Introduction
Kort rekkevidde (tandem) alternativ spleising, hvor alternative akseptor eller donorsteder er i umiddelbar nærhet til hverandre, er vanlig hos pattedyr 1, virvelløse dyr 2 og planter 3. Det er anslått at 20% av pattedyrgener inneholde alternative spleiseseter 2-12 nukleotider fra hverandre 4. Mange av disse områdene er 3 nukleotider fra hverandre og føre til inkludering eller ekskludering av en enkelt kodon. Det er debatt om innholdet av spleising regulering på disse områdene 5,6 med noen som hevder at de spleising motiv forskjellene er så subtile at utvalget er stokastisk 7, mens andre antyde regulering basert på vev spesifisitet 8.
Tandem spleisesete utvalget har blitt analysert semi-kvantitativt ved hjelp av modifisert kapillær elektroforese 7, og med høy oppløsning gel elektroforese 8. RNA-Seq (RNA-sekvensering) leser kan brukes til å kvantifisere skjøteforhold ved hver skjøtenettstedet. På denne måten har RNA-Seq data gitt innsikt i reguleringen av tandem spleisesetene 9. Det har også gjort det mulig prediksjon av forventet spleisevariant forholdstall basert på nucleotide motiv 10. Mesteparten av vekt på spleising som inkluderer eller ekskluderer et enkelt kodon har vært på mer vanlig forekommende tandem akseptor spleiseseter, kjent som NAGNAGs (der n = et nukleotid).
Tandem donor alternative spleiseseter med eller uten en eneste kodon (GYNGYN anerkjennelse motiv, hvor Y = pyrimidin) er mindre vanlig enn tandem acceptors. Signal svinger og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3) er et sentralt gen gjennomgår tandem donor alternativ spleising 1,11. De tandem donor spleiseseter delta eksoner 21 og 22, og føre til inkludering eller ekskludering av kodon for serin-701 (S eller D s henholdsvis) 1,11. Nedstrøms alternative akseptorseter (40 nukleotider fra hverandre) å bli med eksoner 22 og23a / b resultere i inkludering av enten de 55 terminale rester av trans domenet (α) eller en avkortet trans domene med 7 unike C-terminale rester (P) 11. Derfor fire spleisevarianter er mulige.
STAT3 protein er en transkripsjonsfaktor og store signal integrator i en rekke celletyper 12 og når mutert sin konstitutiv aktivering bidrar til flere kreft fenotyper (anmeldt i referanse 13). Job syndrom, en immunsvikt lidelse preget av høye nivåer av IgE, er også forårsaket av mutasjoner i STAT3 (anmeldt i referanse 14). Distinkte roller for STAT3 α og β spleisevariant proteiner har vært beskrevet tidligere 15. I utgangspunktet var STAT3 β tenkt å handle på en dominant-negativ måte 16, motvirke STAT3 α er transkripsjonen aktivitet, men påfølgende arbeid foreslo det har selvstendige målgener 17 18), men en fersk studie antyder at STAT3 S og D s spleisevarianter er både nødvendig for levedyktigheten til STAT3-avhengige diffuse store B-celle lymfom (DLBLCL) celler 19. Den biologiske relevans gjenstår å bli utforsket. Gitt at spleisevariant sammensetning kan påvirke funksjon, forsøkte vi å finne ut om forholdet ble opprørt av cytokin stimulering i eosinofiler.
Vi først forsøkt å utforske koblingen mellom de to spleis hendelser ved hjelp av PCR spesifikk for STAT3 α og β spleisevarianter, etterfulgt av spaltning av produkter med et restriksjonsenzym som er spesifikt for S spleisevarianter, AfeI. Densitometry av produkter angitt inkludering av Ser701 var roughly ti ganger mer vanlig enn sin unnlatelse (D s) i begge Stat3 α og β (data ikke vist). Men denne semi-kvantitativ metode var ikke tilstrekkelig reproduserbart, og kan ikke brukes effektivt til å måle alle fire spleisevarianter samtidig. For å analysere andeler av hver av de fire spleisevarianter, var det nødvendig å etablere en kvantitativ PCR (qPCR) protokoll som ga trange teknisk (flere undersøkelser av en gitt prøve) replikeres.
Relativ qPCR baserer seg på sammenligning av et gen av interesse for en standard eller husholdningsgenet er kjent for å bli uttrykt på et bestemt nivå 20, og er hensiktsmessig når genet av interesse og husholdningsgenet blir amplifisert med lik effektivitet. Et dobbelt-trådet (ds) DNA-bindende fluorescerende (cyanin) fargestoff bindes til PCR-amplikoner 21, og etter et visst antall sykluser, har tilstrekkelig forsterkning oppstått for fluorescens for å være synlig. Jo høyere den opprinnelige nivåav transkriptet, jo lavere terskelen syklus (Ct) verdi. Siden konsentrasjonen av cDNA forberedelsene er forskjellig, må man sammenligne karakterutskriften konsentrasjon med konsentrasjonen av en transkripsjon kjent for å være uttrykt på et konsistent nivå i alle prøvene, som glucuronidase-β (GUSB) i eosinofile 22.
