Introduction
Short-Range (Tandem) alternatives Spleißen, wo alternative Akzeptor oder Spenderstellen in unmittelbarer Nähe zueinander sind, ist häufig bei Säugetieren 1, wirbellose Tiere und Pflanzen 2 3. Es wird geschätzt , dass 20% der Säugetiergenen enthalten alternativen Spleißstellen 2-12 Nucleotide auseinander 4. Viele dieser Seiten sind drei Nukleotide voneinander entfernt und in Ein- oder Ausschluss eines einzelnen Codon führen. Es ist über die Natur der Splicing Regulierung an diesen Stellen 5,6 mit etwas Argumentieren Debatte , dass die Splicing - Motiv Unterschiede so subtil sind , dass die Auswahl stochastischen 7 ist, während andere Regelung ableiten basierend auf Gewebespezifität 8.
Tandem Spleißstellenauswahl wurde semi-quantitativ analysiert unter Verwendung modifizierter Kapillarelektrophorese 7 und hochauflösende Gelelektrophorese 8. RNA-Seq (RNA-Sequenzierung) liest, kann verwendet werden, um die Spleiß-Verhältnisse an jeder Spleiß zu quantifizierenStandort. Auf diese Weise RNA-Seq Daten 9 Einblick in die Regulation der Tandem - Spleißstellen vorgesehen. Es wurde auch Vorhersage der erwarteten Splice - Variante Verhältnisse basierend auf Nukleotid Motiv 10 aktiviert. Die meisten der Schwerpunkt auf Spleißen, die ein- bzw. ausschließt ein einziges Codon auf den häufiger vorkommenden Tandem-Akzeptor-Spleißstellen wurde, bekannt als NAGNAGs (wobei N ein beliebiges Nukleotid =).
Tandem Spender alternative Spleißstellen mit oder ohne ein einziges Codon (GYNGYN Erkennungsmotiv, wobei Y = Pyrimidin) sind weniger häufig als Tandem in Betracht. Signalgeber und Aktivator der Transkription 3 (STAT3) ist ein Schlüssel - Gen unterziehen Tandem Spender alternatives Spleißen 1,11. Die Tandem - Donor - Spleißstellen verbinden Exons 21 und 22 und in der Aufnahme oder Ausschluss des Codons für Serine-701 (S oder & Delta; S jeweils) 1,11 führen. Downstream alternative Akzeptorstellen (40 Nukleotiden voneinander) Verbinden Exons 22 und23a / b Ergebnis bei der Aufnahme entweder der 55 terminalen Reste der Transaktivierungsdomäne (α) oder einer verkürzten Transaktivierungsdomäne mit 7 einzigartigen C-terminalen Reste (β) 11. Daher sind vier Spleißvarianten möglich.
STAT3 - Protein ist ein Transkriptionsfaktor und Großsignalintegrator in zahlreichen Zelltypen 12 und wenn sie mutiert seine konstitutive Aktivierung trägt zu mehreren Krebs Phänotypen ( beschrieben in Referenz 13). Job-Syndrom, eine Störung , Immundefizienz durch hohe IgE gekennzeichnet auch durch Mutationen in STAT3 verursacht wird ( beschrieben in Referenz 14). Distinct Rollen für STAT3 α und β - Spleißvariante Proteine wurden zuvor beschrieben 15. Zunächst wurde STAT3 β dachte in einer dominant-negative Art und Weise 16 zu handeln, STAT3 α der Transkriptionsaktivität antagonisieren, aber nachfolgende Arbeit vorgeschlagen es 17 unabhängige Zielgene hat 18 phosphoryliert), aber eine aktuelle Studie legt nahe , dass STAT3 S und & Delta; S Splice - Varianten erforderlich sind , sowohl für die Lebensfähigkeit von STAT3-süchtig Diffuse Large B - Zell - Lymphom (DLBLCL) Zellen 19. Die biologische Relevanz bleibt, erkundet zu werden. Da die Spleißvariante Zusammensetzung Funktion beeinflussen können, haben wir versucht, um herauszufinden, ob das Verhältnis von Zytokinstimulation in Eosinophilen gestört wurde.
Wir haben versucht , anfänglich unter Verwendung von PCR spezifisch für STAT3 α und β Spleißvarianten, gefolgt von Spaltung der Produkte mit einem Restriktionsenzym spezifisch für die S - Spleißvarianten, AFEI die Verbindung zwischen den beiden Spleißereignisse zu erkunden. Densitometrie der Erzeugnisse muss angegeben Aufnahme von Ser701 war rbeide STAT3 in α und β oughly zehnmal häufiger als seine Auslassung (& Delta; S) (Daten nicht gezeigt). Allerdings ist diese semi-quantitative Ansatz war nicht ausreichend reproduzierbar und nicht effektiv genutzt werden könnten alle vier Splice-Varianten gleichzeitig zu messen. Zu Anteilen von jeder der vier Spleißvarianten zu analysieren, war es notwendig, eine quantitative PCR (qPCR) Protokoll zu schaffen, die tight technischen (mehrere Assays einer gegebenen Probe) ergab repliziert.
Relative qPCR beruht auf dem Vergleich eines Gens von Interesse zu einem Standard oder Housekeeping - Gen bekannt bis 20 auf einer bestimmten Ebene ausgedrückt werden und ist geeignet , wenn das Gen von Interesse und Housekeeping - Gen mit ähnlicher Effizienz verstärkt werden. Eine doppelsträngige (ds) DNA-bindenden Fluoreszenz (Cyanin) Farbstoff bindet an PCR - Amplikons 21, und nach einer bestimmten Anzahl von Zyklen, ausreichende Verstärkung hat Fluoreszenz detektierbar auftrat. Je höher das Ausgangsniveaudes Transkripts, Wert je niedriger die Schwellenzyklus (Ct). Da die Konzentration der cDNA - Präparate unterscheidet, muss man das Transkript der Konzentration mit der Konzentration eines Transkripts auf ein einheitliches Niveau in allen Proben zu exprimierenden bekannt zu vergleichen, wie Glucuronidase-β (GUSB) in Eosinophilen 22.
