Introduction
Short-range (tandem) alternativ splejsning, hvor alternative acceptor eller donorsteder er i tæt nærhed af hinanden, er almindelig i pattedyr 1, hvirvelløse dyr 2 og planter 3. Det anslås, at 20% af mammale gener indeholder alternative splejsningssteder 2-12 nukleotider Apart 4. Mange af disse steder er 3 nukleotider fra hinanden og resultere i optagelse eller udelukkelse af en enkelt codon. Der er debat om karakteren af splejsning regulering på disse steder 5,6 med nogle argumentere at splejsning motiv forskellene er så subtile, at valget er stokastisk 7, mens andre udlede regulering baseret på vævsspecificitet 8.
Tandem splejsningssted udvælgelse er blevet analyseret semikvantitativt ved hjælp modificeret kapillarelektroforese 7, og høj opløsning gelelektroforese 8. RNA-Seq (RNA-sekventering) læser kan bruges til at kvantificere de splejsning nøgletal på hvert splejsningsite. På denne måde har RNA-Seq data givet indsigt i reguleringen af tandem splejsningssteder 9. Det har også gjort det muligt forudsigelse af forventede splejsningsvariant nøgletal baseret på nukleotid motiv 10. Det meste af vægten på splejsning, der omfatter eller udelukker en enkelt codon har været på de mere almindeligt forekommende tandem acceptor splejsningssteder, kendt som NAGNAGs (hvor N = ethvert nukleotid).
Tandem donor alternative splejsningssteder herunder eller eksklusive en enkelt codon (GYNGYN anerkendelse motiv, hvor Y = pyrimidin) er mindre udbredt end tandem acceptorer. Signal transducer og aktivator af transkription 3 (STAT3) er et centralt gen undergår tandem donor alternativ splejsning 1,11. De tandem donor splejsningssites slutte exon 21 og 22 og resultere i optagelse eller udelukkelse af codon for serin-701 (S eller AS henholdsvis) 1,11. Downstream alternative acceptor sites (40 nukleotider fra hinanden) sammenføjning exon 22 og23a / b resultat i optagelsen af enten 55 terminale rester i transaktiveringsdomænet (α) eller en trunkeret transaktiveringsdomæne med 7 unikke C-terminale rester (p) 11. Derfor fire splejsningsvarianter er mulige.
STAT3 protein er en transkriptionsfaktor og større signal integrator i talrige celletyper 12 og når muteret sin konstitutiv aktivering bidrager til flere cancer fænotyper (gennemgået i henvisning 13). Job syndrom, en immundefekt lidelse karakteriseret ved høje niveauer af IgE, er også forårsaget af mutationer i STAT3 (revideret i henvisning 14). Adskilte roller for STAT3 α og β splejsningsvariant proteiner er blevet beskrevet tidligere 15. Oprindeligt var STAT3 β tænkt til at handle i en dominerende-negativ måde 16, antagonisering STAT3 α s transkriptionel aktivitet, men efterfølgende arbejde foreslog det har uafhængige målgener 17 18), men en nylig undersøgelse viser, at STAT3 S og AS splejsningsvarianter både er nødvendige for levedygtighed af STAT3-afhængige diffust storcellet B-celle lymfom (DLBLCL) celler 19. Den biologiske relevans mangler at blive udforsket. I betragtning af at splejse variant sammensætning kan påvirke funktionen, vi bestræbt os på at opdage, om forholdet var forstyrres af cytokin stimulation i eosinofiler.
Vi forsøgte oprindeligt at udforske forbindelsen mellem de to splejsningsbegivenheder ved anvendelse af PCR specifik for STAT3 α og β splejsningsvarianter, efterfulgt af spaltning af produkter med et restriktionsenzym specifikke for S splejsningsvarianter, AfeI. Densitometri af indikerede optagelse af Ser701 var rdigt ti gange hyppigere end udeladelsen (AS) i begge STAT3 α og β (data ikke vist). Men denne semikvantitative fremgangsmåde var ikke tilstrækkeligt reproducerbar, og kunne ikke anvendes effektivt til at måle alle fire splejsningsvarianter samtidigt. For at analysere andele af hver af de fire splejsningsvarianter, var det nødvendigt at etablere en kvantitativ PCR (qPCR) protokol, gav stramme tekniske (flere assays af en given prøve) replikater.
Relativ qPCR bygger på sammenligning af et gen af interesse til en standard eller housekeeping-genet vides at blive udtrykt på et bestemt niveau 20 og er passende, når genet af interesse og husholdning gen amplificeres med samme effektivitet. En dobbeltstrenget (ds) DNA-bindende fluorescerende (cyanin) farvestof binder til PCR amplikoner 21, og efter et vist antal cyklusser, har tilstrækkelig forstærkning forekommet for fluorescens er detekterbar. Jo højere det oprindelige niveauaf transkriptet, jo lavere tærskel cyklus (Ct) værdi. Da koncentrationen af cDNA præparater varierer, er man nødt til at sammenligne udskriften koncentration med koncentrationen af en udskrift kendt for at blive udtrykt på et ensartet niveau i alle prøver, ligesom glucuronidase-β (GUSB) i eosinofiler 22.
Relativ qPCR ikke er muligt for stærkt lignende sekvenser, som det ses i splejsningsvarianter følge af tandem splejsning. De strenge betingelser specifik opformering splejsningsvarianterne resultere i nedsat effektivitet. I stedet må absolut kvantificering anvendes 23. Dette indebærer at udarbejde en standardkurve med kendte koncentrationer af den splejsede udskrift af interesse, og som sikrer PCR betingelser optimere specificitet 24. Som beskrevet, kan absolutte og relative qPCR data for et bestemt gen slås sammen til at informere forståelsen af genets ekspression i en bestemt celletype, idette tilfælde STAT3 i forskellig stimulerede eosinofiler 25.
