Introduction
Kortdistans (tandem) alternativ splitsning, där alternativa acceptor eller donatorställen är i omedelbar närhet till varandra, är vanligt hos däggdjur 1, ryggradslösa djur 2 och växter 3. Det uppskattas att 20% av däggdjursgener innehåller alternativa splitsningsställen 2-12 nukleotider varandra 4. Många av dessa platser är 3 nukleotider från varandra och leda till inkludering eller uteslutning av en enda kodon. Det finns debatt om vilken typ av skarvning reglering på dessa platser 5,6 med några argumentera att skarvning motiv skillnaderna är så subtila att urvalet är stokastisk 7, medan andra sluta reglering baserad på vävnadsspecificitet 8.
Tandem splitsstället urval har analyserats semikvantitativt med hjälp av modifierade kapillärelektrofores 7, och högupplösande gelelektrofores 8. RNA-Seq (RNA-sekvensering) läser kan användas för att kvantifiera splitsförhållandena vid varje skarvplats. På detta sätt har RNA-Seq uppgifter inblick i regleringen av tandem-splitsningsställen 9. Det har också gjort det möjligt att förutsäga förväntade splitsvariantförhållanden baserade på nukleotid motiv 10. De flesta av betoningen på skarvning som inkluderar eller exkluderar en enda kodon har varit på mer vanligt förekommande tandem acceptor-splitsningsställen, så kallade NAGNAGs (där N = vilken nukleotid som helst).
Tandem givar alternativa splitsningsställen, inklusive eller exklusive en enda kodon (GYNGYN erkännande motiv, där Y = pyrimidin) är mindre vanliga än tandemmottagare. Signalomvandlare och aktivator av transkription 3 (STAT3) är en viktig gen genomgår tandem givar alternativ splitsning 1,11. Tandemdonatorsplitsningsställen gå exon 21 och 22 och resulterar i införande eller uteslutning av kodonet för serin-701 (S eller AS respektive) 1,11. Nedströms alternativa acceptorställen (40 nukleotider från varandra) ansluter exon 22 och23a / b resulterar i införandet av antingen 55 terminala rester av transaktiveringsdomänen (α) eller en stympad trans domän med 7 unika C-terminala resterna (p) 11. Därför fyra splitsvarianter är möjliga.
STAT3-proteinet är en transkriptionsfaktor och större signal integrator i flera celltyper 12 och när muterade dess konstitutiv aktivering bidrar till flera cancer fenotyper (granskade i referens 13). Jobs syndrom, en immunbrist sjukdom som kännetecknas av höga nivåer av IgE, är också orsakas av mutationer i STAT3 (översikt i 14 referens). Tydliga roller för STAT3 α och β skarvvariantproteiner har tidigare beskrivits 15. Inledningsvis var STAT3 β tänkt att agera på ett dominant-negativt sätt 16, antagonisering STAT3 α är transkriptionsaktivitet, men efterföljande arbete föreslog det har oberoende målgener 17 18), men en ny studie visar att STAT3 S och AS splitsvarianter är både nödvändigt för livskraft STAT3-beroende diffusa storcelliga B-cellslymfom (DLBLCL) celler 19. Den biologiska relevansen återstår att utforskas. Med tanke på att splitsningsvariant sammansättning kan påverka funktionen, strävade vi att upptäcka om förhållandet störs av cytokinstimulering i eosinofiler.
Vi försökte först att undersöka kopplingen mellan de två splitsningshändelser med hjälp av PCR specifik för STAT3 α och β splitsvarianter, följt av klyvning av produkter med ett restriktionsenzym specifikt för S splitsvarianter, AfeI. Densitometri av produkter indikerade införande av Ser701 var rligt tio gånger vanligare än dess utelämnande (AS) i både STAT3 α och β (data visas ej). Emellertid denna semi-kvantitativ metod inte var tillräckligt reproducerbar, och kunde inte användas effektivt för att mäta allt fyra splitsvarianter samtidigt. För att analysera proportioner av var och en av de fyra splitsvarianter, var det nödvändigt att fastställa en kvantitativ PCR (qPCR) protokoll som gav snäva tekniska (flera analyser av ett givet prov) replikerar.
Relativ qPCR bygger på jämförelse av en gen av intresse till en standard eller housekeepinggen känd för att uttryckas på en viss nivå 20 och är lämpligt när genen av intresse och housekeepinggen förstärks med liknande effektivitet. En dubbelsträngad (ds) DNA-bindande fluorescerande (cyanin) färgämne binder till PCR-amplikoner 21, och efter ett visst antal cykler, har tillräcklig förstärkning skett för fluorescens att kunna detekteras. Ju högre den initiala nivånav transkriptet, desto lägre blir gränsvärdet cykeln (Ct) värde. Eftersom koncentrationen av cDNA preparat skiljer sig måste man jämföra avskriften koncentration med koncentrationen av en avskrift känd för att uttryckas på en jämn nivå i alla prover, som glukuronidas-β (GUSB) i eosinofiler 22.
Relativ qPCR är inte möjligt för mycket liknande sekvenser, som kan ses i splitsvarianter följd av tandem skarvning. De stränga villkor som krävs för att specifikt förstärka splitsvarianter resulterar i minskad effektivitet. I stället måste absolut kvantifiering användas 23. Detta innebär att förbereda en standardkurva med kända koncentrationer av den skarvade avskrift av intresse, och säkerställer PCR-betingelser optimera specificitet 24. Såsom beskrivits, kan absoluta och relativa qPCR data för en särskild gen slås samman för att informera förståelse av genens expression i en speciell celltyp, idetta fall STAT3 i varierande stimulerade eosinofiler 25.
