un metodo alternativo recentemente descritto, in cui RNA-Seq è stato modificato in modo da interrogare intera lunghezza cDNA, suggerisce eventi di splicing lontana sono più co-dipendenti quanto ritenuto in precedenza 42.
STAT3 contiene un sito di splicing donatore tandem. Accettore siti tandem di splicing sono più frequenti 43 e dei principi del protocollo descritto potrebbero servire come punto di partenza per lo sviluppo di test per il rilevamento coincidenza di NAGNAG splicing e altri eventi di splicing raggio di 200 nucleotidi. Altro potenapplicazioni ziali comprendono la quantificazione di un caso di altre differenze di sequenza sottili, come indels o doppie / triple polimorfismi nucleotidici 44.
Acknowledgments
Gli autori vorrebbero riconoscere il National Institutes of Health-NHLBI per il Programma progetto di sovvenzione sul ruolo degli eosinofili in infiammazione delle vie aeree e ritocca: P01HL088584 (PI: N. Jarjour), e l'Università del Wisconsin Carbone Cancer Center e del Dipartimento di Medicina per il finanziamento intramurale. Ringraziamo Douglas Annis per la clonazione delle quattro varianti di STAT3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MJ Research PTC-200 Thermal Cycler | GMI | N/A | Used for standard PCR |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | N/A | qPCR machine |
| GS-6R | Beckman Coulter | N/A | centrifuge for 96-well plates |
| Nanodrop 2000 sprectrophotometer | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| RPMI-1640 medium | Sigma Aldrich | R8758 | cell culture medium |
| PfuTurbo DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600410 | DNA polymerase for standard PCR |
| KpnI | New England Biosciences | R0142S | |
| NheI | New England Biosciences | R0131S | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Qiagen | 330523 | qPCR, DNA polymerase/dsDNA-binding dye mix |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74204 | RNA extraction kit |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen (ThermoFisher Scientific) | 18080-044 | cDNA synthesis kit |
| Primers | Integrated DNA Technology | N/A | |
| NEBuffer 1.1 | New England Biosciences | B7201S | |
| GenePure LE Agarose | ISC BioExpress | E-3120-500 | component of TAE gel |
| Pipettors | Major lab suppliers (MLS) | N/A | |
| Filter pipette tips | Neptune Scientific | BT10XL, BT20, BT200 | |
| EU One Piece Thin Wall Plate | MidSci | ABI7501 | |
| ThermalSeal A Sealing Film | MidSci | TSA-100 | 96 well plate seal |
| pET-Elmer (variant of pET-28a) | Novagen; modified in Mosher lab | N/A | Details in PMID: 20947497 |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA purification system | Promega | A1460 | Plasmid purification |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Sequencing kit |
| QIAEX II Gel Extraction kit | Qiagen | 20021 | Amplicon purification |
| DH5α competent cells | ThermoFisher Scientific | 18265-017 | available from several providers, see PMID: 2162051 |
| kanamycin | Research Products International Corp. | K22000-5.0 | |
| Tris base | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | component of TAE buffer |
| Acetic acid, glacial | ThermoFisher Scientific | A38C-212 | component of TAE buffer |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma Chemical Company (Sigma Aldrich) | E-5134 | component of TAE buffer |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | component of Luria Broth |
| Bacto Yeast extract, technical | BD Biosciences | 288620 | component of Luria Broth |
| Sodium chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | component of Luria Broth |
| Sodium hydroxide | ThermoFisher Scientific | SS255-1 | component of Luria Broth |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | component of Luria Broth plate |
| Lasergene SeqBuilder | DNASTAR | Figure 1 generated using Lasergene SeqBuilder software version 12.2.0 (DNASTAR) |
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