Relative qPCR ist nicht möglich für sehr ähnliche Sequenzen, wie in Spleißvarianten gesehen aus tandem Spleißen. Die strengen Bedingungen erforderlich, um speziell die Splice-Varianten verstärken führen zu einer verminderten Leistungsfähigkeit. Stattdessen muss eine absolute Quantifizierung 23 verwendet werden. Dies führt zu einer Standardkurve mit bekannten Konzentrationen des gespleißten Transkript von Interesse Vorbereitung und Sicherstellung PCR - Bedingungen zu optimieren Spezifität 24. Wie beschrieben, absolute und relative qPCR-Daten für ein bestimmtes Gen kann Verständnis des Gens, das die Expression in einem bestimmten Zelltyp zu informieren, zusammengeführt werden, indieser Fall STAT3 in verschiedentlich angeregt Eosinophilen 25.
Hierin wird STAT3 Spleißvariante Quantifizierung mit der Erwartung , beschrieben , dass das Verfahren zur gezielten Studien anderer tandem Spleißereignisse angepasst werden kann. Optimierung war ein langwieriger Prozess, wo mehrere Primerpaare in verschiedenen Konzentrationen und zahlreiche Iterationen der Zyklusparameter wurden im Verlauf von einigen Monaten getestet. Die wichtigsten Merkmale des Protokolls sind die Primer-Spezifität Validierung und Quantifizierung auf Basis von Standardkurven mit bekannten Konzentrationen der Splice-Varianten. Relative qPCR in Verbindung erwies sich als hilfreich für unsere Anwendung ist aber nicht notwendig.
Protocol
HINWEIS: Das periphere Blut Eosinophilen empfangen wurden, ohne mit einem Protokoll genehmigt (# 2013-1570) von der University of Wisconsin-Madison Zentrum für Gesundheitswissenschaften Institutional Review Board Informationen in Übereinstimmung zu identifizieren. Signed informierte Zustimmung von dem Spender wurde für die Verwendung von jeder Probe in der Forschung erhalten.
1. Erstellen von Plasmiden als Vorlage Standards
- Erstellen Primer für eine Amplicon über beide STAT3 - Spleißstellen, mit 5 'KpnI und NheI Restriktionsstellen (und 5'-Erweiterungen) gemäß Tabelle 1a.
HINWEIS: KpnI und NheI - Stellen wurden ausgewählt , um Einsätze ermöglichen , mit Kanamycinresistenz 25,26 ligiert in einen modifizierten pET-28a Vektor werden KpnI - Stelle wurden in die multiple Klonierungsstelle eingefügt.. - Verwendung von frisch gespendeten Eosinophilen, bereiten Doppelproben von 2,5 x 10 6 Zellen / ml in Zellkulturmedium (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium). Inkubieren für 1 Stunde bei 37 ° C unter 5% CO 2 und 10% Luftfeuchtigkeit.
- Bereiten komplementären (c) DNA aus Proben (mindestens 1 x 10 6 Zellen pro Zubereitung) gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung der RNA - Extraktion und cDNA - Synthese - Kits.
- Aus Vorlage cDNA in Schritt 1.2.1 vorbereitet, verstärken STAT3 Splice - Varianten Amplifikation unter Verwendung von PCR gemäß Tabelle 2a.
- Resolve Amplikons in 2% igen Tris-Acetat-Ethylendiamintetraacetat (TAE) Gel 27. Excise Banden aus dem Gel und reinigen nach Gel Exzision Kit Anweisungen.
- Cut Amplicons und Plasmid mit geeigneten Restriktionsenzymen (Übersicht von Restriktions in Referenz 27), unter Verwendung von Mengen, Inkubationszeiten und Temperaturen durch Enzym Anbieter empfohlen; und zu reinigen, wie in Schritt 1.4. Ligieren beschränkt Amplikons in das Plasmid unter provider empfohlenen Bedingungen.
- Bereiten Sie einen negativen Fortsetzungrol (restricted Plasmid-DNA ohne Einsatz aber mit Ligase) und eine positive Kontrolle (frei Plasmid mit Kanamycin-Resistenz). Führen Sie Standard - Plasmid - Transformationen von kompetenten E. coli DH5a 28 unter Verwendung Ligasierungsgemische 27.
- Inkubieren transformierte E. coli in 1 ml Luria-Broth (LB) -Medium (hergestellt wie instruiert 27) bei 37 ° C für 1 h Schütteln. Spread-Transformanten auf LB-Platten, die 50 ug / ml Kanamycin und über Nacht bei 37 ° C inkubiert.
- Wählen Sie mehrere Kolonien aus den STAT3 α und β STAT3 Platten mit sterilen Zahnstochern 27. Übertragen Sie jeweils 2 ml LB. Wachsen Kulturen über Nacht bei 37 ° C in einem Schüttelinkubator.
- Reinige Plasmide aus Bakterienkulturen durch folgenden Anweisungen in einem DNA-Reinigungs-Kits zur Verfügung gestellt. Shop Plasmide bei -20 oder -80 ° C.
- Sequence-Plasmide aus mehreren Kolonien, die durch 20 & mgr; l Reaktionen, Sequenzierung vorbereitet. Pipette 3ul-Sequenzierungsreaktionspuffer, 2 ul-Sequenzierungsreaktionsmischung, 12 & mgr; l Reinstwasser, 1 & mgr; l Plasmid als Matrize und 2 ul Sequenzierungsprimer.
HINWEIS: Wenn pET-28a Vektor, verwenden Sequenzierungsprimer 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG-3 '.- Beurteilen Sie Elektrophoretogrammen der Plasmide kodieren , jede Variante: Sα, Sβ, ΔSα und ΔSβ 25.