Häri STAT3 splitsvariant kvantifiering beskrivs med förväntningen att metoden kan anpassas till riktade studier av andra tandemsplitsningar. Optimering var en lång process, där flera primerpar i olika koncentrationer och många iterationer av cykelparametrar testades under loppet av några månader. De viktigaste funktionerna i protokollet är validering primer specificitet och kvantifiering baserad på standardkurvor med kända koncentrationer av splitsvarianter. Relativ qPCR i samband visade hjälp för vår ansökan, men är inte nödvändigt.
Protocol
OBS: Perifera blod eosinofiler mottogs utan identifierande information i enlighet med ett protokoll som godkänts (# 2013-1570) vid University of Wisconsin-Madison Center for Health Sciences Institutional Review Board. Tecknat informerat samtycke från donatorn erhölls för användning av varje prov i forskning.
1. Skapa plasmider som mall Standards
- Skapa primers för en amplikon som spänner över både STAT3-splitsningsställen, med 5'- Kpnl och Nhel restriktionsställen (och 5'-extensions) enligt tabell 1a.
OBS: Kpnl och Nhel platserna valdes för att göra det möjligt för skären som skall ligeras in i en modifierad pET-28a vektor med kanamycinresistens 25,26 Kpnl-ställe hade tillsatts i det multipla kloningsstället.. - Med användning av nyligen done eosinofiler, förbereda duplikatprov av 2,5 x 10 6 celler / ml i cellodlingsmedium (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium). Inkubera under 1 h vid 37 ° C under 5% CO2 och 10% fuktighet.
- Förbered kompletterande (c) DNA från prov (minst 1 x 10 6 celler per beredning) enligt tillverkarens anvisningar med hjälp av RNA-extraktion och cDNA syntes kit.
- Från mall cDNA framställt i steg 1.2.1, förstärka STAT3 skarv varianter använder förstärkning PCR enligt tabell 2a.
- Lösa amplikoner i 2% -ig Tris-acetat-etylendiamintetraacetat (TAE) gel 27. Punkt banden från gelén och renas enligt gel excision kit instruktioner.
- Cut amplikoner och plasmid med lämpliga restriktionsenzymer (översikt av begränsning med hänvisning 27), med hjälp av volymer, inkubationstider och temperaturer som rekommenderas av enzymleverantören; och rena såsom i steg 1,4. Ligera begränsade amplikoner i plasmid under leverantörens rekommenderade förhållanden.
- Förbered en negativ fortsrol (restricted plasmid-DNA utan insats men med ligas) och en positiv kontroll (obegränsad plasmid med kanamycinresistens). Utföra standard plasmid transformationer av kompetenta E. coli DH5a 28 Använda ligeringsblandningarna 27.
- Inkubera transformerade E. coli i en ml Luria-buljong (LB) medium (framställt enligt instruktionerna 27) skakning under 1 h vid 37 ° C. Spread transformanter på LB-plattor innehållande 50 | j, g / ml kanamycin och inkubera vid 37 ° C över natten.
- Välj flera kolonier från STAT3 α och STAT3 p plåtarna med sterila tandpetare 27. Överför varje till två ml LB. Väx kulturer över natten vid 37 ° C i en skakinkubator.
- Rena plasmider från bakteriekulturer genom att följa instruktionerna i en DNA-reningskit. Förvara plasmider vid -20 eller -80 ° C.
- Sekvens plasmider från flera kolonier genom att förbereda 20 il sekvenseringsreaktioner. pipet~~POS=TRUNC 3pl sekvensereaktionsbuffert, 2 pl sekvensereaktionsblandning, 12 pl ultrarent vatten, 1 pl plasmid som mall och 2 pl sekvenseringsprimer.
OBS: Om du använder pET-28a vektor, använd sekvense 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG-3 '.- Bedöm electrophoretograms av plasmider som kodar för varje variant: Sα, Sβ, ΔSα och ΔSβ 25.
- Mått koncentration av ren plasmid-DNA i ng / ul. Om behandlingen absorbansen vid 260 nm med en spektrofotometer, beräkna DNA-koncentration med hjälp av Beer-Lambert lag 29:
Där c = koncentration, A = absorbans, ε (extinktionskoefficienten) = 0,02 (ig / ml) -1 cm -1 för dubbelsträngat DNA och L = väglängd av ljus (vanligen 1 cm). - Med hjälp av molekylvikterna för STAT3 splitsningsvariant cDNA amplicons och vektorn, beräkna kopieantalet per pl.
OBS: Molekylvikt per baspar (bp) uppskattas som 650 Da.
2. Analysera Primer specificitet för Absolute qPCR
- Förbered en i 10 spädningsserie av STAT3 plasmider, med ~ 10 8 till 10 tre kopior per il (20 | il) med ultrarent vatten. Mät koncentration av mest koncentrerade (~ 10 8 kopior per il, se steg 1,11).
- Använd utspädda plasmider för att förbereda fyra "icke-mål" mixar (dvs., STAT3 ΔSβ negativ kontroll innehållande lika stora koncentrationer av STAT3 Sα, ΔSα, Sβ men ingen ΔSβ) vid 10 6 kopior per il vardera. Förbered ett "mål" blandas med lika koncentrationer av alla fyra mallar vardera vid 10 6 kopior per il.
- Förbereda primerpar lösnings för varje splitsningsvariant (se tabell 1b och figur 1) genom att göra ~ 60 | il av primers var och en vid ett 7 | iM koncentration (slutlig koncentration i provet kommer att vara 560 nM).
- Späd DNA-polymeras / dsDNA bindande färgämne mix 7: 5 med ren H2O
- Inrättat Assay 1 i en 96-brunnars PCR-platta, såsom visas i mallen (Tabell 3).
- Lägg 21 pl utspädda DNA-polymeras / dsDNA bindande färgämne mix, sedan 2 pl primer mix och 2 pl mall (enligt tabell 2b). I stället för mall, tillsätt 2 pl filtrerade H2O till ingen mall kontroll (NTC) väl. Ställ upp reaktioner i duplikat för att bedöma repeterbarhet 30.