Relativ qPCR er ikke gjennomførbart for høyt lignende sekvenser, som vist i spleisevarianter som følge av tandem spleising. De strenge betingelser som kreves for å spesifikt forsterke de spleisevarianter resultere i nedsatt effektivitet. I stedet må absolutt kvantifisering benyttes 23. Dette innebærer å utarbeide en standardkurve med kjente konsentrasjoner av skjøtes transkripsjon av interesse, og sikrer PCR betingelser optimalisere spesifisitet 24. Som beskrevet, kan absolutte og relative qPCR data for et bestemt gen bli flettet sammen for å informere forståelse av genets ekspresjon i en spesiell celletype, idette tilfellet STAT3 i varierende stimulert eosinofile 25.
Heri er STAT3 spleisevariant kvantifisering beskrevet i forbindelse med den forventning at fremgangsmåten kan tilpasses til målrettede studier av andre tandem spleisebegivenheter. Optimalisering var en langvarig prosess, hvor flere primerpar ved forskjellige konsentrasjoner og tallrike gjentakelser av Syklusparametrene ble testet i løpet av noen få måneder. De viktigste funksjonene i protokollen er primer spesifisitet validering og kvantifisering basert på standardkurver med kjente konsentrasjoner av spleisevarianter. Relativ qPCR i forbindelse viste seg å være nyttig for vår søknad, men er ikke nødvendig.
Protocol
MERK: Perifere blod eosinofiler ble mottatt uten å identifisere informasjon i samsvar med en protokoll godkjent (# 2013-1570) ved University of Wisconsin-Madison Center for Health Sciences Institutional Review Board. Signert informert samtykke fra donor ble oppnådd ved bruk av hver prøve i forskning.
1. Opprette Plasmider som mal Standards
- Lag primere for et fragment som strekker seg over begge Stat3 spleiseseter, med 5'- Kpnl og NheI restriksjonsseter (og 5'-extensions) som per Tabell 1a.
MERK: KpnI og NheI steder ble valgt for å muliggjøre innsatser for å bli ligert inn en modifisert pET-28a vektor med kanamycin resistens 25,26 Kpnl området hadde blitt lagt inn i multiple kloningssete.. - Ved hjelp av ferske donert eosinofile, forberede duplikate prøver av 2,5 x 10 6 celler / ml i cellekulturmedium (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium). Inkuber i 1 time ved 37 ° C under 5% CO2 og 10% fuktighet.
- Forbered komplementær (c) DNA fra prøvene (minst 1 x 10 6 celler per forberedelse) som per produsentens instruksjoner ved hjelp av RNA-ekstraksjon og cDNA syntese kits.
- Fra templat cDNA fremstilt i trinn 1.2.1, forsterke STAT3 spleisevarianter ved hjelp av PCR i henhold til tabell 2a.
- Løse amplikonene i 2% agarose Tris-acetat-etylendiamintetraacetat (TAE) gel 27. Avgifts band fra gelen og rense ifølge gel excision kit instruksjoner.
- Cut amplikonene og plasmid med passende restriksjonsenzymer (oversikt av begrensning i referanse 27), ved hjelp av volumer, inkubasjonstider og temperaturer som anbefalt av enzymleverandør; og rense som i trinn 1.4. Ligere begrenset amplikonene inn plasmid i henhold til leverandørens anbefalte forhold.
- Forbered en negativ fortsrol (begrenset plasmid DNA uten innsats men med ligase), og en positiv kontroll (fri plasmid med kanamycinresistens). Utføre standard plasmid transformasjoner av kompetente E. coli DH5a 28 bruker ligeringsblandingene 27.
- Inkuber transformert E. coli i 1 ml Luria-buljong (LB) medium (fremstilt som beskrevet 27) risting i 1 time ved 37 ° C. Spre transformanter på LB-plater inneholdende 50 pg / ml kanamycin og inkuberes ved 37 ° C over natten.
- Plukk flere kolonier fra Stat3 α og STAT3 beta plater ved hjelp av sterile tannpirkere 27. Overfør hver til 2 ml LB. Grow kulturer over natten ved 37 ° C i en risteinkubator.
- Rens plasmider fra bakteriekulturer ved å følge instruksjonene i en DNA rensing kit. Oppbevar plasmider ved -20 eller -80 ° C.
- Sekvens plasmider fra flere kolonier ved å forberede 20 mL sekvenseringsreaksjoner. pipette 3pl sekvenseringsreaksjonsbuffer, 2 pl sekvenseringsreaksjonsblanding, 12 ul av ultrarent vann, 1 ul plasmid som templat og 2 ul sekvenseringsprimeren.
MERK: Hvis du bruker Dyre 28a vektor, bruke sekvense primer 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG-3 '.- Vurdere electrophoretograms av plasmider som koder hver variant: Sα, Sβ, ΔSα og ΔSβ 25.
- Mål konsentrasjonen av ren plasmid DNA i ng / mL. Ved lesing absorbans ved 260 nm ved hjelp av et spektrofotometer, beregne DNA-konsentrasjon ved anvendelse av Beer-Lambert loven 29:
Hvor c = konsentrasjon, A = absorbans, ε (ekstinksjonskoeffisient) = 0,02 (ug / ml) -1 cm -1 for dobbeltkjedet DNA og L = banelengde på lys (vanligvis 1 cm). - Ved hjelp av molekylvektene til STAT3 spleisevariant cDNA amplicons og vektoren, beregne kopiantall per mL.
MERK: Molekylvekt per basepar (bp) er beregnet til 650 Da.
2. Analysere Primer spesifisitet for Absolute qPCR
- Fremstille en i 10 fortynningsserie av STAT3 plasmider, med ~ 10 8 10 3 kopier per ul (20 ul) ved hjelp av ultrarent vann. Mål konsentrasjonen av mest konsentrerte (~ 10 8 eksemplarer per mikroliter, se trinn 1.11).