- Messen Konzentration reiner Plasmid-DNA in ng / ul. Wenn die Absorption bei 260 nm Lesen mit einem Spektralphotometer, DNA - Konzentration mit dem Beer-Lambert - Gesetz 29 berechnen:
Wobei c = Konzentration, A = Absorbanz, ε (Extinktionskoeffizient) = 0,02 (& mgr; g / ml) -1 cm -1 für doppelsträngige DNA und L = Weglänge von Licht (üblicherweise 1 cm). - Mit Hilfe der Molekulargewichte von STAT3 Spleißvariante cDNA Uhrplicons und der Vektor, berechnen die Kopienzahl pro ul.
HINWEIS: Das Molekulargewicht pro Basenpaar (bp) als 650 Da geschätzt.
2. Analysieren Primer Spezifität für Absolute qPCR
- Vorbereitung 1 in 10 Verdünnungsreihe von STAT3 Plasmiden mit ~ 10. August-10. März Kopien pro & mgr; l (20 & mgr; l) unter Verwendung von Reinstwasser. Messen Konzentration der meisten konzentriert (~ 10 8 Kopien pro ul finden Sie in Schritt 1.11).
- Verwenden verdünnt Plasmide vier "non-target" Mixe vorzubereiten (dh., STAT3 ΔSβ negative Kontrolle , die gleiche Konzentrationen von STAT3 Sα, ΔSα, Sβ aber keine ΔSβ) bei 10 6 Kopien pro ul jeder. Bereiten Sie ein "Ziel" Mischung mit gleichen Konzentrationen aller vier Vorlagen jeweils bei 10 6 Kopien pro ul.
- Bereiten Primerpaar Lösungs für jede Splice - Variante ( siehe Tabelle 1b und siehe Abbildung 1) , indem ~ 60 ul Primer jeweils bei einer 7 & mgr; M - Konzentration (Endkonzentration in der Probe werden 560 nM sein).
- Verdünnen DNA - Polymerase / dsDNA-bindenden Farbstoff - Mix 7: 5 mit reinem H 2 O.
- Richten Sie Assay 1 in einer 96-Well - PCR - Platte wie in Vorlage (Tabelle 3) gezeigt.
- In 21 ul verdünnte DNA - Polymerase / dsDNA-bindenden Farbstoff - Mix, dann 2 ul Primer - Mix und 2 ul - Vorlage (gemäß Tabelle 2b). Statt Vorlage, fügen Sie 2 ul gefiltert H 2 O auf die keine Vorlage Kontrolle (NTC) gut. Richten Sie Reaktionen in doppelter Ausfertigung zu bewerten Wiederholbarkeit 30.
- Seal qPCR Platte mit Klebstoffabdeckung und Zentrifuge für 5 min bei 1200 × g bei 12 ° C.
- Bei der Verwendung von Software , die auf Materialien aufgeführt, setzen Sie up - Experiment , wie beschrieben.
- Schalten Sie qPCR Maschine und Einsatz abgedichtet qPCR Platte. Klicken Sie auf Datei &# 62; Neu> Weiter> Wählen Sie "Neu-Detektor", wählen Sie Reporter, Löscher und Namen angeben. Setzen Sie einen "neuen Detektor" für jede Splice-Variante auf.
- Klicken Sie auf Weiter und einrichten Standards wie aufgefordert auf dem Set Up Probenplatte Seite, um sicherzustellen, Mengen werden in die Tabelle eingetragen und entsprechende Detektoren ausgewählt sind. Klicken Sie auf Finish.
- Radfahren gemäß Tabelle 2b ein. Stellen Sie sicher , dass die Fluoreszenz zu lesen (zu bestimmen Ct) tritt während der 72 ° C Schritt jedes Zyklus. Wählen Sie Ausführen.
- Wenn Lauf abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Registerkarte Ergebnisse> Amplifikationsplot Registerkarte. Bewerten Ausgabe Amplifikationsplot um die Datenqualität zu bewerten (suchen Sie nach einem exponentiellen Plot, wie in Abbildung 2).
HINWEIS: Stellen Sie sicher, Verstärkung Plots sind meist exponentiell und dass der Zyklus Schwelle kann bei dem exponentiellen Teil des Grundstücks festgelegt werden. Stellen Sie sicher, NTCs werden nicht verstärkt und andere Standard-Punkte einen niedrigen Ct-Wert mit einem hohen & Delta; Rn demonstrieren. - export führt zu Tabellenkalkulations-Software, klicken Sie auf Datei> Exportieren> Ergebnisse.
3. Bewertung Absolute qPCR Assay Spezifität und Wiederholbarkeit
- Wiederholbarkeit
- Verwenden Sie die Daten aus Schritt 2.7.5 Standardabweichung von Ct (Schwellenzyklus für Fluoreszenz) Werte zu berechnen.
Wobei N = Anzahl der Proben (2 , wenn doppelt durchgeführt),
= Probe des Ct und 
= Probe Ct bedeuten. Überprüfen Sie, ob die Standardabweichung der Ct - Werte von Duplikaten ≤0.2 ist. Überprüfen Sie, ob Ct - Werte in allen , aber NTC Brunnen sind kleiner als 38. - Wenn die Wiederholbarkeit ist schlecht optimize Zyklierungsparameter entweder durch Erhöhen oder Verringern Glühzeit.
- Verwenden Sie die Daten aus Schritt 2.7.5 Standardabweichung von Ct (Schwellenzyklus für Fluoreszenz) Werte zu berechnen.
- Plot Logkopie tauber vs Ct - Wert (wie in Schritt 1.12 und hergestellt in Schritt 2.1 bestimmt) eine Standardkurve zu erstellen; wodurch man die folgende Gleichung:
Wo y Ct ist, m ist die Steigung, x log (Kopienzahl) und b ist der Schnittwert.