Heri STAT3 splejsningsvariant kvantificering beskrevet med forventningen om, at fremgangsmåden kan tilpasses til målrettede studier af andre tandem splejsningsbegivenheder. Optimering var en langvarig proces, hvor flere primerpar i forskellige koncentrationer og talrige gentagelser af cykling parametre blev testet i løbet af et par måneder. De vigtigste elementer i protokollen er primer specificitet validering og kvantificering baseret på standard kurver med kendte koncentrationer af splejsningsvarianter. Relativ qPCR sammenholdt vist sig nyttig for vores ansøgning, men er ikke nødvendigt.
Protocol
BEMÆRK: Perifere blodeosinofiler blev modtaget uden at identificere oplysninger i overensstemmelse med en protokol godkendt (# 2013-1570) ved University of Wisconsin-Madison Center for Health Sciences Institutional Review Board. Underskrevet informeret samtykke fra donor blev opnået for brugen af hver prøve i forskning.
1. Oprettelse af plasmider som Skabelon Standards
- Opret primere til en amplikon spænder både STAT3 splejsningssteder, med 5'- Kpnl og Nhel restriktionssteder (og 5'-udvidelser), som pr tabel 1a.
BEMÆRK: Kpnl og Nhel sites blev valgt at aktivere indsatse skal ligeres ind i en modificeret pET-28a-vektoren med kanamycinresistens 25,26 KpnI-sitet var blevet tilsat i det multiple kloningssite.. - Brug af frisk doneret eosinofiler, forberede dobbeltprøver af 2,5 x 10 6 celler / ml i celledyrkningsmedium (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium). Der inkuberes i 1 time ved 37 ° C under 5% CO2 og 10% fugtighed.
- Forbered komplementære (c) DNA fra prøver (mindst 1 x 10 6 celler pr forberedelse) ifølge producentens instruktioner ved anvendelse af RNA-ekstraktion og cDNA-syntese-kits.
- Fra skabelon cDNA forberedt i trin 1.2.1, forstærke STAT3 splejsning varianter bruge forstærkning PCR som pr tabel 2a.
- Løse ampliconer i 2% agarose Tris-acetat-ethylendiamintetraacetat (TAE) gel 27. Forbrugsafgifter bands fra gelen og rense efter gel excision kit instruktioner.
- Cut amplikoner og plasmid med passende restriktionsenzymer (oversigt af restriktioner i henvisning 27), ved hjælp af volumener, inkubationstider og temperaturer anbefales af enzym udbyder; og oprense som i trin 1.4. Ligere begrænsede amplikoner i plasmid under udbyder-anbefalede betingelser.
- Forbered en negativ control (begrænset plasmid-DNA uden insert men med ligase) og en positiv kontrol (ubegrænset plasmid med kanamycinresistens). Udfør standard plasmid transformationer af kompetent E. coli DH5a 28 Brug ligeringsblandinger 27.
- Inkuber transformeret E. coli i 1 ml Luria-Broth (LB) medium (fremstillet som anvist 27) omrystning i 1 time ved 37 ° C. Spread transformanterne på LB-plader indeholdende 50 ug / ml kanamycin og inkuberes ved 37 ° C natten over.
- Pick flere kolonier fra STAT3 α og STAT3 p plader under anvendelse af sterile tandstikkere 27. Overfør hver til 2 ml LB. Grow kulturer natten over ved 37 ° C i en rysteinkubator.
- Oprens plasmider fra bakteriekulturer ved at følge instruktionerne i et DNA-oprensningskit. Opbevar plasmider ved -20 eller -80 ° C.
- Sekvensdata plasmider fra flere kolonier ved fremstilling 20 pi sekventeringsreaktioner. pipette 3pi sekventering reaktionsbuffer, 2 pi sekventering reaktionsblanding, 12 pi ultrarent vand, 1 pi plasmid som template og 2 pi sekventeringsprimeren.
BEMÆRK: Hvis du bruger pET-28a vektor, bruge sekvensering primer 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG-3 '.- Vurdere electrophoretograms af plasmider, der koder hver variant: Sα, Sβ, ΔSα og ΔSβ 25.
- Mål koncentration af ren plasmid-DNA i ng / pl. Hvis læsningen absorbans ved 260 nm ved anvendelse af et spektrofotometer, beregne DNA-koncentration ved hjælp af Lambert-Beers lov 29:
Hvor c = koncentrationen, A = absorbans, ε (ekstinktionskoefficient) = 0,02 (ug / ml) -1 cm-1 for dobbeltstrenget DNA og L = vejlængde for lys (sædvanligvis 1 cm). - Brug af molekylvægtene af STAT3 splejsningsvariant cDNA amplicons og vektoren, beregner kopi antal pr pl.
BEMÆRK: Molekylær vægt pr basepar (bp) er estimeret som 650 Da.
2. Analyse Primer specificitet for Absolute qPCR
- Forbered 1 i 10 fortyndingsrække af STAT3 plasmider, med ~ 10 8 til 10 3 kopier pr pi (20 pi) ved hjælp ultrarent vand. Mål koncentration af mest koncentrerede (~ 10 8 kopier pr pi, se trin 1.11).
- Brug udvandet plasmider at forberede fire "uden for målgruppen" blandinger (dvs.., STAT3 ΔSβ negativ kontrol indeholdende lige koncentrationer af STAT3 Sα, ΔSα, Sβ men ingen ΔSβ) 10 6 kopier pr pi hver. Forbered en "mål" mix med lige koncentrationer af alle fire skabeloner hver på 10 6 kopier pr pl.
- Forbered primerpar opløsnings for hver splejsningsvariant (se tabel 1b og figur 1) ved at gøre ~ 60 pi primere hver ved en 7 uM koncentration (slutkoncentration i prøven vil være 560 nM).
- Fortynd DNA-polymerase / dsDNA-bindende farvestof mix 7: 5 med ren H 2 O.
- Oprettet Assay 1 i en 96-brønds PCR-plade som vist i skabelon (tabel 3).