- Bruk utvannet plasmider å forberede fire "non-target" mikser (ie., STAT3 ΔSβ negativ kontroll inneholdt like konsentrasjoner av STAT3 Sα, ΔSα, Sβ men ingen ΔSβ) 10 6 eksemplarer per mL hver. Forbered en "target" blanding med like konsentrasjoner av alle fire maler hver på 10 6 eksemplarer per mL.
- Forbered primerpar løsnings for hvert spleisevariant (se Tabell 1 b og figur 1) ved å gjøre ~ 60 mL av primere som hver ved en konsentrasjon 7 uM (sluttkonsentrasjon i prøven vil være 560 nM).
- Fortynn DNA polymerase / dsDNA-bindende fargestoff mix 7: 5 med ren H 2 O.
- Sett opp Analyse 1 i en 96-brønners PCR-plate som vist i malen (tabell 3).
- Legg 21 mL fortynnet DNA polymerase / dsDNA-bindende fargestoff mix, deretter 2 mL av primer mix og 2 mL av malen (som per tabell 2b). I stedet for mal, tilsett 2 mL filtrerte H 2 O til ingen mal kontroll (NTC) i tillegg. Sett opp reaksjoner i duplikat å vurdere repeterbarhet 30.
- Seal qPCR plate med klebemiddel deksel og sentrifuger i 5 minutter ved 1200 xg ved 12 ° C.
- Hvis du bruker programvaren som er oppført på materialer, sette opp eksperimentet som beskrevet.
- Slå på qPCR maskin og innsats forseglet qPCR plate. Klikk Fil &# 62; Ny> Neste> Velg "New detektor", velg reporter, drikk og gi navn. Sett opp en "ny detektor" for hver spleise variant.
- Velg Neste og satt opp standarder som blir bedt på Konfigurer Sample Plate side, slik at mengder er lagt inn i tabellen og egnede detektorer er valgt. Klikk på finish.
- Sett opp sykling som per tabell 2b. Sikre at fluorescens teller (for å bestemme Ct) skjer under 72 ° C trinn i hver syklus. Velg Kjør.
- Når kjøringen er ferdig, klikker du på> kategorien Resultater Amplification plot. Evaluere utgang forsterkning plottet for å vurdere datakvaliteten (se etter en eksponentiell plott, som i figur 2).
MERK: Sørg for forsterkning tomter er stort sett eksponentiell og at syklusen terskelen kan settes til den eksponentielle del av tomten. Sørg NTCS er ikke forsterket og andre standard punkter demonstrere en lav Ct verdi med en høy ΔRn. - til export resultatene til regneark programvare, klikker du på Fil> Eksporter> Resultater.
3. Vurdere Absolute qPCR analyse spesifisitet og repeterbarhet
- repeterbarhet
- Bruk data fra Trinn 2.7.5 for å beregne standardavviket for Ct (terskel syklus for fluorescens) verdier.
Hvor N = antall prøver (2 hvis det gjøres i duplikat),
= Prøvens Ct og 
= Sample Ct mener. Kontroller at standardavviket Ct verdier av duplikater er ≤0.2. Sjekk at Ct-verdier i alt, men NTC brønner er mindre enn 38. - Hvis repeterbarhet er fattige optimalisere sykkel parametere ved enten å øke eller redusere varmebehandlingstid.
- Bruk data fra Trinn 2.7.5 for å beregne standardavviket for Ct (terskel syklus for fluorescens) verdier.
- Plot log kopi nummener (som bestemt i trinn 1.12 og forberedt i trinn 2,1) vs Ct verdi for å lage en standardkurve; hvilket ga den følgende ligning:
Hvor y er Ct, m er gradienten, er x log (kopiantallet), og b er skjæringsverdien.
MERK: R2 verdien av lineær regresjon vil være ≥0.95 for gode data. - Beregn forsterkningsvirkningsgrad ved hjelp av standardkurve og ligningen:
MERK: Mål for effektivitet ≥75%. - Beregn spesifisitet fra qPCR analysen en hjelp Too formel:
Hvor Δ Ct Too = Ct target - Ct ikke-target, som beskriver forskjellen i terskelen syklus nummer for spesifikk og ikke-spesifikk amplification
MERK: Spesifisitet bør overstige fire størrelsesordener (dvs. spesifisitet faktor ≥4.).- Hvis spesifisitet er dårlig, optimalisere ved å senke primer konsentrasjon. Sett opp assays (som beskrevet i trinn 2,5-2,7) med endelig primer-konsentrasjoner som varierte fra 100 nM til 500 nM.
= Prøvens Ct og 
= Sample Ct mener. Kontroller at standardavviket Ct verdier av duplikater er ≤0.2. Sjekk at Ct-verdier i alt, men NTC brønner er mindre enn 38. 
4. Utføre Relative qPCR Analyser
- Unn Celler med Cytokiner å reklamere transkripsjon.
- For fersk donert eosinofiler, forberede duplikate prøver på 2,5 x 10 6 celler / ml i cellekulturmedium (RPMI 1640 medium) og behandl med 50 ng / ml interleukin-3 (IL3) og / eller 50 ng / ml tumornekrosefaktor α ( TNFa) i perioder på 3, 6, 9 og 20 timer ved 37 ° C under 5% CO2 og 10% fuktighet.