HINWEIS: Der R 2 -Wert von der linearen Regression wird ≥0.95 für gute Daten sein. - Berechnen der Amplifikationseffizienz mit Standardkurve und die Gleichung:
HINWEIS: Ziel für Effizienz ≥75%. - Berechnen Spezifität von qPCR-Assay 1 unter Verwendung von Too-Formel:
Wo Δ Ct Too = Ct Ziel - Ct Nicht-Ziel, die Differenz in der Schwellenzykluszahl für spezifische und unspezifische amp beschreibenlification
HINWEIS: Die Spezifität sollte vier Größenordnungen übersteigen (dh Spezifität Faktor ≥4.).- Wenn Spezifität schlecht ist, zu optimieren, indem Primerkonzentration zu senken. Set up-Assays mit der endgültigen Primerkonzentrationen im Bereich von 100 nm bis 500 nm (wie in den Schritten 2,5-2,7 beschrieben).
= Probe des Ct und 
= Probe Ct bedeuten. Überprüfen Sie, ob die Standardabweichung der Ct - Werte von Duplikaten ≤0.2 ist. Überprüfen Sie, ob Ct - Werte in allen , aber NTC Brunnen sind kleiner als 38. 
4. Durchführung Relative qPCR-Assays
- Behandeln Sie Zellen mit Zytokinen zur Förderung der Transkription.
- Für frisch gespendeten Eosinophilen, bereiten Doppelproben von 2,5 x 10 6 Zellen / ml in Zellkulturmedium (RPMI 1640 - Medium) und behandle mit 50 ng / ml Interleukin-3 (IL3) und / oder 50 ng / ml Tumornekrosefaktor - α ( TNF & agr;) für die Dauer von 3, 6, 9 und 20 h bei 37 ° C unter 5% CO 2 und 10% Luftfeuchtigkeit.
- Bereiten cDNA von Eosinophilen Proben (mindestens 1 x 10 6 Zellen pro Zubereitung) gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung der RNA - Extraktion und cDNA - Synthese - Kits. Bereiten Sie serielle Verdünnungen von zwei Proben cDNA-Aliquots (Kontrolle oder Ruhe Proben), mit einem Verdünnungsbereich von "1" bis "1 in 1024" Verdünnung.
- Für die 1: 4-Verdünnung, Pipette 1 ul cDNA und 3 ul Reinstwasser.
- Für die 1 in 16 Verdünnung, Pipette 1 ul der 1 : 4 - Verdünnung und 3 ul Reinstwasser usw.
- Richten Sie PCR in 96-Well - Platte mit 25 & mgr; l Reaktionen wie beschrieben Schritte 2,3-2,5 aber mit mehreren Primerkonzentrationen für pan- STAT3 und GUSB (siehe Muster in Tabelle 4).
- Add "neue Detektor" für GUSB und folgen Sie den Schritten 2,6-2,7 unter Verwendung der Zyklusparameter beschrieben in Tabelle 2c.
- Standardkurven erzeugen (siehe Schritte 3.2 und 3.3) zu bestimmen, welche Primer-Konzentrationen in 95-100% Verstärkungseffizienz führen.
- Richten Sie Platte mit vorbereiteten cDNA-Proben (aus Schritt 4.2) und optimierte Primerkonzentrationen(siehe Tabelle 2c für Zyklierungsparameter, Reagenzien und Tabelle 5 96-Well - Platte - Vorlage).
- Führen Sie die Schritte 2,6-2,7. Test wiederholen mindestens einmal und Datenqualität überprüfen.
- Berechnen Sie den durchschnittlichen Ct Wert von Duplikatprobe Cts für beide STAT3 und Housekeeping - Gen GUSB.
- Erhalten Δ Ct - Werte für jede Probe.
- Bezeichnen Ruhe Probe ( in der Regel niedrigste Konzentration des Transkripts von Interesse hat) als Probe 0 berechnen ΔΔ Ct 31 für jede Probe (hier als Probe X bezeichnet):
- Berechnen fach-Erhöhung für jede Probe:
- Reproduzierbarkeit
- Berechnen Sie den Variationskoeffizienten (CV) der Kopienzahl für pan- STAT3 und GUSB.
Wobei N = Anzahl der Proben, = Samples berechnet Kopienzahl und = Probe bedeuten. Überprüfen Sie, dass CV jeder Probe (multiple Assays) ist ≤10%.
- Berechnen Sie den Variationskoeffizienten (CV) der Kopienzahl für pan- STAT3 und GUSB.
5. Analyse Absolute qPCR Daten für unbekannte Proben
- Vergleichen Ct - Werte in relativen qPCR erhalten für Housekeeping - Gen GUSB (wie in Schritt 4.9 beschrieben) zu den Proben "cDNA - Konzentrationen in einer Größenordnung sind gewährleisten.
- Verdünnen cDNA entsprechend (zB wenn die Probe 1 ein Ct - Wert von ~ 17,5 hat, und andere Proben 'Ct - Werte sind ~ 21, Probe 1 ist in etwa 2 (21-17,5) = 11 mal konzentrierter Führen Sie eine 1:. 1 - Verdünnung mit Reinstwasser im gleichen Bereich, ohne mehr als nötig verdünnt).
HINWEIS: sehr unterschiedlichen Ausgangskonzentrationen wird Bias die lineare Regressionsanalyse (Schritt 4.12).
- Verdünnen cDNA entsprechend (zB wenn die Probe 1 ein Ct - Wert von ~ 17,5 hat, und andere Proben 'Ct - Werte sind ~ 21, Probe 1 ist in etwa 2 (21-17,5) = 11 mal konzentrierter Führen Sie eine 1:. 1 - Verdünnung mit Reinstwasser im gleichen Bereich, ohne mehr als nötig verdünnt).
- Richten Sie absolute qPCR-Assay von Proben. Bereiten Assay 2a Vorlage Platte für Sα und Sβ gemäß Tabelle 6; und bereiten Test 2b für ΔSα und ΔSβ gemäß Tabelle 7. Führen Sie Tests wie in den Schritten 2.6-2.7.3 (und Tabelle 2b). Wiederholen Sie Tests mindestens einmal.
- Überprüfen Sie die Datenqualität und Export als 2.7.4-2.7.5 in Schritten beschrieben.