- Tilføj 21 pi fortyndet DNA-polymerase / dsDNA-bindende farvestof mix, derefter 2 pi primer mix og 2 pi skabelon (som pr tabel 2b). I stedet for skabelon, tilsættes 2 pi filtrerede H2O til nogen skabelon kontrol (NTC) godt. Opsæt reaktioner i to eksemplarer til at vurdere repeterbarhed 30.
- Seal qPCR pladen med den selvklæbende cover og centrifugeres i 5 minutter ved 1200 xg ved 12 ° C.
- Hvis du bruger software noteret på materialer, der er nedsat eksperiment som beskrevet.
- Tænd qPCR maskine og insert forseglet qPCR plade. Klik på Filer &# 62; Ny> Næste> Vælg "Ny detektor", vælg reporter, quencher og give navn. Opsæt en "ny detektor" for hver splejse variant.
- Vælg Næste og oprette standarder bedt om Set Up Sample Plate side, sikrer mængder indgået bordet og hensigtsmæssige detektorer er valgt. Klik på finish.
- Opsæt cykle pr Tabel 2b. Sikre, at fluorescens aflæsning (til bestemmelse Ct) opstår under 72 ° C trin af hver cyklus. Vælg Kør.
- Når kørslen er færdig, skal du klikke på> Amplification plot Fanen Resultater. Vurdere output forstærkning plot til at vurdere datakvaliteten (se efter en eksponentiel plot, som i figur 2).
BEMÆRK: Sørg for forstærkning plots er for det meste eksponentiel, og at tærsklen cyklus kan indstilles til den eksponentielle del af plottet. Sørg NTC er ikke forstærket og andre standard punkter demonstrere en lav Ct-værdi med en høj ΔRn. - at export resultater til regneark software, klikke på Filer> Eksporter> Resultater.
3. Vurdering af Absolute qPCR Assay specificitet og repeterbarhed
- Reproducerbarhed
- Brug dataene fra trin 2.7.5 at beregne standardafvigelsen af Ct (tærskel cyklus for fluorescens) værdier.
Hvor N = antal prøver (2 hvis det gøres i to eksemplarer),
= Prøvens Ct og 
= Prøvens Ct betyde. Kontroller, at standardafvigelsen af Ct-værdier for dubletter er ≤0.2. Kontroller, at Ct-værdier i alle, men NTC brønde er mindre end 38. - Hvis gentagelsesnøjagtighed er dårlige optimere cykling parametre ved enten stigende eller faldende annealing tid.
- Brug dataene fra trin 2.7.5 at beregne standardafvigelsen af Ct (tærskel cyklus for fluorescens) værdier.
- Plot log kopi følelsesløsis (som bestemt i trin 1.12 og forberedt i trin 2.1) vs Ct-værdi at skabe en standardkurve; giver den følgende ligning:
Hvor y er Ct, m er gradienten er x log (kopital) og b er skæringspunktet værdi.
BEMÆRK: R2 værdi af den lineære regression vil være ≥0.95 for gode data. - Beregn amplificeringseffektiviteten hjælp standardkurve og ligningen:
BEMÆRK: Sigt efter effektivitet ≥75%. - Beregn specificitet fra qPCR assay en hjælp Too formel:
Hvor Δ Ct Too = Ct target - Ct ikke-mål, der beskriver forskellen i tærskelcyklus tal for specifik og ikke-specifik forstærkertil forbehold
BEMÆRK: Specificitet bør overstige fire størrelsesordener (dvs. specificitet faktor ≥4.).- Hvis specificitet er dårlig, optimere ved at sænke primer koncentration. Oprettet assays (som beskrevet i trin 2,5-2,7) med endelige primer koncentrationer fra 100 nM til 500 nM.
= Prøvens Ct og 
= Prøvens Ct betyde. Kontroller, at standardafvigelsen af Ct-værdier for dubletter er ≤0.2. Kontroller, at Ct-værdier i alle, men NTC brønde er mindre end 38. 
4. Udførelse Relative qPCR assays
- Behandl Celler med Cytokiner at markedsføre Transcription.
- For frisk doneret eosinofiler, forberede dobbeltprøver på 2,5 x 10 6 celler / ml i celledyrkningsmedium (RPMI 1640-medium) og behandles med 50 ng / ml interleukin-3 (IL3) og / eller 50 ng / ml tumornekrosefaktor α ( TNFa) i perioder på 3, 6, 9 og 20 timer ved 37 ° C under 5% CO2 og 10% fugtighed.
- Forbered cDNA fra eosinofil prøver (mindst 1 x 10 6 celler pr forberedelse) ifølge producentens instruktioner ved anvendelse af RNA-ekstraktionsmetoder og cDNA-syntese-kits. Forbered serielle fortyndinger af to prøve cDNA portioner (kontrol eller hvile prøver), med en fortynding spænder fra "1" til "1 i 1024" fortynding.
- For en i 4 fortynding pipette 1 pi cDNA og 3 pi ultrarent vand.
- For en i 16 fortynding pipette 1 ml af den 1 i 4 fortynding og 3 pi ultrarent vand osv
- Opsæt PCR i 96-brønds plade med 25 pi reaktioner som beskrevet trin 2,3-2,5 men med flere primerkoncentrationer til pan STAT3 og GUSB (se skabelon i tabel 4).
- Tilføj "ny detektor" for GUSB og følge trin 2,6-2,7, ved hjælp af cykling parametre, der er beskrevet i tabel 2c.
- Generer standard kurver (se trin 3.2 og 3.3) for at afgøre hvilken primer koncentrationer resulterer i 95-100% forstærkning effektivitet.
- Opsætning plade med forberedte cDNA prøver (fra trin 4.2) og optimerede primerkoncentrationer(se tabel 2c for cykliseringsparametre, reagenser og tabel 5 96-brønds plade skabelon).
- Udfør trin 2,6-2,7. Gentag assay mindst en gang og kontrollere datakvaliteten.
- Beregn den gennemsnitlige Ct værdien af to eksemplarer prøve Cts for både STAT3 og husholdning gen GUSB.
- Opnå Δ Ct-værdier for hver prøve.