- Forbered cDNA fra eosinofil prøver (minst 1 x 10 6 celler per forberedelse) som per produsentens instruksjoner ved hjelp av RNA ekstraksjon og cDNA syntese kits. Forbered serielle fortynninger av to prøve cDNA porsjoner (kontroll eller hvile prøver), med en fortynning utvalg fra "1" til "1 i 1024" utvanning.
- For en i fire fortynning, pipette en ul cDNA og 3 pl ultrarent vann.
- For en i 16 fortynning, pipette 1 mL av en i fire fortynning og 3 pl ultrarent vann, etc.
- Sett opp PCR i 96-brønners plate med 25 pl reaksjoner som beskrevet trinn 2,3-2,5 men med flere primer konsentrasjoner for pan- STAT3 og GUSB (se mal i tabell 4).
- Legg til "ny detektor" for GUSB og følge trinnene 2,6-2,7, ved hjelp av sykkel parametrene er beskrevet i Tabell 2c.
- Generer standardkurver (se trinn 3.2 og 3.3) for å bestemme hvilken primer konsentrasjoner resultere i 95-100% forsterkning effektivitet.
- Sett opp tallerkenen med preparerte cDNA prøvene (i trinn 4.2) og optimalisert primer konsentrasjoner(se tabell 2c for sykkel parametere, reagenser og Tabell 5 96-brønns plate mal).
- Utfør trinn 2,6-2,7. Gjenta analysen minst en gang og sjekke datakvalitet.
- Beregne gjennomsnittlig Ct verdien av duplikat prøve Cts for både STAT3 og husholdningsgenet GUSB.
- Skaff Δ Ct-verdier for hver prøve.
- Utpeke hvile prøve (vanligvis har lavest konsentrasjon av avskrift av interesse) som prøve 0. Beregn ΔΔ Ct 31 for hver prøve (her betegnet som prøve X):
- Beregn fold-økning for hver prøve:
- reproduserbarhet
- Beregn variasjonskoeffisienten (CV) av kopiantall for pan- STAT3 og GUSB.
Hvor N = antall prøver, = prøvens beregnet kopiantall og = middelverdien av utvalget. Sjekk at CV for hver prøve (flere analyser) er ≤10%.
- Beregn variasjonskoeffisienten (CV) av kopiantall for pan- STAT3 og GUSB.
5. Analysere Absolute qPCR Data for Ukjente Samples
- Sammenligne Ct verdier oppnådd i forhold qPCR (som beskrevet i trinn 4.9) for husholdningsgenet GUSB å sikre prøver 'cDNA konsentrasjonene er innenfor en størrelsesorden.
- Fortynnet cDNA tilsvarende (for eksempel hvis prøven 1 har en Ct verdi på ~ 17,5, og andre prøver 'Ct-verdiene er ~ 21, utvalg 1 er omtrent 2 (21-17.5) = 11 ganger mer konsentrert Utfør en. 1: 1 fortynning med ultrarent vann innenfor det samme område uten å fortynne mer enn nødvendig).
MERK: Vesentlig ulike startkonsentrasjoner vil skjevhet lineær regresjonsanalyse (trinn 4.12).
- Fortynnet cDNA tilsvarende (for eksempel hvis prøven 1 har en Ct verdi på ~ 17,5, og andre prøver 'Ct-verdiene er ~ 21, utvalg 1 er omtrent 2 (21-17.5) = 11 ganger mer konsentrert Utfør en. 1: 1 fortynning med ultrarent vann innenfor det samme område uten å fortynne mer enn nødvendig).
- Sett opp absolutt qPCR analyse av prøver. Forbered analyse 2a mal plate for Sα og Sβ som per Tabell 6; og forberede assay 2b for ΔSα og ΔSβ i henhold til tabell 7 med. Følg assays som beskrevet i trinn 2.6-2.7.3 (og tabell 2b). Gjenta assays minst én gang.
- Sjekk datakvalitet og eksport som beskrevet i trinn 2.7.4-2.7.5.
- Sett opp absolutte qPCR 96-brønners plate med 25 pl reaksjonsblandinger ved hjelp av pan- STAT3 primere (primere i Tabell 1c, mal i tabell 8) ved 400 pM og en blanding av alle fire plasmider eller et enkelt plasmid ved oppført totalkonsentrasjoner.
MERK: Effektivitet spiller ingen rolle for absolutt qPCR, men optimalisere effektiviteten av disse primere er viktig for relativ qPCR (trinn 4). - Seal qPCR plate med klebemiddel deksel og sentrifuger i 5 minutter ved 1200 xg ved 12 ° C.
- Sett opp "nye detektor" for pan- STAT3 som i trinn 2.7.1-2.7.3.
- Sett opp sykling for pan STAT3 pr Tabell 2c (samme betingelser som i forhold qPCR). Sikre at fluorescens teller (for å bestemme Ct) skjer under 72 ° C trinn i hver syklus. Gjenta analysen minst en gang for å sikre reproduserbarhet.
- Sjekk datakvalitet og eksport (se trinn 2.7.4-2.7.5).
- Hvis forsterknings plott er ikke eksponentiell (se figur 2), fortynne prøven cDNA (01:10) og gjenta analyse som beskrevet (trinn 5.7).
- Ved å bruke ligningen for standardkurven (se 3.2, figur 3) og Ct-verdiene av prøver, beregner kopiantallet av alle spleisevariant og av pan STAT3 i hver prøve.
- Plot log (absolutte qPCR kopi tallverdier innhentet for pan- STAT3) vs log (kumulative absolutte qPCR kopi tallverdier for STAT3 spleise varianter).