- Richten Sie absolute qPCR 96 - Well - Platte mit 25 & mgr; l - Reaktionen unter Verwendung schwenk- STAT3 - Primer (Primer in Tabelle 1c, Vorlage in Tabelle 8) bei 400 & mgr; M und eine Mischung aus allen vier Plasmiden oder ein einzelnes Plasmid bei aufgelistet Gesamtkonzentrationen.
HINWEIS: Effizienz spielt keine Rolle für absolute qPCR, aber die Effizienz dieser Primer Optimierung wichtig für die relative qPCR (Schritt 4). - Seal qPCR Platte mit Klebstoffabdeckung und Zentrifuge für 5 min bei 1200 × g bei 12 ° C.
- Set up "neue Detektor" für pan- STAT3 wie in den Schritten 2.7.1-2.7.3.
- Richten Sie zum Radfahren Pan- STAT3 gemäß Tabelle 2c (gleiche Bedingungen wie im Verhältnis qPCR). Stellen Sie sicher , dass die Fluoreszenz zu lesen (zu bestimmen Ct) tritt während der 72 ° C Schritt jedes Zyklus. Test wiederholen mindestens einmal Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Überprüfen Sie die Datenqualität und Export (siehe Schritte 2.7.4-2.7.5).
- Wenn Verstärkung Plots nicht exponentiell sind (siehe Abbildung 2), verdünnte Probe cDNA (1:10) und Test wiederholen , wie beschrieben (Schritt 5.7).
- Unter Verwendung der Gleichung der Standardkurve (siehe 3.2, Abbildung 3) und die Ct - Werte von Proben, die Kopienzahl jeder Spleißvariante berechnen und von pan- STAT3 in jeder Probe.
- Plot log (absolute qPCR Kopienzahl Werte für pan- STAT3 erhalten) vs log (kumulative absolute qPCR Kopienzahl Werte für die STAT3 Splice - Varianten).
HINWEIS: Ideal lineare Regression und Neigungswerte würden beide ~ 1. - Berechnen Wiederholbarkeit (Schritt 3.1) und Reproduzierbarkeit (Schritt 4.13).
6. Zusammenführen von absoluten und relativen qPCR Daten
- Multiplizieren Sie den Anteil der Variante mit dem Gesamt STAT3 Fold-Anstieg zu berechnen fach-Anstieg jeder Splice - Variante.
- Berechnen Sie die Standardabweichungen (siehe Schritt 3.1.1) der absoluten und relativen Werte zu berücksichtigen, für die Ausbreitung des Fehlers. Bestimmen Sie Standardfehler der Messung (SEM) wie folgt:
Representative Results
Gute Qualität qPCR - Daten wird eine S - förmige Amplifikationsplot (Abbildung 2a), was bedeutet , exponentiellen Anstieg der Transkripte im Laufe des Radsports erzeugen. Das Vorhandensein von zu viel Vorlage kann in einem hohen Fluoreszenzhintergrund zur Folge haben, was bedeutet, eine unangemessene Baseline in den ersten paar Zyklen aufgebaut wird. Wenn die Daten nicht bieten eine exponentielle Kurve (2b), eine weitere Optimierung erforderlich ist (umrissen in den Schritten 3.1 und 3.4). Weitere Informationen zur Behandlung von qPCR Ergebnisse finden 32 zu verweisen. Die Standardkurven für die template - Kalibrator Plasmide erzeugt werden , die Effizienz der Amplifikation (Kurve für STAT3 Sα in Figur 3 gezeigt) zeigen. Effizienzen zwischen 83 und 95% wurden unter den beschriebenen Bedingungen beobachtet. Die Gleichung für die Spezifität (Schritt 3.4) geht davon aus gleicher Effizienz, was unwahrscheinlich 25 ist, so die Spezifitätzu sein, ist wahrscheinlich größer als Spezifität Faktor vermuten lässt.
Um die Kongruenz der STAT3 Ebenen, die Absolutwerte von jeder der vier Spleißvarianten wurden gemessen , sowie die Höhe der Gesamt STAT3, wobei die letzteren unter Verwendung von Primern Amplifizieren einer Region , die für alle vier Spleißvarianten (Figur 4) zu bewerten. Im Idealfall sollte die lineare Regression (Angabe der Korrelation) und Steigung (Verhältnis von pan- STAT3 zu summierten Splice - Varianten) werden sowohl in der Nähe 1.
Die absoluten qPCR - Daten werden dargestellt als Tortendiagramme , die die Anteile der vier Spleißvarianten im Laufe der Zeit nach Stimulation mit Zytokinen (5a) zu zeigen. Ruhen Eosinophilen (0 h) hatte den geringsten Anteil von STAT3 Sα, obwohl diese Variante war immer die häufigste. Multipliziert man den Anteil von STAT3 β Splice - Varianten (S ^6; + ΔSβ) durch den Anteil von STAT3 & Delta; S Splice - Varianten (ΔSα + ΔSβ) ergab durchweg einen Wert , der niedriger als der experimentell aufgezeichneten Wert für ΔSβ. Wenn die Splicingereignisse unabhängig wären, würde man erwarten, dass der Anteil & Delta; S multipliziert Varianten durch den Anteil an β-Varianten würde einen Wert geben, die mit dem experimentell bestimmten Wert übereinstimmt. Höhere ΔSβ als unabhängiger Splicingereignisse erwartet schlägt vor, ein Co-Splicing-Bias existiert.