- Tätning qPCR plattan med bindemedlets täckskikt och centrifugera under 5 min vid 1200 xg vid 12 ° C.
- Om du använder programvara noterat på material, inrättat experiment som beskrivs.
- Slå på qPCR maskin och insats förseglade qPCR plattan. Klicka på Arkiv &# 62; Ny> Nästa> Välj "ny detektor", välj reporter, släcknings och ge namn. Inrätta en "ny detektor" för varje skarv variant.
- Välj Nästa och inrätta normer som föran på Konfigurera provplattan sida, se mängder in i tabellen och lämpliga detektorer väljs. Klicka på finish.
- Inrättat cykling enligt tabell 2b. Se till att fluorescensavläsning (för att bestämma Ct) sker under 72 ° C steg i varje cykel. Välj Kör.
- När körningen är klar klickar du på fliken Resultat> fliken Amplification tomt. Utvärdera utgångsförstärknings komplott för att bedöma uppgifternas kvalitet (leta efter en exponentiell kurva, som visas i figur 2).
OBS: Se till att förstärknings tomter är mestadels exponentiell och att tröskelcykeln kan ställas in på den exponentiella delen av tomten. Säkerställa NTCs inte förstärks och andra standardpoäng visar ett lågt Ct värde med en hög ΔRn. - att expOrt resultat till kalkylprogram, klicka på Arkiv> Exportera> Resultat.
3. Bedömning Absolut qPCR analys specificitet och repeterbarhet
- repeterbarhet
- Använder datan från steg 2.7.5 för att beräkna standardavvikelsen för Ct (tröskelcykel för fluorescens) värden.
Där N = antal prover (2 om det görs i duplikat),
= Provets Ct och 
= Prov Ct menar. Kontrollera att standardavvikelsen för Ct-värden av dubbletter är ≤0.2. Kontrollera att Ct-värden i alla utom NTC brunnar är mindre än 38. - Om repeterbarhet är dålig optimera cykelparametrar genom att antingen öka eller minska glödgning tid.
- Använder datan från steg 2.7.5 för att beräkna standardavvikelsen för Ct (tröskelcykel för fluorescens) värden.
- Plot log kopia number (som bestämts i steg 1,12 och framställd i steg 2,1) vs Ct värde för att skapa en standardkurva; vilket gav följande ekvation:
Där y är Ct, m är gradienten, x log (kopieantal) och b är interceptet värdet.
OBS! Värdet för den linjära regressionen R 2 kommer att vara ≥0.95 för bra data. - Beräkna förstärkningseffektiviteten med hjälp av standardkurvan och ekvationen:
OBS: Sikta Effektivitet ≥75%. - Beräkna specificitet från qPCR analys 1 använder för formel:
Där Δ Ct Too = Ct mål - Ct icke-mål, som beskriver skillnaden i tröskelcykelnummer för specifik och icke-specifik förstärkarelification
OBS: Specificitet bör överstiga fyra storleksordningar (dvs. specificitet faktor ≥4.).- Om specificitet är dålig, optimera genom att sänka primer koncentration. Inrättat analyser (såsom beskrivits i steg 2,5-2,7) med slutliga primer koncentrationer från 100 nM till 500 nM.
= Provets Ct och 
= Prov Ct menar. Kontrollera att standardavvikelsen för Ct-värden av dubbletter är ≤0.2. Kontrollera att Ct-värden i alla utom NTC brunnar är mindre än 38. 
4. Utföra Relativa qPCR Analyser
- Behandla Celler med cytokiner för att befrämja transkription.
- För färskdone eosinofiler, förbereda dubbla prover av 2,5 x 10 6 celler / ml i cellodlingsmedium (RPMI 1640-medium) och behandla med 50 ng / ml interleukin-3 (IL3) och / eller 50 ng / ml tumörnekrosfaktor α ( TNFa) under tidsperioder av 3, 6, 9 och 20 h vid 37 ° C under 5% CO2 och 10% fuktighet.
- Förbered cDNA från eosinofila prover (minst 1 x 10 6 celler per beredning) enligt tillverkarens anvisningar med hjälp av RNA-extraktion och cDNA syntes kit. Förbered spädningar av två prov cDNA portioner (kontroll eller vila prover), med en utspädningsintervall från "1" till "en i 1024" utspädning.
- För en i fyra utspädning pipett 1 pl cDNA och 3 l ultrarent vatten.
- För en i 16 utspädning, pipett 1 pl av en i fyra utspädning och 3 l ultrarent vatten, etc.
- Inrättat PCR i 96-brunnar med 25 ul reaktioner som beskrivs stegen 2.3-2.5 men med flera primerkoncentrationer för pan- STAT3 och GUSB (se mall i tabell 4).
- Lägg till "ny detektor" för GUSB och följ steg 2,6-2,7, med cykel parametrar som beskrivs i tabell 2c.
- Generera standardkurvor (se steg 3.2 och 3.3) att avgöra vilka primerkoncentrationer resulterar i 95-100% förstärkningseffektiviteten.
- Ställ in plattan med preparerade cDNA prov (från steg 4,2) och optimerade primerkoncentrationer(se tabell 2c för cykelparametrar, reagens och Tabell 5 96-brunnars platta mall).
- Utför steg 2,6-2,7. Upprepa analys minst en gång och kontrollera datakvaliteten.
- Beräkna den genomsnittliga Ct värdet av dubbelprov Cts för både STAT3 och housekeepinggen GUSB.
- Erhålla Δ Ct-värden för varje prov.
- Utse vilande prov (vanligtvis har lägst koncentration av avskrift av intresse) som prov 0. Beräkna ΔΔ Ct 31 för varje prov (här betecknad som prov X):
- Beräkna fold-ökning för varje prov:
- reproducerbarhet
- Beräkna variationskoefficienten (CV) av antal kopior för pan- STAT3 och GUSB.