MERK: Ideal lineær regresjon og helling verdier vil begge være ~ 1. - Beregn repeterbarhet (trinn 3.1) og reproduserbarhet (trinn 4.13).
6. Sammenslåing absolutt og relativ qPCR data
- Multiplisere andelen av varianten med den totale STAT3 fold-økning for å beregne fold-økning på hver spleisevariant.
- Beregne standardavvik (se trinn 3.1.1) av de absolutte og relative verdier for å ta hensyn til forplantning av feil. Bestem standard målefeilen (SEM) som vist:
Representative Results
God kvalitet qPCR data vil generere en sigmoidal forsterkning plottet (figur 2a), som betegner eksponentiell økning i transkripsjoner i løpet av sykling. Tilstedeværelsen av for mye templat kan resultere i en høy fluorescens-bakgrunn, noe som betyr en upassende grunnlinje er etablert i de første sykluser. Hvis dataene ikke gir en eksponentiell kurve (figur 2b), er ytterligere optimalisering er nødvendig (beskrevet i trinn 3.1 og 3.4). For ytterligere informasjon om feilsøking qPCR resultater, se referanse 32. Standardkurver generert for malen kalibratorfluider plasmidene indikerer effektiviteten av utvidelsen (kurve for STAT3 Sα vist i figur 3). Effektivitet mellom 83 og 95% ble observert under de forholdene som er beskrevet. Ligningen for spesifisitet (trinn 3.4) går ut lik effektivitet, noe som gjør det usannsynlig 25, slik at spesifisitetener sannsynlig å være større enn spesifisitet faktor antyder.
For å evaluere den kongruens av STAT3 nivåer, ble de absolutte verdier for hver av de fire spleisevarianter målt, så vel som nivået av total STAT3, de sistnevnte ved hjelp av primere amplifisering av en region som er felles for alle fire spleisevarianter (figur 4). Ideelt lineær regresjon (indikasjon på korrelasjon) og skråning (forholdet mellom pan STAT3 til summerte spleisevarianter) skal begge være nær en.
De absolutte qPCR data er presentert som kakediagrammer for å vise andelene av de fire spleisevarianter over tid etter stimulering med cytokiner (figur 5a). Resting eosinofile (0 time) hadde den minste andelen av STAT3 Sα, selv om denne varianten var alltid den mest tallrike. Multiplisere brøkdel av Stat3 β spleisevarianter (S ^6 + ΔSβ) ved brøkdel av STAT3 D s spleisevarianter (ΔSα + ΔSβ) konsekvent ga en lavere verdi enn eksperimentelt bokført verdi for ΔSβ. Hvis spleise hendelsene var uavhengig, vil man forvente at multiplisere brøkdel av D s varianter av brøkdel av beta varianter vil gi en verdi som er enig med eksperimentelt bestemt verdi. Høyere nivåer av ΔSβ enn forventet fra uavhengige spleise hendelser tyder på en co-spleising skjevhet eksisterer.
Sammenslåing absolutt og relativ qPCR data vist at nivåene av alle Stat3 spleisevarianter økt etter stimulering med cytokiner IL3 og TNFa, med nivåer topp seks timer etter stimulering (figur 5b - e). For tre av de fire spleisevarianter, transkripsjonsnivåer var omtrent 3 ganger høyere i IL3 + TNFa-behandlede eosinofiler (6 hr) i forhold til eosinofiler i mediapå samme tidspunkt. STAT3 Sα nivåer var 3,5 ganger høyere i IL3 + TNFa-behandlede eosinofiler i forhold til eosinofiler i media på dette tidspunkt. Den største usikkerheten (største standard feil av måling) ble sett i ΔSβ (figur 5e), som består av den minste andel av den totale STAT3 i alle prøver. Dette var ikke overraskende, da lavere nivåer er assosiert med høyere Ct-verdier. Krever flere sykluser for å oppnå terskelsyklusen vil sammensatte usikkerhet på grunn av syklus-til-syklus variasjoner i effektiviteten av utvidelsen.