- Udpeg hvile prøve (normalt har laveste koncentration af udskrift af interesse) som Prøve 0. Beregn ΔΔ Ct 31 for hver prøve (her betegnet som prøve X):
- Beregn fold-stigning for hver prøve:
- Reproducerbarhed
- Beregn variationskoefficienten (CV) for kopi nummer for pan STAT3 og GUSB.
Hvor N = antal prøver, = prøvens beregnet kopital og = stikprøvemiddelværdi. Kontroller, at CV af hver prøve (multiple analyser) er ≤10%.
- Beregn variationskoefficienten (CV) for kopi nummer for pan STAT3 og GUSB.
5. Analyse Absolute qPCR data for ukendte prøver
- Undersøg Ct-værdier opnået i forhold qPCR (som beskrevet i trin 4.9) til husholdning gen GUSB at sikre prøver 'cDNA koncentrationer er inden for en størrelsesorden.
- Fortynd cDNA overensstemmelse hermed (fx hvis prøve 1 har en Ct-værdi på ~ 17,5, og andre prøver 'Ct-værdier er ~ 21, prøve 1 er omtrent 2 (21-17.5) = 11 gange mere koncentreret Udfør en 1:. 1 fortynding med ultrarent vand inden for samme område, uden at fortynde mere end nødvendigt).
BEMÆRK: Voldsomt forskellige udgangspunkter koncentrationer vil skævhed den lineære regressionsanalyse (trin 4.12).
- Fortynd cDNA overensstemmelse hermed (fx hvis prøve 1 har en Ct-værdi på ~ 17,5, og andre prøver 'Ct-værdier er ~ 21, prøve 1 er omtrent 2 (21-17.5) = 11 gange mere koncentreret Udfør en 1:. 1 fortynding med ultrarent vand inden for samme område, uden at fortynde mere end nødvendigt).
- Opsæt absolut qPCR assay af prøver. Forbered assay 2a skabelon plade til Sα og Sβ som pr tabel 6; og forberede assay 2b for ΔSα og ΔSβ som pr tabel 7. Udfør analyser som beskrevet i trin 2.6-2.7.3 (og tabel 2b). Gentag analyser mindst én gang.
- Check datakvalitet og eksport, som beskrevet i trin 2.7.4-2.7.5.
- Oprettet absolut brønds plade qPCR 96 med 25 pi reaktioner ved anvendelse pan- STAT3 primere (primere i tabel 1c, skabelon i tabel 8) ved 400 uM og en blanding af alle fire plasmider eller et enkelt plasmid til noterede totale koncentrationer.
BEMÆRK: Effektivitet betyder ikke noget for absolut qPCR, men optimere effektiviteten af disse primere er vigtig for relativ qPCR (trin 4). - Seal qPCR pladen med den selvklæbende cover og centrifugeres i 5 minutter ved 1200 xg ved 12 ° C.
- Opsæt "ny detektor" for panden- STAT3 som i trin 2.7.1-2.7.3.
- Opsætning cykle for pan-STAT3 som pr tabel 2c (samme betingelser som relativ qPCR). Sikre, at fluorescens aflæsning (til bestemmelse Ct) opstår under 72 ° C trin af hver cyklus. Gentag assay mindst én gang for at sikre reproducerbarhed.
- Check datakvaliteten og eksport (se trin 2.7.4-2.7.5).
- Hvis amplifikation plots er ikke eksponentiel (se figur 2), fortyndes prøven cDNA (1:10) og gentag assay som beskrevet (trin 5.7).
- Ved anvendelse af ligningen for standardkurven (se 3.2, figur 3) og Ct-værdier på prøver, beregne kopitallet af hver splejsningsvariant og pan STAT3 i hver prøve.
- Plot log (absolutte qPCR kopi talværdier opnået for pan STAT3) vs log (kumulative absolutte qPCR kopi talværdier for STAT3 splejsning varianter).
BEMÆRK: Ideel lineær regression og hældning værdier ville både være ~ 1. - Beregn repeterbarhed (trin 3.1) og reproducerbarhed (trin 4.13).
6. Sammenlægning absolutte og relative qPCR data
- Gang andelen af varianten med den samlede STAT3 fold-stigning til at beregne fold-stigning på hver splejsning variant.
- Beregn standardafvigelserne (se trin 3.1.1) af de absolutte og relative værdier for at tage højde for forplantning af fejl. Bestem standard målefejl (SEM), som vist:
Representative Results
Gode qPCR datakvalitet vil generere en S-formet forstærkning plot (figur 2a), som betyder eksponentiel stigning i udskrifter i løbet af cykling. Tilstedeværelsen af for meget skabelon kan resultere i en høj fluorescens baggrund, hvilket betyder en uhensigtsmæssig baseline er etableret i de første få cykler. Hvis dataene ikke giver en eksponentiel kurve (figur 2b), yderligere optimering er nødvendig (skitseret i trin 3.1 og 3.4). For yderligere information om fejlfinding qPCR resultater, se referere 32. Standardkurverne genereret med skabelon kalibrator plasmider vil indikere effektiviteten af amplifikation (kurve for STAT3 Sα vist i figur 3). Efficiencies mellem 83 og 95% blev observeret under de beskrevne betingelser. Ligningen for specificitet (Trin 3.4) antager samme effektivitet, hvilket er usandsynligt 25, så specificitetenvil sandsynligvis være større end specificitet faktor antyder.
For at vurdere den kongruens af STAT3-niveauer blev de absolutte værdier af hver af de fire splejsningsvarianter målt såvel som niveauet af samlede STAT3, sidstnævnte med primerne amplificerer fælles en region til alle fire splejsningsvarianter (figur 4). Ideelt den lineære regression (angivelse af korrelation) og hældning (forholdet mellem pan STAT3 for summerede splejsningsvarianter) bør begge være tæt på 1.