Där N = antal prover = prov beräknade antalet kopior och = urvalsmedelvärde. Kontrollera att CV för varje prov (flera analyser) är ≤10%.
- Beräkna variationskoefficienten (CV) av antal kopior för pan- STAT3 och GUSB.
5. Analysera Absolut qPCR data för okända prover
- Jämför Ct-värden som erhållits i relativ qPCR (som beskrivs i steg 4,9) för housekeepinggen GUSB att säkerställa provens cDNA koncentrationer inom en storleksordning.
- Späd cDNA därefter (t.ex. om provet 1 har ett Ct värdet av ~ 17,5, och andra prover "Ct-värdena är ~ 21, prov 1 är ungefär 2 (21-17.5) = 11 gånger mer koncentrerad Utför en 1: 1. Utspädning med ultrarent vatten inom samma intervall utan att späda mer än nödvändigt).
OBS: vitt skilda utgångs koncentrationer snedvrida linjär regressionsanalys (steg 4,12).
- Späd cDNA därefter (t.ex. om provet 1 har ett Ct värdet av ~ 17,5, och andra prover "Ct-värdena är ~ 21, prov 1 är ungefär 2 (21-17.5) = 11 gånger mer koncentrerad Utför en 1: 1. Utspädning med ultrarent vatten inom samma intervall utan att späda mer än nödvändigt).
- Inrätta absolut qPCR analys av prover. Förbered analys 2a mall platta för Sα och Sβ enligt tabell 6; och förbereda analys 2b för ΔSα och ΔSβ enligt tabell 7. Utför analyser som beskrivs i steg 2.6-2.7.3 (och tabell 2b). Upprepa analyser minst en gång.
- Kontrollera datakvalitet och export enligt steg 2.7.4-2.7.5.
- Inrätta absolut qPCR 96 brunnar med 25 ul reaktioner med användning av pan- STAT3 primers (primers i Tabell 1c, mall i tabell 8) på 400 pM och en blandning av alla fyra plasmider eller en enda plasmid till noterade totala koncentrationerna.
OBS: Effektivitet spelar ingen roll för absolut qPCR, men optimera effektiviteten av dessa primers är viktigt för relativ qPCR (steg 4). - Tätning qPCR plattan med bindemedlets täckskikt och centrifugera under 5 min vid 1200 xg vid 12 ° C.
- Ställ in "ny detektor" för pannan- STAT3 som i steg 2.7.1-2.7.3.
- Inrättat cykling för pan STAT3 enligt tabell 2c (samma villkor som relativ qPCR). Se till att fluorescensavläsning (för att bestämma Ct) sker under 72 ° C steg i varje cykel. Upprepa analys minst en gång för att säkerställa reproducerbarhet.
- Kontrollera datakvalitet och export (se steg 2.7.4-2.7.5).
- Om förstärknings tomter är inte exponentiell (se figur 2), späd prov cDNA (1:10) och upprepa analysen som beskrivits (steg 5,7).
- Genom att använda ekvationen för standardkurvan (se 3.2, figur 3) och Ct-värdena för prover, beräkna antalet kopior av varje splitsvariant och pan- STAT3 i varje prov.
- Plot log (absoluta qPCR kopietal värden som erhållits för pan- STAT3) vs log (kumulativa absoluta qPCR kopietal värden för STAT3 splitsvarianter).
OBS: Perfekt linjär regression och lutningsvärden skulle både vara ~ 1. - Beräkna repeterbarhet (steg 3,1) och reproducerbarhet (steg 4,13).
6. Sammanslagningen Absolut och Relativ qPCR data
- Multiplicera andelen varianten med den totala STAT3 fold-ökning för att beräkna fold-ökning med varje splitsningsvariant.
- Beräkna standardavvikelser (se steg 3.1.1) av de absoluta och relativa värdena till svars för förökning av fel. Bestäm standard mätfel (SEM) som visas:
Representative Results
Bra qPCR datakvalitet kommer att generera en sigmoidal förstärkning plot (Figur 2a), vilket innebär exponentiell ökning av transkript under loppet av cykling. Närvaron av alltför mycket mall kan resultera i en hög fluorescens bakgrund, vilket innebär en olämplig baslinje är etablerad i de första få cyklerna. Om uppgifterna inte ger en exponentiell kurva (figur 2b), är ytterligare optimering nödvändigt (som beskrivs i steg 3,1 och 3,4). För ytterligare information om felsökning qPCR resultat, se referens 32. De standardkurvor alstrade för de mall kalibratorzoner plasmider kommer att indikera effektiviteten av amplifiering (kurva för STAT3 Sα visad i figur 3). Effektivitet mellan 83 och 95% observerades under de förhållanden som beskrivs. Ekvationen för specificitet (steg 3,4) förutsätter samma effektivitet, vilket är osannolikt 25, så specificitetenär sannolikt att vara större än specificitet faktor antyder.
För att utvärdera den kongruens av STAT3 nivåer, var de absoluta värdena för var och en av de fyra splitsvarianter mätt liksom nivån av totala STAT3, den senare med hjälp av primers amplifierar en region som är gemensam för alla fyra splitsvarianter (Figur 4). Helst linjär regression (indikation på korrelation) och lutning (förhållandet mellan pan- STAT3 till summerade splitsvarianter) bör båda vara nära ett.
De absoluta qPCR Data presenteras som cirkeldiagram för att visa de proportionerna av de fyra splitsvarianter över tid efter stimulering med cytokiner (figur 5a). Vilande eosinofiler (0 h) hade den minsta andelen STAT3 Sα, men denna variant var alltid den mest förekommande. Multiplicera bråkdel av STAT3 β splitsvarianter (S ^6; + ΔSβ) av den del av STAT3 AS splitsvarianter (ΔSα + ΔSβ) gav genomgående ett lägre värde än det experimentellt registrerade värdet för ΔSβ. Om splitsningshändelser var oberoende, skulle man förvänta sig att multiplicera bråkdel av AS-varianter av den del av p-varianter skulle ge ett värde som överensstämmer med den experimentellt bestämt värde. Högre nivåer av ΔSβ än väntat från oberoende splitsningshändelser antyder en co-skarvnings partiskhet föreligger.