Zusammenführen von absoluten und relativen qPCR - Daten zeigten , dass das Niveau aller STAT3 Splice - Varianten erhöht post-Stimulation mit Zytokinen IL3 und TNFa, mit Ebenen Peaking 6 Stunden nach der Stimulation (5b - e). Für drei der vier Spleißvarianten, Transkript-Spiegel waren in etwa 3-mal höher in IL3 + TNFa behandelten Eosinophilen (6 h), verglichen mit Eosinophilen in Medienzugleich Punkt. waren STAT3 Sα Ebenen 3,5 - mal höher in IL3 + TNFa behandelt Eosinophilen im Vergleich zu Eosinophilen in den Medien zu diesem Zeitpunkt. Die größte Unsicherheit (größten Standardfehler der Messung) wurde in ΔSβ (Figur 5e) zu sehen ist , die die kleinste Bruchteil der gesamten STAT3 in allen Proben umfasst. Dies war nicht überraschend, da geringere Mengen mit höheren Ct - Werten zugeordnet sind. mehr Zyklen erfordert die Schwellenzyklus Unsicherheit wird Verbindung zu erreichen aufgrund Zyklus-zu-Zyklus-Variation in der Effizienz der Amplifikation.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Primerpaare verwendet qPCR von STAT3 Splice - Varianten und pan-STAT3 auszuführen Primer verwendet , um gezielt jede der STAT3 Splice - Varianten verstärken (Sα, Sβ, ΔSα und ΔSβ beziehungsweise) sind s.hown. Forward - Primer (STAT3 "S" und "& Delta; S") umfassen den Übergang zwischen den Exons 21 und 22. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2:. Amplification Plots von qPCR - Daten (a) Sigmoidale Verstärkung Plots bedeutet zuverlässige Verstärkung. Diese Daten wurden aus qPCR von zwei seriellen Verdünnungen von Plasmid enthalten STAT3 Sα erhalten, wobei jedes Paar von farbigen Linien , die die Fluoreszenzwerte von doppelten verdünnten Proben im Laufe von 40 Zyklen (x-Achse). Die konzentrierte Probe (grün-grau) wurde vom Zyklus 17 ausreichend verstärkt (mit dsDNA-bindenden Farbstoff proportional zur Fluoreszenz auf der y-Achse gezeigt), um die Fluoreszenzschwellenwert (Baseli überschreitenne als grüner Pfeil dargestellt). Die Ct - Wert wäre 17 (b) Nicht-exponentielle Plots vorschlagen, dass der Hintergrund-Fluoreszenz Schwelle nicht korrekt in den ersten Zyklen gegründet wurde. Dies könnte aufgrund der Anwesenheit eines Inhibitors oder hochkonzentrierte Vorlage oder Primer. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Standardkurve des log (Kopienzahl von STAT3 Sα) vs Ct Es besteht eine lineare Beziehung zwischen dem log jedes Zyklus Kopienzahl und der Schwellenwert des STAT3 Spleißvariante (Ct).. Erstellen einer Standardkurve von Plasmid-DNA, die cDNA von Proben Imitate und somitbietet eine bessere Messung als eine Kurve aus verdünnten PCR-Produkte erstellt. Die präsentierten Daten sind Ct - Werte von qPCR von zwei Reihenverdünnungen von Plasmid , das STAT3 Sα erhalten. Aus dieser Kurve kann die Kopienzahl in jeder Probe interpoliert werden, und Verstärkungseffizienz berechnet (83,9%). Obwohl y- fängt weniger reproduzierbar als Steigung sind, schlägt der Schnitt 42,2 Zyklen notwendig wäre derzeit keine Ziel - DNA sicher zu sein , ist. Fehlerbalken zeigen SEM, n = 3. Vergleichbare Kurven wurden für STAT3 Sβ, ΔSα und ΔSβ (nicht dargestellt) ausgebildet ist . Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Vergleich der quantifizierten pan-
Abb . 5: STAT3 Spleißvariante Ebenen schwankten im Verlauf der Zytokin - Behandlung (a) Kreisdiagramme Prozentsätze jedes STAT3 Spleißvariante anzeigtin Eosinophilen während der Behandlung mit IL3 und TNFa. (B - e) Änderungen in STAT3 Splice - Varianten in Eosinophilen mit verschiedenen Kombinationen von Cytokinen behandelt, gemessen durch die Kombination von relativen und absoluten qPCR Daten STAT3 Sα (b), Sβ (c), ΔSα (d) und ΔSβ (e) Ebenen. Zeit nach der Stimulation schwankte über. Levels zunächst erhöht und erreichte 6 Stunden nach der Stimulation. Die IL3 + TNFa Kombination ausgelöst höhere Expression aller vier STAT3 Splice - Varianten als IL3 allein. SEM für jeden Datenpunkt berechnet Bilanzierung für die Ausbreitung des Fehlers. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1: Primer für die Amplifikation verwendet (a), absolut (b) und relativ (c) quantitative PCR. Cloning Primer Restriktionssequenzen und 5'-Erweiterungen für eine effiziente Schneiden. KpnI und NheI Restriktionsstellen sind fett gedruckt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.
Tabelle 2. PCR Zyklusparameter (links) und Reagenzienvolumina (rechts) für die Verstärkung (a), bezogen (b), absolut (c) quantitative PCR. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.
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Tabelle 3:. Template für absolute qPCR Plasmid Kalibrierungs Assay Dieser Assay ist notwendig , Reproduzierbarkeit und Effizienz zu bewerten, sowie die Erzeugung von Standardkurven , aus denen Daten zu interpolieren. Die "Nicht-Ziel" Mixes wird eine Schätzung der Spezifität. Die Optimierung kann erforderlich sein , die Konsistenz zu erreichen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.
Tabelle 4:. Vorlage für die relative qPCR (pan- STAT3 und Housekeeping - Gen GUSB) Kalibrierung Assay Im Gegensatz zu absoluten qPCR, der Punkt dieses Tests ist es, Bedingungen zu bestimmen , bei der Amplifikationseffizienz ist ~ 100%.tp_upload / 54473 / 54473tbl4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.
Tabelle 5:.. Vorlage für die relative qPCR Probe - Test für GUSB schwenk- STAT3 und Housekeeping - Gen Messung Standardkurven werden wiederholt , zusammen mit Proben vergleichbarer Effizienz der Tests zu gewährleisten Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.
Tabelle 6: Vorlage für absolute qPCR Probe - Test zur Messung der S - Varianten Standardkurven werden wiederholt , zusammen mit Proben vergleichbar eff zu gewährleisten. izienz der Assays. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.