De absolutte qPCR data præsenteres som lagkagediagrammer til at vise forholdet mellem de fire splejsningsvarianter over tid efter stimulering med cytokiner (figur 5a). Resting eosinofiler (0 HR) havde den mindste andel af STAT3 Sα, selvom denne variant var altid den mest udbredte. Multiplicere brøkdel af STAT3 β splejsningsvarianter (S ^6 + ΔSβ) ved den del af STAT3 AS splejsningsvarianter (ΔSα + ΔSβ) gav konsekvent en lavere værdi end den eksperimentelt registrerede værdi for ΔSβ. Hvis splejsningsbegivenheder var uafhængige, ville man forvente, at multiplicere brøkdel af AS varianter af den del af p-varianter ville give en værdi, der er enig med eksperimentelt bestemte værdi. Højere niveauer af ΔSβ end forventet fra uafhængige splejsningsbegivenheder antyder findes en co-splejsning bias.
Fletning absolutte og relative qPCR data viste, at niveauet af alle STAT3 splejsningsvarianter øget post-stimulation med cytokiner IL3 og TNF, med niveauer topper 6 timer efter stimulering (figur 5b - e). For tre af de fire splejsningsvarianter, transcript niveauer var omkring 3 gange højere i IL3 + TNFa behandlede eosinofile (6 timer) sammenlignet med eosinofile i mediernepå samme tidspunkt. STAT3 Sα niveauer var 3,5 gange højere i IL3 + TNFa behandlede eosinofiler sammenlignet med eosinofiler i medier på dette tidspunkt. Den største usikkerhed (største standard målefejl) blev set i ΔSβ (figur 5e), som omfatter den mindste fraktion af total STAT3 i alle prøver. Dette var ikke overraskende, da lavere niveauer er forbundet med højere Ct-værdier. Krav om flere cykler at nå tærsklen cyklus vil forværre usikkerhed som følge af variation cyklus-til-cyklus i effektivitet forstærkning.
Figur 1: Skematisk af primerpar bruges til at udføre qPCR af STAT3 splice varianter og pan-STAT3 Primere anvendes til specifikt at forstærke hver af STAT3 splejsningsvarianter (Sα, Sβ, ΔSα og ΔSβ henholdsvis) er s.hown. Forward primere (STAT3 "S" og "AS") spænder krydset mellem exon 21 og 22. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Amplification afbildninger af qPCR data (a) S-formet forstærkning plots betyder pålidelig forstærkning. Disse data blev opnået fra qPCR af to serielle fortyndinger af plasmid indeholdende STAT3 Sα, hvor hvert par af farvede linjer repræsenterer fluorescensniveauer af dobbeltbestemmelser fortyndede prøver i løbet af 40 cykler (x-akse). Den mest koncentrerede prøve (grøn-grå) blev tilstrækkeligt amplificeret ved cyklus 17 (med dsDNA-bindende farvestof proportional med fluorescens, vist på y-aksen) overskrider tærskelværdien fluorescensværdi (baseline vist som grøn pil). Dens Ct værdi ville være 17. (b) ikke-eksponentielle plots tyder på, at baggrunden-fluorescens tærsklen på ikke var fastsat korrekt i de første par cykler. Dette kan skyldes tilstedeværelsen af en inhibitor eller stærkt-koncentrerede skabelon eller primere. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Standard kurve af log (kopi antal STAT3 Sα) vs Ct Der er en lineær sammenhæng mellem log over hver STAT3 splejsningsvariant kopi nummer og tærskel cyklus (Ct).. Oprettelse af en standardkurve fra plasmid DNA efterligner cDNA'et af prøver og dermedgiver en bedre måling end en kurve skabt af fortyndede PCR amplikoner. De viste data er Ct-værdier fra qPCR af to serielle fortyndinger af plasmid indeholdende STAT3 Sα. Ud fra denne kurve kan kopiantallet stede i hver prøve interpoleres, og amplifikation af virkningsgraden, beregnet (83,9%). Selvom y-aflytninger er mindre reproducerbare end hældning, skæringspunktet antyder 42,2 cykler ville være nødvendigt at være sikker på ikke mål-DNA er til stede. Fejl søjler indikerer SEM, n = 3. Sammenlignelige kurver blev konstrueret til STAT3 Sβ, ΔSα og ΔSβ (ikke vist). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Sammenligning af kvantificeret fælleseuropæisk
Figur 5:. STAT3 splejsningsvariant niveauer svinget i løbet af cytokin behandling (a) Lagkagediagrammer angiver procentsatser for hver STAT3 splejsningsvarianti eosinofiler under behandling med IL3 og TNF. (B - e) Ændringer i STAT3 splejsningsvarianter i eosinofiler behandlet med forskellige kombinationer af cytokiner, målt ved at kombinere relative og absolutte qPCR data STAT3 Sα (b), Sβ (c), ΔSα (d), og ΔSβ (e) niveauer. svinget over tid efter stimulation. Niveauer oprindeligt steget, topper 6 timer efter stimulation. IL3 + TNFa kombination fremkaldte højere ekspression af alle fire STAT3 splejsningsvarianter end IL3 alene. SEM beregnes for hvert datapunkt tegner sig for opformering af fejl. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: Primere anvendt til amplifikation (a), absolut (b) og relative (c) kvantitativ PCR. Cloning primere har begrænsning sekvenser og 5'-udvidelser til effektiv skæring. KpnI og Nhel restriktionssteder er angivet med fed skrift. Klik her for at se en større version af denne tabel.
Tabel 2. PCR cykling parametre (til venstre) og volumener reagens (til højre) for forstærkning (a), relative (b), absolut (c) kvantitativ PCR. Klik her for at se en større version af denne tabel.
3 / 54473tbl3.jpg "/>
Tabel 3:. Skabelon til absolut qPCR plasmid kalibrering Dette assay er nødvendigt at vurdere reproducerbarhed og effektivitet, samt at generere standardkurver fra at interpolere data. De "uden for målgruppen" mix vil give et skøn over specificitet. Optimering kan være nødvendigt at opnå konsistens. Klik her for at se en større version af denne tabel.