Sammanslagning absoluta och relativa qPCR data visade att halterna av alla STAT3 splitsvarianter ökade efter stimulering med cytokiner IL3 och TNFa, med nivåer topp 6 h efter stimulering (Figur 5b - e). För tre av de fyra splitsvarianter, transkriptnivåer var ungefär 3 gånger högre i IL3 + TNFa behandlade eosinofiler (6 h) jämfört med eosinofiler i mediavid samma tidpunkt. STAT3 Sα nivåer var 3,5 gånger högre i IL3 + TNFa behandlade eosinofiler jämfört med eosinofiler i media vid denna tidpunkt. Den största osäkerheten (största standard mätfel) sågs i ΔSβ (Figur 5e), som består av den minsta fraktionen av totalt STAT3 i alla prover. Detta var inte överraskande, eftersom lägre nivåer är förknippade med högre Ct-värden. Kräver flera cykler för att nå tröskelcykeln förening osäkerhet som beror på cykel-till-cykel variation i effektivitet förstärkning.
Figur 1: Schematisk bild av primerpar används för att utföra qPCR av STAT3 splitsvarianter och pan-STAT3 Primers som används för att specifikt förstärka varje STAT3 splitsvarianter (Sα, Sβ, ΔSα och ΔSβ respektive) är s.hown. Forward primers (STAT3 "S" och "AS") sträcker sig över korsningen mellan exon 21 och 22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Amplification kurvor för qPCR uppgifter (a) sigmoidal förstärknings tomter betyder tillförlitlig förstärkning. Dessa data erhölls från qPCR av två serieutspädningar av plasmid innehållande STAT3 Sα, med varje par av färgade linjer som representerar fluorescensnivåer dubbla utspädda prov under loppet av 40 cykler (x-axeln). Den mest koncentrerade provet (grön-grå) var tillräckligt förstärks av cykel 17 (med dsDNA bindande färgämne i proportion till fluorescens, som visas på y-axeln) för att överskrida tröskeln fluorescensvärdet (baseline visas som grön pil). Dess Ct värde skulle vara 17. (b) Icke-exponentiella tomter tyder på att tröskeln bakgrundsfluorescens inte korrekt bildades de första cyklerna. Detta kan bero på närvaron av en inhibitor, eller högt koncentrerade mall eller primers. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Standard kurva av log (antalet kopior av STAT3 Sα) vs Ct Det finns ett linjärt samband mellan log för varje STAT3 splitsningsvariant exemplar nummer och tröskelcykeln (Ct).. Skapa en standardkurva från plasmid-DNA imiterar cDNA av prov och därmedger ett bättre mått än en kurva som skapas från utspädda PCR-amplikoner. De data som presenteras är Ct-värden erhållna från qPCR av två serieutspädningar av plasmid innehållande STAT3 Sα. Från denna kurva kan antalet kopior i varje prov interpoleras och förstärkning effektiviteten beräknad (83,9%). Även om y-avlyssningar är mindre reproducerbart än lutningen, antyder intercept 42,2 cykler skulle vara nödvändigt att vara säker på att ingen mål-DNA är närvarande. Felstaplar indikerar SEM, n = 3. Jämförbara kurvor konstruerades för STAT3 Sβ, ΔSα och ΔSβ (ej visad). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Jämförelse av kvantifierad pan-
Figur 5:. STAT3 splitsvariant nivåerna fluktuerade under loppet av cytokin behandling (a) cirkeldiagram anger procentandelar av varje STAT3 splitsningsvarianti eosinofiler under behandling med IL3 och TNFa. (B - e) Förändringar i STAT3 splitsvarianter i eosinofiler behandlade med olika kombinationer av cytokiner, mätt genom att kombinera relativa och absoluta qPCR uppgifter STAT3 Sα (b), Sβ (c), ΔSα (d), och ΔSβ (e) nivåer. fluktuerat under tiden efter stimulering. Nivåer initialt ökade, med en topp 6 h efter stimulering. IL3 + TNFa kombination framkallade högre uttryck av alla fyra STAT3 splitsvarianter än IL3 ensam. SEM beräknas för varje datapunkt står för förökning av misstag. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Bord 1: Primrar som användes för amplifiering (a), absolut (b) och relativa (c) kvantitativ PCR. Kloning primers har restriktionssekvenser och 5'-tillägg för effektiv kapning. Kpnl och Nhel restriktionsställen är markerade med fet stil. Klicka här för att se en större version av denna tabell.
Tabell 2. PCR cykelparametrar (till vänster) och reagensvolymer (höger) för förstärkning (a), relativ (b), absolut (c) kvantitativ PCR. Klicka god här för att se en större version av denna tabell.
3 / 54473tbl3.jpg "/>
Tabell 3:. Mall för absolut qPCR plasmid kalibrerings analys är nödvändig Denna analys för att bedöma reproducerbarhet och effektivitet, samt att generera standardkurvor som att interpolera data. De "icke-mål" mixar kommer att ge en uppskattning av specificitet. Optimering kan vara nödvändigt för att uppnå enhetlighet. Klicka här för att se en större version av denna tabell.
Tabell 4:. Mall för relativ qPCR (pan-STAT3 och housekeepinggen GUSB) kalibreringsanalys motsats absolut qPCR, är poängen med denna analys för att bestämma betingelser vid vilka förstärkning effektivitet är ~ 100%.tp_upload / 54.473 / 54473tbl4large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna tabell.