Figur 1: Skjematisk av primerpar brukes til å utføre qPCR av Stat3 spleisevarianter og pan-STAT3 Primere som brukes til å spesifikt forsterke hver av de STAT3 spleisevarianter (Sα, Sβ henholdsvis ΔSα og ΔSβ) er s.hown. Forward primere (STAT3 "S" og "D s") spenner krysset mellom eksoner 21 og 22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 2: Amplification plott av data qPCR (a) sigmoidal forsterknings plott betyr pålitelig forsterkning. Disse data ble erholdt fra qPCR av to serielle fortynninger av plasmid inneholdende STAT3 Sα, med hvert par av fargede linjer som representerer fluorescens nivåene av duplikate prøver fortynnet i løpet av 40 sykluser (x-akse). Den mest konsentrerte prøve (grønn-grå) ble amplifisert ved tilstrekkelig syklus 17 (med dsDNA-bindende fargestoff proporsjonal med fluorescens, som er vist på y-aksen) for å overskride terskelverdien fluorescens-verdi (baseline vises som grønn pil). Dens Ct verdi ville være 17. (b) Ikke-eksponentiell tomter tyder på at bakgrunnen-fluorescens terskel ikke ble riktig etablert i de første syklusene. Dette kan være på grunn av tilstedeværelsen av en inhibitor, eller svært konsentrert mal eller primere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Standard kurve av log (kopiantallet av STAT3 Sα) vs Ct Det er et lineært forhold mellom logaritmen til hver STAT3 spleisevariant er kopiantall og terskelsyklus (Ct).. Opprette en standard kurve fra plasmid DNA imiterer cDNA av prøver og dermedgir en bedre måling enn en kurve laget av utvannet PCR amplikonene. Dataene som presenteres er Ct verdier hentet fra qPCR av to serielle fortynninger av plasmid som inneholder STAT3 Sα. Fra denne kurve kan kopiantallet til stede i hver prøve interpoleres, og forsterkningsvirkningsgrad beregnet (83,9%). Selv om y-avskjærer er mindre reproduserbar enn helling antyder skjærings 42,2 sykluser ville være nødvendig for å være sikker på at ingen mål-DNA er til stede. Feilfelt indikerer SEM, n = 3. Sammenlignbare kurver ble konstruert for STAT3 Sβ, ΔSα og ΔSβ (ikke vist). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Sammenligning av kvantifiserte pan-
Fig. 5: STAT3 spleisevariant nivåer svingt i løpet av cytokin behandling (a) Kake diagram som angir prosenter av hver STAT3 spleisevarianti eosinofiler under behandling med IL3 og TNFa. (B - e) Endringer i STAT3 spleisevarianter i eosinofile celler behandlet med forskjellige kombinasjoner av cytokiner, målt ved å kombinere relative og absolutte qPCR data STAT3 Sα (b), Sβ (c), ΔSα (d), og ΔSβ (e) nivåer. svingt over tid etter stimulering. Nivåer i utgangspunktet økt, med en topp seks timer etter stimulering. Den IL3 + TNFa kombinasjon fremkalte høyere uttrykk av alle fire Stat3 spleisevarianter enn IL3 alene. SEM beregnet for hvert datapunkt regnskap for forplantning av feil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: Primerne anvendt for amplifikasjon (a), absolutt (b) og relativ (c) kvantitativ PCR. Kloning primere har restriksjonssekvenser og 5'-utvidelser for effektiv klipping. KpnI og NheI restriksjonssetene er uthevet. Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Tabell 2. PCR sykling parametere (til venstre) og reagensvolumene (til høyre) for forsterkning (a), relativ (b), absolutt (c) kvantitativ PCR. Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
3 / 54473tbl3.jpg "/>
Tabell 3:. Mal for absolutt qPCR plasmid kalibrerings analyse Denne analysen er nødvendig for å vurdere reproduserbarhet og effektivitet, samt generering av standardkurver som å interpolere data. De "non-target" mikser vil gi et estimat av spesifisitet. Optimalisering kan være nødvendig for å oppnå konsistens. Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Tabell 4:. Mal for relativ qPCR (pan- STAT3 og husholdningsgenet GUSB) kalibrering analysen motsetning absolutt qPCR, poenget med denne analysen er å bestemme forholdene på som forsterkning effektivitet er ~ 100%.tp_upload / 54473 / 54473tbl4large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Tabell 5:.. Mal for relativ qPCR prøve undersøkelse for å måle pan- STAT3 og husholdningsgenet GUSB Standardkurver gjentas sammen med prøvene for å sikre sammenlignbare effektivitet av analysene Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Tabell 6: Mal for absolutt qPCR prøven analyse for måling av S-varianter Standardkurver ble gjentatt, sammen med prøver for å sikre sammenlignbare eff. iciency av analysene. Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Tabell 7:.. Mal for absolutt qPCR prøve undersøkelse for å måle D s varianter Standardkurver gjentas sammen med prøvene for å sikre sammenlignbare effektivitet av analysene Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Tabell 8: Mal for absolutt qPCR prøve undersøkelse for å måle pan- STAT3.large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Discussion
Vi utviklet denne protokollen for å vurdere nivået og proporsjoner av STAT3 spleisevariant transkripsjoner i eosinofile og lymfom celler og lære om cytokin stimulering påvirket nivåer og proporsjoner. STAT3 er av spesiell interesse på grunn av sin pleiotropisk og usikker funksjon, med motstridende rapporter om hvorvidt det fungerer som et oncoprotein eller tumor suppressor i kreft (oversikt i referanse 33). Forskjeller i STAT3 α og β spleisevariant funksjon hadde vært preget tidligere 34,35, og vår protokoll tilrettelagt en knock-down / re-uttrykk analyse som tilsier et behov for et optimalt forhold på S og D s transkripsjoner 19.
Nøyaktig kvantifisering av ulike spleisevarianter vil legge til rette for videre undersøkelser av om heterogen STAT3 funksjon å spleise variant komposisjon. Protokollen integrerer absolutte og relative qPCR data, som kombinerer evnen til aboppløst stoff qPCR å beregne spleise variant proporsjoner, og i forhold qPCR å måle endringer i samlede STAT3 uttrykk. Denne fremgangsmåten gjør det mulig å skille små forskjeller i rekkefølge og samtidig måle skjøteforhold på to alternative spleiseseter mer enn 50 nukleotider fra hverandre. Å bestemme forholdene mellom spleisehendelser enkeltvis ville ikke ha gitt den bemerkelsesverdige funn at en ko-spleise skjevhet eksisterte slik at ΔSβ nivåene er høyere enn forutsatt om anvendelser av de to områdene er tilfeldig skjøtes 25.