Tabel 4:. Skabelon til relativ qPCR (pan STAT3 og husholdning gen GUSB) kalibrering assay modsætning absolut qPCR, det punkt i denne analyse er at bestemme betingelser, hvor forstærkning effektivitet er ~ 100%.tp_upload / 54.473 / 54473tbl4large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af denne tabel.
Tabel 5:.. Skabelon til relativ qPCR prøve assay til måling pan STAT3 og husholdning gen GUSB Standard kurver gentages sammen med prøver for at sikre sammenlignelige effektivitet analyserne Klik her for at se en større version af denne tabel.
Tabel 6: Skabelon til absolut qPCR prøve assay til måling af S-varianter Standardkurver gentages sammen med prøver for at sikre sammenlignelige eff. iciency af analyserne. Klik her for at se en større version af denne tabel.
Tabel 7:.. Skabelon til absolut qPCR prøve assay til måling AS varianter Standard kurver gentages sammen med prøver for at sikre sammenlignelige effektivitet analyserne Klik her for at se en større version af denne tabel.
Tabel 8: Skabelon til absolut qPCR prøve assay til måling af fælleseuropæisk STAT3.large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af denne tabel.
Discussion
Vi udviklede denne protokol for at vurdere niveauet og proportioner STAT3 splejsningsvariant udskrifter i eosinofiler og lymfomceller og lære om cytokin stimulation påvirket niveauer og proportioner. STAT3 er af særlig interesse på grund af sin pleiotropisk og usikker funktionalitet, med modstridende rapporter om, hvorvidt det virker som en oncoprotein eller tumor suppressor i kræft (revideret i henvisning 33). Forskelle i STAT3 α og β splejsningsvariant funktion var blevet karakteriseret tidligere 34,35, og vores protokol lettet en knock-down / re-ekspressionsanalyse som antyder et behov for et optimalt forhold mellem S og AS afskrifter 19.
Nøjagtig kvantificering af forskellige splejsningsvarianter vil lette yderligere undersøgelser at forholde heterogene STAT3 funktion til at splejse variant sammensætning. Protokollen integrerer absolutte og relative qPCR data kombinere evne absolut qPCR at beregne splejsningsvariant proportioner, og relativ qPCR at måle ændringer i den samlede STAT3 ekspression. Denne fremgangsmåde gør det muligt at skelne små forskelle i sekvens og samtidig måle splejsning forhold på to alternative splejsningssteder mere end 50 nukleotider fra hinanden. Bestemmelse af forholdene mellem splejsningsbegivenheder enkeltvis ville ikke have givet den bemærkelsesværdige opdagelse, at en co-splejsning skævhed eksisterede sådan, at ΔSβ er højere end forventet, hvis anvendelser af de to steder er tilfældigt splejset 25.
Kritisk, absolut qPCR med anvendelse af plasmid kalibreringskurver muliggør kvantificering (ved sub-optimal effektivitet) af splice variationer, som resulterer i meget lignende sekvenser. Vi forventer en ny subtil splejsning qPCR analysen bør tage omkring to måneder for at optimere. Vigtige trin i assay udvikling er at skabe STAT3 plasmider, der anvendes til at generere standard kurver for absolut qPCR; eksperimenteltbestemmelse af optimale primer sekvenser og cykling parametre for at sikre specificitet og reproducerbarhed; og integration af relative qPCR data fra kvantificere pan-STAT3 udtryk i forhold til GAPDH udtryk. Korrelationen af eksemplar nummer kvantificeres ved pan STAT3 versus kumulativ kvantificering (Sα + ΔSα + Sβ + ΔSβ) viser, at protokollen giver pålidelige resultater.
En advarsel af teknikken er den omfattende valideringsprocessen. Det er nødvendigt at vurdere intra-assay variation (repeterbarhed), interassay variabilitet (reproducerbarhed) og specificitet. Protokollen skitserer måder at få numeriske udgange til disse parametre. Vi anså effektivitet ≥75%, specificitet faktor ≥4, variationskoefficient (reproducerbarhed) ≤10% og Ct standardafvigelse (repeterbarhed) ≤0.2 som egnede tærskler 30. Mutationer eller deletioner i STAT3 sekvens aminosyrerne 1-690 vil ikke være discovered af denne protokol, selv om de kan påvirke splejsning nøgletal. Udskrift proportioner måske ikke være proportional med proteoform proportioner 36.
Da prøverne er forskellige udgangsmaterialer mængder af total cDNA, absolut qPCR er egnet til sammenligning kopiantal af splejsningsvarianter i en prøve, men ikke for inter-sample sammenligning medmindre kombineret med relativ qPCR under anvendelse af en etableret housekeeping-gen. Den beskrevne fremgangsmåde i overensstemmelse med MIQE qPCR retningslinjer for reproducerbarhed 30. PCR cykling parametre og primerkoncentrationer muligvis modificeres til opnåelse af reproducerbare data, hvis der anvendes andet udstyr. Perfekt specificitet er ikke mulig uden drastisk at kompromittere effektivitet, men målet blev amplificeret mere effektivt med mere end fire af størrelsesordener.