Tabell 5:.. Mall för relativ qPCR provanalys för mätning av pan-STAT3 och housekeepinggen GUSB Standardkurvor upprepas tillsammans med prover för att säkerställa jämförbar effektivitet analyserna Klicka här för att se en större version av denna tabell.
Tabell 6: Mall för absolut qPCR provanalys för mätning av S varianter Standardkurvor upprepas tillsammans med prover för att säkerställa jämförbara eff. iciency av analyserna. Klicka här för att se en större version av denna tabell.
Tabell 7:.. Mall för absolut qPCR provanalys för att mäta AS varianter Standardkurvor upprepas tillsammans med prover för att säkerställa jämförbar effektivitet analyserna Klicka här för att se en större version av denna tabell.
Tabell 8: Mall för absolut qPCR provanalys för mätning av pan- STAT3.large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna tabell.
Discussion
Vi utvecklade detta protokoll för att bedöma nivåerna och proportionerna av STAT3 skarvvarianttranskript i eosinofiler och lymfomceller och ta reda på om cytokinstimulering påverkat nivåer och proportioner. STAT3 är av särskilt intresse på grund av dess pleiotropa och osäker funktionalitet, med motstridiga rapporter om huruvida den fungerar som ett onkoprotein eller tumörsuppressorgen i cancer (översikt i referens 33). Skillnader i STAT3 α och β splitsningsvariant funktion hade präglats tidigare 34,35, och våra protokoll underlättade en knock-down / re-expressionsanalys som tyder på ett behov av ett optimalt förhållande mellan S och AS avskrifter 19.
Exakt kvantifiering av distinkta splitsvarianter kommer att underlätta ytterligare undersökningar att förhålla heterogena STAT3 funktion för att skarva variant komposition. Protokollet integrerar absoluta och relativa qPCR data kombinerar förmågan hos ablöst ämne qPCR att beräkna splitsvariant proportioner och relativa qPCR att mäta förändringar i totala STAT3 uttryck. Detta tillvägagångssätt gör att man kan urskilja subtila skillnader i sekvens och samtidigt mäta skarva förhållanden vid två alternativa splitsningsställen mer än 50 nukleotider från varandra. Bestämning av förhållandena mellan splitsningar för sig skulle inte ha gett den märkliga upptäckten att en co-skarvnings partiskhet fanns så att ΔSβ är högre än väntat om användning av de två platserna är slumpmässigt skarvas 25.
Kritiskt, absolut qPCR med användning av plasmid kalibreringskurvor möjliggör kvantifiering (vid suboptimal effektivitet) av skarvvariationer som resulterar i mycket liknande sekvenser. Vi räknar med en ny subtil skarvning qPCR analysen bör ta ungefär två månader för att optimera. Viktiga steg i analysutveckling är skapandet av STAT3 plasmider som används för att generera standardkurvor för absolut qPCR; experimentelltbestämma optimala primersekvenser och cykel parametrar för att säkerställa specificitet och reproducerbarhet, och integrationen av relativa qPCR data från kvantifiera pan-STAT3 uttryck i förhållande till GAPDH uttryck. Korrelationen mellan antalet kopior kvantifieras genom pan- STAT3 kontra kumulativa kvantifiering (Sα + ΔSα + Sβ + ΔSβ) visar att protokollet ger tillförlitliga resultat.
En nackdel med tekniken är den omfattande valideringsprocessen. Det är nödvändigt att bedöma intra-assay variation (repeterbarhet), interassay variabilitet (reproducerbarhet) och specificitet. Protokollet beskriver sätt att få numeriska utgångar för dessa parametrar. Vi anses effektivitet ≥75%, specificitet faktor ≥4, variationskoefficient (reproducerbarhet) ≤10% och Ct standardavvikelse (repeterbarhet) ≤0.2 som lämpliga trösklar 30. Mutationer eller deletioner i STAT3 sekvens aminosyrorna 1-690 kommer inte att vara discovered av detta protokoll, även om de kan påverka skarva förhållanden. Transcript proportioner kanske inte stå i proportion till proteoform proportionerna 36.
Eftersom prover har olika utgångs mängder av total cDNA, är absolut qPCR lämplig för att jämföra antalet kopior av splitsvarianter i ett prov men inte för inter-prov jämförelse inte i kombination med relativ qPCR hjälp av ett etablerat gen hushållning. Den beskrivna metoden I enlighet med MIQE qPCR riktlinjer för reproducerbarhet 30. PCR-cykelparametrar och primerkoncentrationer kan behöva modifieras för att erhålla reproducerbara data ifall annan utrustning används. Perfekt specificitet är inte möjligt utan att drastiskt avkall på effektiviteten, men målet förstärktes mer effektivt med mer än fyra storleksordningar.
Linjärt DNA lättare förstärks än cirkulär. Om en alternativ plasmid inte ger tillfredsställande standardkurvor (R2 <; 0,95), anser arisering av plasmiden genom en enda plats begränsning före kvantifiering. Optimera qPCR är avgörande för att erhålla data av god kvalitet (figur 1). De flesta qPCR protokoll förlitar sig på två steg cykling och maskiner optimeras i enlighet därmed. Olikformig uppvärmning av värmeblocket kan förvärras i tre-steg cykling, som bidrar till dålig repeterbarhet. Analyser måste ställas in under sterila förhållanden med filter pipettspetsar och ultrarent vatten, helst i en dedikerad laminärt flöde huva. Eftersom föroreningar kan leda till inkonsekventa resultat, bör analyser inrättas under sterila förhållanden med filter pipettspetsar och ultrarent vatten, helst i en dedikerad laminärt flöde huva. För mer information om qPCR optimering, se Bustin et al. 32
Kvantifiera STAT3 kan leda till större insikt i ett antal sammanhang. STAT3 automatiskt reglerar sitt eget uttryck 37, och det protokoll som beskrivs ovan kan hjälpaatt klarlägga om förhållanden av STAT3 splitsvarianter bidra till att reglera denna positiva återkopplingsslingan. Protokollet kan användas för att studera förändringar i skarv variant förhållanden som observerats i celler vid olika densiteter 38 eller under loppet av utveckling: det är känt att STAT3 α / β förhållandet förändringar på proteinnivå under blodbildningen 16. Sundin et al. funnit att en intronisk enstaka nukleotidpolymorfism förspänd splitsning av exon 12 i STAT3 av en patient med Jobs syndrom 39. Det är tänkbart att ett av de många SNP som är närvarande i intronerna mellan exon 21 och 22, eller exon 22 och 23 kan bidra till splitsningsförhållanden av AS / S och α / β respektive. Analysen kan användas för att kvantifiera STAT3-transkript i cancerceller, där mutationer eller förändringar i skarvnings reglering kan införa förspänning till skarvningsprocessen 40. Mutationer i splitsningsfaktorer (som SF3B1), som Observed i myelodysplastiska syndrom 41 kan också leda till förändringar som kan mätas genom detta protokoll.