Kritisk, absolutt qPCR med bruk av plasmid kalibreringskurver muliggjør kvantifisering (ved sub-optimal effektivitet) av spleisevarianter som resulterer i svært lignende sekvenser. Vi forventer en roman subtil spleising qPCR analysen bør ta omtrent to måneder å optimalisere. Viktige skritt i analysen utvikling er etableringen av Stat3 plasmider som brukes til å generere standardkurver for absolutt qPCR; eksperimenteltbestemme optimal primer sekvenser og sykkel parametere for å sikre spesifisitet og reproduserbarhet; og integrering av relative qPCR data hentet fra kvantifisere pan-STAT3 uttrykk i forhold til GAPDH uttrykket. Korrelasjonen av kopiantall kvantifisert ved pan STAT3 versus kumulative kvantifisering (Sα + ΔSα + Sβ + ΔSβ) viser at protokollen gir pålitelige resultater.
En påminnelse av teknikken er den omfattende valideringsprosessen. Det er nødvendig å vurdere intra-assay variabilitet (repeterbarhet), inter variasjon (reproduserbarhet) og spesifisitet. Protokollen beskriver måter å få numeriske utganger for disse parameterne. Vi anses effektivitet ≥75%, spesifisitet faktor ≥4, variasjonskoeffisient (reproduserbarhet) ≤10% og Ct standardavvik (repeterbarhet) ≤0.2 som egnede terskler 30. Mutasjoner eller slettinger i STAT3 sekvens aminosyrer 1-690 vil ikke være discovered av denne protokollen, selv om de kan påvirke spleise forholdstall. Transkripsjon proporsjoner kan ikke være proporsjonal med proteoform proporsjoner 36.
Siden prøvene har forskjellige utgangsmengder total cDNA, er absolutt qPCR egnet for sammenligning av kopiantall av spleisevarianter innenfor et eksempel, men ikke for inter-prøven sammenlignet med mindre kombinert med relativ qPCR ved hjelp av en etablert husholdningsgenet. Metoden er beskrevet stemmer overens med MIQE qPCR retningslinjer for reproduserbarhet 30. PCR sykling parametere og primer konsentrasjoner kan måtte endres for å få reproduserbare data om annet utstyr som brukes. Perfekt spesifisitet er ikke mulig uten at det går drastisk effektivitet, men målet ble amplifisert mer effektivt ved mer enn fire størrelsesordener.
Linear DNA er lettere forsterket enn sirkulære. Ved en alternativ plasmid som ikke gir tilfredsstillende standardkurver (R 2 <; 0,95), vurdere linear plasmidet ved enkelt nettsted begrensning før kvantifisering. Optimalisering qPCR er avgjørende for å oppnå gode kvalitetsdata (figur 1). De fleste qPCR protokoller stole på to-trinns sykling, og maskinene er optimalisert tilsvarende. Ikke-uniform oppvarming av varmeblokken kan forverres i tre-trinns sykling, bidrar til dårlig repeterbarhet. Analyser må settes opp under sterile forhold med filter pipetter og ultrarent vann, helst i en egen laminær hette. Fordi miljøgifter kan føre til inkonsistente resultater, bør analyser settes opp under sterile forhold med filter pipetter og ultrarent vann, helst i en egen laminær hette. For mer informasjon om qPCR optimalisering, se Bustin et al. 32
Kvantifisering STAT3 kan føre til større innsikt i en rekke sammenhenger. STAT3 automatisk regulerer sin egen ekspresjon 37, og den protokoll som er beskrevet ovenfor, kan hjelpeå belyse hvorvidt prosenter av Stat3 spleisevarianter bidrar til å regulere denne positive feedback loop. Protokollen kan brukes til å studere forandringer i spleisevariant forhold som observert i celler hos forskjellige densiteter 38 eller i løpet av utvikling: Det er kjent at STAT3 α / β forholdet endringer på proteinnivået i løpet av hematopoiesis 16. Sundin et al. fant at en intronic enkeltnukleotidpolymorfi partisk spleising av ekson 12 i STAT3 av en pasient med Job syndrom 39. Det er tenkelig at en av de mange SNP er tilstede i intronene mellom ekson 21 og 22, eller exon 22 og 23 kan bidra til skjøte forhold mellom D s / S og α / β respektivt. Analysen kan brukes til å kvantifisere STAT3 transkripter i kreftceller, hvor mutasjoner eller endringer i spleise regulering kan innføre forspenning til skjøteprosessen 40. Mutasjoner i spleise faktorer (som SF3B1), som observatøred i myelodysplastisk syndrom 41 kan også føre til endringer som kan måles ved denne protokollen.
Mer generelt, denne tilnærmingen oppdager spesielt co-foreningen i spleising, som ikke er mulig med konvensjonell RNA-Seq, og heller ikke standard qPCR. Mens fenomenet gjensidig utelukkende exon spleising demonstrerer koordinering av spleise beslutninger, co-sammenslutning av andre spleise hendelser har ikke blitt godt undersøkt. En nylig beskrevne alternativ fremgangsmåte, hvori RNA-Seq ble modifisert slik at avhøre full-lengde cDNA, tyder fjernt spleising arrangementer er mer co-avhengige enn tidligere antatt 42.