Lineært DNA lettere amplificeret end cirkulær. Hvis en alternativ plasmid ikke giver tilfredsstillende standard kurver (R 2 <; 0,95), overveje linearisering plasmidet ved en enkelt websted begrænsning før kvantificering. Optimering qPCR er afgørende for at opnå data af god kvalitet (Fig 1). De fleste qPCR-protokoller er afhængige af to-trins cykling, og maskinerne er optimeret i overensstemmelse hermed. Ikke-ensartet opvarmning af varmeblokken kan forværres i tre-trins cykling, bidrager til dårlig repeterbarhed. Analyser skal sættes op under sterile forhold med filter pipettespidser og ultrarent vand, helst i en dedikeret laminar flow hætte. Fordi forureninger kan føre til forskellige resultater, bør fastsættes analyser op under sterile forhold med filter pipettespidser og ultrarent vand, helst i en dedikeret laminar flow hætte. For mere information om qPCR optimering Se Bustin et al. 32
Kvantificering STAT3 kan føre til større indsigt i en række sammenhænge. STAT3 automatisk regulerer sit eget udtryk 37, og den ovenfor beskrevne protokol kan hjælpeat belyse, om forhold mellem STAT3 splejsningsvarianter bidrager til at regulere denne positive feedback-sløjfe. Protokollen kan bruges til at studere ændringer i splejsningsvariant forhold som observeret i celler ved forskellige densiteter 38 eller i løbet af udvikling: det er kendt, at STAT3 α / β-forholdet ændringer på proteinniveauet under hæmatopoiese 16. Sundin et al. fundet, at en intron enkelt-nukleotid polymorfisme forudindtaget splejsning af exon 12 i STAT3 af en patient med Job syndrom 39. Det er tænkeligt, at en af de mange SNPs stede i intronerne mellem exon 21 og 22, eller exon 22 og 23 kan bidrage til splejsning forhold af AS / S og α / β hhv. Assayet kan anvendes til at kvantificere STAT3 transkripter i kræftceller, hvor mutationer eller ændringer i splejsning regulering kan introducere forspænding til splejsning processen 40. Mutationer i splejsningsfaktorer (ligesom SF3B1), som observed i myelodysplastisk syndrom 41 kan også føre til ændringer, der kan måles ved denne protokol.
Mere generelt, denne tilgang registrerer specifikt co-forening i splejsning, som ikke er mulig med konventionelle RNA-Seq eller standard qPCR. Mens fænomenet gensidigt udelukkende exon splejsning demonstrerer koordinering af splejsning beslutninger, co-sammenslutning af andre splejsningsbegivenheder er ikke veldokumenterede. En nyligt beskrevet alternativ fremgangsmåde, ved hvilken RNA-Seq blev modificeret for således at forespørge fuldlængde-cDNA, tyder fjernt splejsningsbegivenheder er mere co-afhængig end tidligere antaget 42.
STAT3 indeholder en donor tandem splejsningssted. Acceptor tandem splejsningssites er hyppigere 43 og principperne i den skitserede protokol kunne tjene som udgangspunkt for udvikling af assays til tilfældighed detektion af NAGNAG splejsning og andre splejsningsbegivenheder inden for 200 nukleotider. Andre Potentielle applikationer omfatter kvantificering af sammenfald af andre subtile sekvensforskelle, ligesom indels eller dobbelt / tredobbelt nukleotid polymorfier 44.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende National Institutes of Health-NHLBI til Programmet Project Grant på rolle Eosinofile i Airway Inflammation og Remodeling: P01HL088584 (PI: N. Jarjour), og University of Wisconsin Carbone Cancer Center og Institut for Medicin for intramuralt finansiering. Vi takker Douglas Annis til kloning de fire STAT3 varianter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MJ Research PTC-200 Thermal Cycler | GMI | N/A | Used for standard PCR |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | N/A | qPCR machine |
| GS-6R | Beckman Coulter | N/A | centrifuge for 96-well plates |
| Nanodrop 2000 sprectrophotometer | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| RPMI-1640 medium | Sigma Aldrich | R8758 | cell culture medium |
| PfuTurbo DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600410 | DNA polymerase for standard PCR |
| KpnI | New England Biosciences | R0142S | |
| NheI | New England Biosciences | R0131S | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Qiagen | 330523 | qPCR, DNA polymerase/dsDNA-binding dye mix |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74204 | RNA extraction kit |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen (ThermoFisher Scientific) | 18080-044 | cDNA synthesis kit |
| Primers | Integrated DNA Technology | N/A | |
| NEBuffer 1.1 | New England Biosciences | B7201S | |
| GenePure LE Agarose | ISC BioExpress | E-3120-500 | component of TAE gel |
| Pipettors | Major lab suppliers (MLS) | N/A | |
| Filter pipette tips | Neptune Scientific | BT10XL, BT20, BT200 | |
| EU One Piece Thin Wall Plate | MidSci | ABI7501 | |
| ThermalSeal A Sealing Film | MidSci | TSA-100 | 96 well plate seal |
| pET-Elmer (variant of pET-28a) | Novagen; modified in Mosher lab | N/A | Details in PMID: 20947497 |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA purification system | Promega | A1460 | Plasmid purification |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Sequencing kit |
| QIAEX II Gel Extraction kit | Qiagen | 20021 | Amplicon purification |
| DH5α competent cells | ThermoFisher Scientific | 18265-017 | available from several providers, see PMID: 2162051 |
| kanamycin | Research Products International Corp. | K22000-5.0 | |
| Tris base | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | component of TAE buffer |
| Acetic acid, glacial | ThermoFisher Scientific | A38C-212 | component of TAE buffer |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma Chemical Company (Sigma Aldrich) | E-5134 | component of TAE buffer |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | component of Luria Broth |
| Bacto Yeast extract, technical | BD Biosciences | 288620 | component of Luria Broth |
| Sodium chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | component of Luria Broth |
| Sodium hydroxide | ThermoFisher Scientific | SS255-1 | component of Luria Broth |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | component of Luria Broth plate |
| Lasergene SeqBuilder | DNASTAR | Figure 1 generated using Lasergene SeqBuilder software version 12.2.0 (DNASTAR) |
References
- Hiller, M., et al. Phylogenetically widespread alternative splicing at unusual GYNGYN donors. Genome Biol. 7 (7), R65 (2006).
- Treacy, M. N., et al. Twin of I-POU: a two amino acid difference in the I-POU homeodomain distinguishes an activator from an inhibitor of transcription. Cell. 68 (3), 491-505 (1992).
- Schindler, S., et al. Alternative splicing at NAGNAG acceptors in Arabidopsis thaliana SR and SR-related protein-coding genes. BMC Genomics. 9, 159 (2008).
- Szafranski, K., Kramer, M. It's a bit over, is that ok? The subtle surplus from tandem alternative splicing. RNA Biol. 12 (2), 115-122 (2015).