Mer allmänt, upptäcker denna metod speciellt co-förening i splitsning, vilket inte är möjligt med konventionell RNA-Seq, eller standard qPCR. Medan fenomenet ömsesidigt uteslutande exon skarvning visar samordning av splits beslut, co-sammanslutning av andra splitsningshändelser har inte väl utforskade. En nyligen beskrivits alternativ metod, i vilken RNA-Seq modifierades så att förhöra fullängds-cDNA, tyder avlägsen splitsningshändelser är mer medberoende än man tidigare trott 42.
STAT3 innehåller en donator tandem-splitsningsställe. Acceptor tandem splitsningsställen är vanligare 43 och principerna för den skisserade protokoll skulle kunna fungera som en utgångspunkt för att utveckla analyser för slump upptäckt av NAGNAG skarvning och andra splitsningshändelser inom 200 nukleotider. andra potentiella tillämpningar är kvantifiering av slump andra subtila sekvensskillnader, som InDels eller dubbel / trippel nucleotide polymorphisms 44.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för National Institutes of Health-NHLBI för programprojekt Grant på rollen av eosinofiler i luftvägsinflammation och Remodeling: P01HL088584 (PI: N. Jarjour), och University of Wisconsin Carbone Cancer Center och Institutionen för medicin för intramural finansiering. Vi tackar Douglas Annis för kloning av fyra STAT3 varianterna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MJ Research PTC-200 Thermal Cycler | GMI | N/A | Used for standard PCR |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | N/A | qPCR machine |
| GS-6R | Beckman Coulter | N/A | centrifuge for 96-well plates |
| Nanodrop 2000 sprectrophotometer | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| RPMI-1640 medium | Sigma Aldrich | R8758 | cell culture medium |
| PfuTurbo DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600410 | DNA polymerase for standard PCR |
| KpnI | New England Biosciences | R0142S | |
| NheI | New England Biosciences | R0131S | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Qiagen | 330523 | qPCR, DNA polymerase/dsDNA-binding dye mix |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74204 | RNA extraction kit |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen (ThermoFisher Scientific) | 18080-044 | cDNA synthesis kit |
| Primers | Integrated DNA Technology | N/A | |
| NEBuffer 1.1 | New England Biosciences | B7201S | |
| GenePure LE Agarose | ISC BioExpress | E-3120-500 | component of TAE gel |
| Pipettors | Major lab suppliers (MLS) | N/A | |
| Filter pipette tips | Neptune Scientific | BT10XL, BT20, BT200 | |
| EU One Piece Thin Wall Plate | MidSci | ABI7501 | |
| ThermalSeal A Sealing Film | MidSci | TSA-100 | 96 well plate seal |
| pET-Elmer (variant of pET-28a) | Novagen; modified in Mosher lab | N/A | Details in PMID: 20947497 |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA purification system | Promega | A1460 | Plasmid purification |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Sequencing kit |
| QIAEX II Gel Extraction kit | Qiagen | 20021 | Amplicon purification |
| DH5α competent cells | ThermoFisher Scientific | 18265-017 | available from several providers, see PMID: 2162051 |
| kanamycin | Research Products International Corp. | K22000-5.0 | |
| Tris base | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | component of TAE buffer |
| Acetic acid, glacial | ThermoFisher Scientific | A38C-212 | component of TAE buffer |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma Chemical Company (Sigma Aldrich) | E-5134 | component of TAE buffer |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | component of Luria Broth |
| Bacto Yeast extract, technical | BD Biosciences | 288620 | component of Luria Broth |
| Sodium chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | component of Luria Broth |
| Sodium hydroxide | ThermoFisher Scientific | SS255-1 | component of Luria Broth |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | component of Luria Broth plate |
| Lasergene SeqBuilder | DNASTAR | Figure 1 generated using Lasergene SeqBuilder software version 12.2.0 (DNASTAR) |
References
- Hiller, M., et al. Phylogenetically widespread alternative splicing at unusual GYNGYN donors. Genome Biol. 7 (7), R65 (2006).
- Treacy, M. N., et al. Twin of I-POU: a two amino acid difference in the I-POU homeodomain distinguishes an activator from an inhibitor of transcription. Cell. 68 (3), 491-505 (1992).
- Schindler, S., et al. Alternative splicing at NAGNAG acceptors in Arabidopsis thaliana SR and SR-related protein-coding genes. BMC Genomics. 9, 159 (2008).
- Szafranski, K., Kramer, M. It's a bit over, is that ok? The subtle surplus from tandem alternative splicing. RNA Biol. 12 (2), 115-122 (2015).
- Wang, M., et al. Alternative splicing at GYNNGY 5' splice sites: more noise, less regulation. Nucleic Acids Res. 42 (22), 13969-13980 (2014).