Tabelle 7:.. Vorlage für absolute qPCR Probe - Test zur Messung von & Delta; S Varianten Standardkurven werden wiederholt , zusammen mit Proben vergleichbarer Effizienz der Tests zu gewährleisten Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.
Tabelle 8: Vorlage für absolute qPCR Probe - Test für pan- STAT3 zu messen.large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.
Discussion
Wir entwickelten dieses Protokoll, um die Höhe und die Anteile von STAT3 Spleißvariante Transkripte in Eosinophilen und Lymphomzellen und erfahren, ob Zytokinstimulation die Ebenen und Proportionen betroffen zu beurteilen. STAT3 ist von besonderem Interesse wegen seiner pleiotropen und unsicheren Funktionalität mit widersprüchliche Berichte darüber , ob es als ein Onkoprotein oder Tumorsuppressor in Krebs ( beschrieben in Referenz 33). Unterschiede in STAT3 α und β Spleißvariante Funktion zuvor 34,35 und unser Protokoll erleichtert ein Knock-down / re-expression Analyse charakterisiert worden , daß ein Bedarf für ein optimales Verhältnis von S und & Dgr; S Transkripte 19 schlägt.
Eine genaue Quantifizierung der unterschiedlichen Splice-Varianten erleichtern weitere Untersuchungen im Zusammenhang heterogenen STAT3 Funktionsvariante Zusammensetzung Spleiß. Das Protokoll integriert absolute und relative qPCR-Daten, die Fähigkeit ab Kombinationsolute qPCR Spleißvariante Proportionen und die relative qPCR zu messen Veränderungen in der Gesamt STAT3 Ausdruck zu berechnen. Dieser Ansatz ermöglicht eine feine Unterschiede in der Sequenz zu unterscheiden und gleichzeitig Splicing-Verhältnisse bei zwei alternativen Spleißstellen mehr als 50 Nukleotide auseinander zu messen. Die Bestimmung der Verhältnisse der Splicingereignisse hätte einzeln nicht die bemerkenswerte Befund ergab , dass ein Co-Splicing - Bias existiert , so dass ΔSβ Spiegel höher als erwartet , wenn Verwendungen der beiden Standorte werden 25 zufällig gespleißt.
Entscheidend ist, absolute qPCR mit der Verwendung von Plasmid-Eichkurven wird eine Quantifizierung (bei suboptimaler Wirkungsgrad) von splice Variationen, die in sehr ähnlicher Sequenzen führen. Wir erwarten eine neuartige subtile Spleißen qPCR-Assay sollte etwa zwei Monate in Anspruch nehmen zu optimieren. Die wichtigsten Schritte in der Assay - Entwicklung sind die Schaffung von STAT3 Plasmide bei der Erzeugung von Standardkurven für absolute qPCR verwendet; versuchsweiseBestimmung der optimalen Primersequenzen und Zyklierungsparameter Spezifität und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten; und die Integration der relativen qPCR-Daten, die von der Quantifizierung pan-STAT3-Expression im Vergleich zu GAPDH Ausdruck. Die Korrelation der Kopienzahl quantifiziert durch STAT3 gegen kumulative Quantifizierung Pan- (Sα + ΔSα + Sβ + ΔSβ) zeigt , dass das Protokoll zuverlässige Ergebnisse liefert.
Eine Einschränkung der Technik ist die umfassende Validierungsprozess. Es ist notwendig, Intra-Assay-Variabilität (Wiederholbarkeit), Intervariabilität (Reproduzierbarkeit) und Spezifität zu beurteilen. Das Protokoll zeigt Wege numerische Ausgänge für diese Parameter zu erhalten. Wir gelten als Wirkungsgrad ≥75%, Spezifität Faktor ≥4, Variationskoeffizient (Reproduzierbarkeit) ≤10% und Ct Standardabweichung (Wiederholbarkeit) ≤0.2 als geeignete Schwellenwerte 30. Mutationen oder Deletionen in den STAT3-Sequenz Aminosäuren 1-690 nicht discove seinrot durch dieses Protokoll, obwohl sie Splicing Verhältnisse beeinflussen können. Transcript Anteile möglicherweise nicht proportional sein 36 Proportionen proteoform.
Da Proben beginnen Mengen an Gesamt-cDNA, absolute qPCR unterschiedliche haben, ist geeignet zum Vergleich Vergleich Kopienzahlen von Splice-Varianten in einer Probe, aber nicht für die Zwischen Probe gekoppelt, es sei denn mit relativ qPCR ein etabliertes Housekeeping-Gen verwendet wird. Das beschriebene Verfahren Konform MIQE qPCR Richtlinien für die Reproduzierbarkeit 30. PCR Zyklusparameter und Primerkonzentrationen müssen möglicherweise geändert werden, reproduzierbare Daten zu erhalten, wenn andere Geräte verwendet wird. Perfekte Spezifität ohne drastisch beeinträchtigen die Effizienz nicht möglich, aber das Ziel amplifiziert effizienter um mehr als vier Grßenordnungen.