- Wang, M., et al. Alternative splicing at GYNNGY 5' splice sites: more noise, less regulation. Nucleic Acids Res. 42 (22), 13969-13980 (2014).
- Hiller, M., Platzer, M. Widespread and subtle: alternative splicing at short-distance tandem sites. Trends Genet. 24 (5), 246-255 (2008).
- Tsai, K. W., Lin, W. C. Quantitative analysis of wobble splicing indicates that it is not tissue specific. Genomics. 88 (6), 855-864 (2006).
- Tadokoro, K., et al. Frequent occurrence of protein isoforms with or without a single amino acid residue by subtle alternative splicing: the case of Gln in DRPLA affects subcellular localization of the products. J Hum Genet. 50 (8), 382-394 (2005).
- Bradley, R. K., Merkin, J., Lambert, N. J., Burge, C. B. Alternative splicing of RNA triplets is often regulated and accelerates proteome evolution. PLoS Biol. 10 (1), e1001229 (2012).
- Zheng, C. L., Fu, X. D., Gribskov, M. Characteristics and regulatory elements defining constitutive splicing and different modes of alternative splicing in human and mouse. RNA. 11 (12), 1777-1787 (2005).
- Schaefer, T. S., Sanders, L. K., Nathans, D. Cooperative transcriptional activity of Jun and Stat3 beta, a short form of Stat3. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9097-9101 (1995).
- Waitkus, M. S., et al. Signal integration and gene induction by a functionally distinct STAT3 phosphoform. Mol Cell Biol. 34 (10), 1800-1811 (2014).
- Srivastava, J., DiGiovanni, J.
- Holland, S. M., et al.
- Maritano, D., et al. The STAT3 isoforms alpha and beta have unique and specific functions. Nat Immunol. 5 (4), 401-409 (2004).
- Hevehan, D. L., Miller, W. M., Papoutsakis, E. T. Differential expression and phosphorylation of distinct STAT3 proteins during granulocytic differentiation. Blood. 99 (5), 1627-1637 (2002).
- Yoo, J. Y., Huso, D. L., Nathans, D., Desiderio, S. Specific ablation of Stat3beta distorts the pattern of Stat3-responsive gene expression and impairs recovery from endotoxic shock. Cell. 108 (3), 331-344 (2002).
- Stahl, N., et al. Choice of STATs and other substrates specified by modular tyrosine-based motifs in cytokine receptors. Science. 267 (5202), 1349-1353 (1995).
- Zheng, M., et al. A mix of S and DeltaS variants of STAT3 enable survival of activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells in culture. Oncogenesis. 4, 184 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103 (2004).
- Kelly, E. A., Liu, L. Y., Esnault, S., Quinchia Johnson, B. H., Jarjour, N. N. Potent synergistic effect of IL-3 and TNF on matrix metalloproteinase 9 generation by human eosinophils. Cytokine. 58 (2), 199-206 (2012).
- Whelan, J. A., Russell, N. B., Whelan, M. A. A method for the absolute quantification of cDNA using real-time PCR. J Immunol Methods. 278 (1-2), 261-269 (2003).
- Too, H. P. Real time PCR quantification of GFRalpha-2 alternatively spliced isoforms in murine brain and peripheral tissues. Brain Res Mol Brain Res. 114 (2), 146-153 (2003).
- Turton, K. B., Annis, D. S., Rui, L., Esnault, S., Mosher, D. F. Ratios of Four STAT3 Splice Variants in Human Eosinophils and Diffuse Large B Cell Lymphoma Cells. PloS One. 10 (5), e0127243 (2015).
- Maurer, L. M., et al. Extended binding site on fibronectin for the functional upstream domain of protein F1 of Streptococcus pyogenes. J Biol Chem. 285 (52), 41087-41099 (2010).
- Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Greene Pub. Associates; J. Wiley. (1987).
- Grant, S. G., Jessee, J., Bloom, F. R., Hanahan, D. Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylation-restriction mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (12), 4645-4649 (1990).
- Kocsis, L., Herman, P., Eke, A. The modified Beer-Lambert law revisited. Phys Med Biol. 51 (5), N91-N98 (2006).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29 (9), e45 (2001).
- A-Z of quantitative PCR. Bustin, S. A. , International University Line. (2004).
- Zhang, H. F., Lai, R.
- Caldenhoven, E., et al. STAT3beta, a splice variant of transcription factor STAT3, is a dominant negative regulator of transcription. J Biol Chem. 271 (22), 13221-13227 (1996).
- Zammarchi, F., et al. Antitumorigenic potential of STAT3 alternative splicing modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (43), 17779-17784 (2011).
- Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance. Cell. 165 (3), 535-550 (2016).
- Narimatsu, M., et al. Tissue-specific autoregulation of the stat3 gene and its role in interleukin-6-induced survival signals in T cells. Mol Cell Biol. 21 (19), 6615-6625 (2001).
- Szafranski, K., et al. Physiological state co-regulates thousands of mammalian mRNA splicing events at tandem splice sites and alternative exons. Nucleic Acids Res. 42 (14), 8895-8904 (2014).
- Sundin, M., et al. Novel STAT3 mutation causing hyper-IgE syndrome: studies of the clinical course and immunopathology. J Clin Immunol. 34 (4), 469-477 (2014).
- Oltean, S., Bates, D. O.
- Boultwood, J., Dolatshad, H., Varanasi, S. S., Yip, B. H., Pellagatti, A. The role of splicing factor mutations in the pathogenesis of the myelodysplastic syndromes. Adv Biol Regul. 54, 153-161 (2014).
- Tilgner, H., et al. Comprehensive transcriptome analysis using synthetic long-read sequencing reveals molecular co-association of distant splicing events. Nat Biotechnol. 33 (7), 736-742 (2015).
- Hiller, M., et al. Widespread occurrence of alternative splicing at NAGNAG acceptors contributes to proteome plasticity. Nat Genet. 36 (12), 1255-1257 (2004).
- Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing. Nucleic Acids Res. 38 (18), 6102-6111 (2010).