- Hiller, M., Platzer, M. Widespread and subtle: alternative splicing at short-distance tandem sites. Trends Genet. 24 (5), 246-255 (2008).
- Tsai, K. W., Lin, W. C. Quantitative analysis of wobble splicing indicates that it is not tissue specific. Genomics. 88 (6), 855-864 (2006).
- Tadokoro, K., et al. Frequent occurrence of protein isoforms with or without a single amino acid residue by subtle alternative splicing: the case of Gln in DRPLA affects subcellular localization of the products. J Hum Genet. 50 (8), 382-394 (2005).
- Bradley, R. K., Merkin, J., Lambert, N. J., Burge, C. B. Alternative splicing of RNA triplets is often regulated and accelerates proteome evolution. PLoS Biol. 10 (1), e1001229 (2012).
- Zheng, C. L., Fu, X. D., Gribskov, M. Characteristics and regulatory elements defining constitutive splicing and different modes of alternative splicing in human and mouse. RNA. 11 (12), 1777-1787 (2005).
- Schaefer, T. S., Sanders, L. K., Nathans, D. Cooperative transcriptional activity of Jun and Stat3 beta, a short form of Stat3. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9097-9101 (1995).
- Waitkus, M. S., et al. Signal integration and gene induction by a functionally distinct STAT3 phosphoform. Mol Cell Biol. 34 (10), 1800-1811 (2014).
- Srivastava, J., DiGiovanni, J.
- Holland, S. M., et al.
- Maritano, D., et al. The STAT3 isoforms alpha and beta have unique and specific functions. Nat Immunol. 5 (4), 401-409 (2004).
- Hevehan, D. L., Miller, W. M., Papoutsakis, E. T. Differential expression and phosphorylation of distinct STAT3 proteins during granulocytic differentiation. Blood. 99 (5), 1627-1637 (2002).
- Yoo, J. Y., Huso, D. L., Nathans, D., Desiderio, S. Specific ablation of Stat3beta distorts the pattern of Stat3-responsive gene expression and impairs recovery from endotoxic shock. Cell. 108 (3), 331-344 (2002).
- Stahl, N., et al. Choice of STATs and other substrates specified by modular tyrosine-based motifs in cytokine receptors. Science. 267 (5202), 1349-1353 (1995).
- Zheng, M., et al. A mix of S and DeltaS variants of STAT3 enable survival of activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells in culture. Oncogenesis. 4, 184 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103 (2004).
- Kelly, E. A., Liu, L. Y., Esnault, S., Quinchia Johnson, B. H., Jarjour, N. N. Potent synergistic effect of IL-3 and TNF on matrix metalloproteinase 9 generation by human eosinophils. Cytokine. 58 (2), 199-206 (2012).
- Whelan, J. A., Russell, N. B., Whelan, M. A. A method for the absolute quantification of cDNA using real-time PCR. J Immunol Methods. 278 (1-2), 261-269 (2003).
- Too, H. P. Real time PCR quantification of GFRalpha-2 alternatively spliced isoforms in murine brain and peripheral tissues. Brain Res Mol Brain Res. 114 (2), 146-153 (2003).
- Turton, K. B., Annis, D. S., Rui, L., Esnault, S., Mosher, D. F. Ratios of Four STAT3 Splice Variants in Human Eosinophils and Diffuse Large B Cell Lymphoma Cells. PloS One. 10 (5), e0127243 (2015).
- Maurer, L. M., et al. Extended binding site on fibronectin for the functional upstream domain of protein F1 of Streptococcus pyogenes. J Biol Chem. 285 (52), 41087-41099 (2010).
- Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Greene Pub. Associates; J. Wiley. (1987).
- Grant, S. G., Jessee, J., Bloom, F. R., Hanahan, D. Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylation-restriction mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (12), 4645-4649 (1990).
- Kocsis, L., Herman, P., Eke, A. The modified Beer-Lambert law revisited. Phys Med Biol. 51 (5), N91-N98 (2006).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29 (9), e45 (2001).
- A-Z of quantitative PCR. Bustin, S. A. , International University Line. (2004).
- Zhang, H. F., Lai, R.
- Caldenhoven, E., et al. STAT3beta, a splice variant of transcription factor STAT3, is a dominant negative regulator of transcription. J Biol Chem. 271 (22), 13221-13227 (1996).
- Zammarchi, F., et al. Antitumorigenic potential of STAT3 alternative splicing modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (43), 17779-17784 (2011).
- Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance. Cell. 165 (3), 535-550 (2016).
- Narimatsu, M., et al. Tissue-specific autoregulation of the stat3 gene and its role in interleukin-6-induced survival signals in T cells. Mol Cell Biol. 21 (19), 6615-6625 (2001).
- Szafranski, K., et al. Physiological state co-regulates thousands of mammalian mRNA splicing events at tandem splice sites and alternative exons. Nucleic Acids Res. 42 (14), 8895-8904 (2014).
- Sundin, M., et al. Novel STAT3 mutation causing hyper-IgE syndrome: studies of the clinical course and immunopathology. J Clin Immunol. 34 (4), 469-477 (2014).
- Oltean, S., Bates, D. O.
- Boultwood, J., Dolatshad, H., Varanasi, S. S., Yip, B. H., Pellagatti, A. The role of splicing factor mutations in the pathogenesis of the myelodysplastic syndromes. Adv Biol Regul. 54, 153-161 (2014).
- Tilgner, H., et al. Comprehensive transcriptome analysis using synthetic long-read sequencing reveals molecular co-association of distant splicing events. Nat Biotechnol. 33 (7), 736-742 (2015).
- Hiller, M., et al. Widespread occurrence of alternative splicing at NAGNAG acceptors contributes to proteome plasticity. Nat Genet. 36 (12), 1255-1257 (2004).
- Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing. Nucleic Acids Res. 38 (18), 6102-6111 (2010).