Lineare DNA ist leichter als Kreis verstärkt. Wenn ein alternatives Plasmid nicht zufriedenstellend Kurven Standard stellt (R 2 <; 0,95), betrachten die Plasmid durch Single-Site-Beschränkung Quantifizierung vor Linearisieren. QPCR Optimierung ist von entscheidender Bedeutung für den Erhalt der Daten von guter Qualität (Abbildung 1). Die meisten qPCR-Protokolle basieren auf zweistufigen Radfahren und Maschinen entsprechend optimiert. Ungleichmäßige Erwärmung des Heizblocks kann in dreistufiger cycling verschlimmert werden, zu einer schlechten Reproduzierbarkeit bei. Die Tests müssen eingerichtet werden unter sterilen Bedingungen mit Filter Pipettenspitzen und Reinstwasser, idealerweise in einem speziellen Laminarströmungsabzug. Da Verunreinigungen zu inkonsistenten Ergebnissen führen können, sollten Tests bis unter sterilen Bedingungen mit Filter Pipettenspitzen und Reinstwasser, idealerweise in einem speziellen Laminarströmungsabzug eingestellt werden. Weitere Informationen über die qPCR - Optimierung finden Sie in Bustin et al. 32
STAT3 Quantifizieren kann in einer Reihe von Zusammenhängen zu mehr Einsicht führen. STAT3 automatisch regelt seine eigenen Ausdruck 37, und die oben beschriebenen Protokoll kann helfenzu klären , ob Verhältnisse von STAT3 Splice - Varianten dazu beitragen , dieses positive Feedback - Schleife zu regulieren. Das Protokoll könnte verwendet werden , Verschiebungen in Spleißvariante Verhältnisse zu untersuchen , wie in Zellen bei unterschiedlichen Dichten 38 oder im Laufe der Entwicklung zu beobachten: es ist bekannt , dass die STAT3 α / β Verhältnis ändert auf der Proteinebene während der Hämatopoese 16. Sundin et al. festgestellt , dass ein Intron single nucleotide polymorphism voreingenommen Spleißen von Exon 12 in STAT3 eines Patienten mit Job-Syndrom 39. Es ist denkbar, dass einer der vielen SNPs, die in den Introns zwischen Exon 21 und 22 oder Exons 22 und 23 können jeweils mit Splicing-Verhältnisse von & Dgr; S / S und α / β beitragen. Der Test könnte dazu verwendet werden , um STAT3 - Transkripte in Krebszellen zu quantifizieren, wo Mutationen oder Veränderungen der Splicing Regulierung Vorspannung an den Splicing 40 einführen kann. Mutationen in Spleißfaktoren (wie SF3B1), wie observed in myelodysplastischen Syndromen 41 kann auch zu Veränderungen führen, die von diesem Protokoll gemessen werden kann.
Allgemeiner gesagt, erkennt dieser Ansatz speziell Co-Verband in Spleißen, die mit herkömmlichen RNA-Seq, noch Standard-qPCR nicht möglich ist. Während das Phänomen der sich gegenseitig ausschließe Exon Spleißen Koordination von Spleißen Entscheidungen zeigt, hat sich die Co-Assoziation von anderen Splicingereignisse nicht gut recherchiert. Eine kürzlich beschriebene alternative Verfahren, bei dem RNA-Seq modifiziert wurde , um Volllängen - cDNA zu befragen, schlägt entfernten Spleißereignisse mehr co abhängig sind als bisher 42 gedacht.
STAT3 enthält eine Spleißstelle Spender Tandem. Acceptor Tandem - Spleißstellen sind häufiger 43 und die Prinzipien der skizzierten Protokoll als Ausgangspunkt für die Entwicklung von Assays für die Koinzidenzdetektion von NAGNAG Spleißen und andere Splicingereignisse innerhalb von 200 Nukleotiden dienen könnte. Andere potenliche Anwendungen umfassen die Quantifizierung von Koinzidenz von anderen subtilen Sequenzunterschiede, wie indels oder Doppel / Dreifach - Nukleotid - Polymorphismen 44.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die National Institutes of Health-NHLBI für das Programm Projektstipendium über die Rolle der Eosinophilen in Atemwegsentzündung und Remodeling zu bestätigen: P01HL088584 (PI: N. Jarjour) und der University of Wisconsin Carbone Cancer Center und Department of Medicine für intra-Finanzierung. Wir danken Douglas Annis für die vier STAT3 Varianten klonen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MJ Research PTC-200 Thermal Cycler | GMI | N/A | Used for standard PCR |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | N/A | qPCR machine |
| GS-6R | Beckman Coulter | N/A | centrifuge for 96-well plates |
| Nanodrop 2000 sprectrophotometer | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| RPMI-1640 medium | Sigma Aldrich | R8758 | cell culture medium |
| PfuTurbo DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600410 | DNA polymerase for standard PCR |
| KpnI | New England Biosciences | R0142S | |
| NheI | New England Biosciences | R0131S | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Qiagen | 330523 | qPCR, DNA polymerase/dsDNA-binding dye mix |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74204 | RNA extraction kit |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen (ThermoFisher Scientific) | 18080-044 | cDNA synthesis kit |
| Primers | Integrated DNA Technology | N/A | |
| NEBuffer 1.1 | New England Biosciences | B7201S | |
| GenePure LE Agarose | ISC BioExpress | E-3120-500 | component of TAE gel |
| Pipettors | Major lab suppliers (MLS) | N/A | |
| Filter pipette tips | Neptune Scientific | BT10XL, BT20, BT200 | |
| EU One Piece Thin Wall Plate | MidSci | ABI7501 | |
| ThermalSeal A Sealing Film | MidSci | TSA-100 | 96 well plate seal |
| pET-Elmer (variant of pET-28a) | Novagen; modified in Mosher lab | N/A | Details in PMID: 20947497 |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA purification system | Promega | A1460 | Plasmid purification |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Sequencing kit |
| QIAEX II Gel Extraction kit | Qiagen | 20021 | Amplicon purification |
| DH5α competent cells | ThermoFisher Scientific | 18265-017 | available from several providers, see PMID: 2162051 |
| kanamycin | Research Products International Corp. | K22000-5.0 | |
| Tris base | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | component of TAE buffer |
| Acetic acid, glacial | ThermoFisher Scientific | A38C-212 | component of TAE buffer |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma Chemical Company (Sigma Aldrich) | E-5134 | component of TAE buffer |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | component of Luria Broth |
| Bacto Yeast extract, technical | BD Biosciences | 288620 | component of Luria Broth |
| Sodium chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | component of Luria Broth |
| Sodium hydroxide | ThermoFisher Scientific | SS255-1 | component of Luria Broth |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | component of Luria Broth plate |
| Lasergene SeqBuilder | DNASTAR | Figure 1 generated using Lasergene SeqBuilder software version 12.2.0 (DNASTAR) |
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