STAT3 inneholder en donor tandem spleisesetet. Akseptor tandem spleiseseter er hyppigere 43 og prinsippene i den skisserte protokollen kan tjene som et utgangspunkt for å utvikle analyser for påvisning av sammentreff NAGNAG spleising og andre spleisehendelser innenfor 200 nukleotider. andre Potenlige bruksområder er kvantifisering av sammentreff av andre subtile sekvens forskjeller, som indels eller dobbelt / trippel nukleotid polymorfismer 44.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke National Institutes of Health-NHLBI for Programmet Prosjekt Grant om rollen Eosinofile i Airway betennelse og remodeling: P01HL088584 (PI: N. Jarjour), og University of Wisconsin Carbone Cancer Center og Institutt for indremedisin for egenutført finansiering. Vi takker Douglas Annis for kloning de fire Stat3 varianter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MJ Research PTC-200 Thermal Cycler | GMI | N/A | Used for standard PCR |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | N/A | qPCR machine |
| GS-6R | Beckman Coulter | N/A | centrifuge for 96-well plates |
| Nanodrop 2000 sprectrophotometer | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| RPMI-1640 medium | Sigma Aldrich | R8758 | cell culture medium |
| PfuTurbo DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600410 | DNA polymerase for standard PCR |
| KpnI | New England Biosciences | R0142S | |
| NheI | New England Biosciences | R0131S | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Qiagen | 330523 | qPCR, DNA polymerase/dsDNA-binding dye mix |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74204 | RNA extraction kit |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen (ThermoFisher Scientific) | 18080-044 | cDNA synthesis kit |
| Primers | Integrated DNA Technology | N/A | |
| NEBuffer 1.1 | New England Biosciences | B7201S | |
| GenePure LE Agarose | ISC BioExpress | E-3120-500 | component of TAE gel |
| Pipettors | Major lab suppliers (MLS) | N/A | |
| Filter pipette tips | Neptune Scientific | BT10XL, BT20, BT200 | |
| EU One Piece Thin Wall Plate | MidSci | ABI7501 | |
| ThermalSeal A Sealing Film | MidSci | TSA-100 | 96 well plate seal |
| pET-Elmer (variant of pET-28a) | Novagen; modified in Mosher lab | N/A | Details in PMID: 20947497 |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA purification system | Promega | A1460 | Plasmid purification |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Sequencing kit |
| QIAEX II Gel Extraction kit | Qiagen | 20021 | Amplicon purification |
| DH5α competent cells | ThermoFisher Scientific | 18265-017 | available from several providers, see PMID: 2162051 |
| kanamycin | Research Products International Corp. | K22000-5.0 | |
| Tris base | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | component of TAE buffer |
| Acetic acid, glacial | ThermoFisher Scientific | A38C-212 | component of TAE buffer |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma Chemical Company (Sigma Aldrich) | E-5134 | component of TAE buffer |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | component of Luria Broth |
| Bacto Yeast extract, technical | BD Biosciences | 288620 | component of Luria Broth |
| Sodium chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | component of Luria Broth |
| Sodium hydroxide | ThermoFisher Scientific | SS255-1 | component of Luria Broth |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | component of Luria Broth plate |
| Lasergene SeqBuilder | DNASTAR | Figure 1 generated using Lasergene SeqBuilder software version 12.2.0 (DNASTAR) |
References
- Hiller, M., et al. Phylogenetically widespread alternative splicing at unusual GYNGYN donors. Genome Biol. 7 (7), R65 (2006).
- Treacy, M. N., et al. Twin of I-POU: a two amino acid difference in the I-POU homeodomain distinguishes an activator from an inhibitor of transcription. Cell. 68 (3), 491-505 (1992).
- Schindler, S., et al. Alternative splicing at NAGNAG acceptors in Arabidopsis thaliana SR and SR-related protein-coding genes. BMC Genomics. 9, 159 (2008).
- Szafranski, K., Kramer, M. It's a bit over, is that ok? The subtle surplus from tandem alternative splicing. RNA Biol. 12 (2), 115-122 (2015).
- Wang, M., et al. Alternative splicing at GYNNGY 5' splice sites: more noise, less regulation. Nucleic Acids Res. 42 (22), 13969-13980 (2014).
- Hiller, M., Platzer, M. Widespread and subtle: alternative splicing at short-distance tandem sites. Trends Genet. 24 (5), 246-255 (2008).
- Tsai, K. W., Lin, W. C. Quantitative analysis of wobble splicing indicates that it is not tissue specific. Genomics. 88 (6), 855-864 (2006).
- Tadokoro, K., et al. Frequent occurrence of protein isoforms with or without a single amino acid residue by subtle alternative splicing: the case of Gln in DRPLA affects subcellular localization of the products. J Hum Genet. 50 (8), 382-394 (2005).
- Bradley, R. K., Merkin, J., Lambert, N. J., Burge, C. B. Alternative splicing of RNA triplets is often regulated and accelerates proteome evolution. PLoS Biol. 10 (1), e1001229 (2012).
- Zheng, C. L., Fu, X. D., Gribskov, M. Characteristics and regulatory elements defining constitutive splicing and different modes of alternative splicing in human and mouse. RNA. 11 (12), 1777-1787 (2005).
- Schaefer, T. S., Sanders, L. K., Nathans, D. Cooperative transcriptional activity of Jun and Stat3 beta, a short form of Stat3. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9097-9101 (1995).
- Waitkus, M. S., et al. Signal integration and gene induction by a functionally distinct STAT3 phosphoform. Mol Cell Biol. 34 (10), 1800-1811 (2014).
- Srivastava, J., DiGiovanni, J. Non-canonical Stat3 signaling in cancer. Mol Carcinog. , (2015).
- Holland, S. M., et al. STAT3 mutations in the hyper-IgE syndrome. N Engl J Med. 357 (16), 1608-1619 (2007).
- Maritano, D., et al. The STAT3 isoforms alpha and beta have unique and specific functions. Nat Immunol. 5 (4), 401-409 (2004).
- Hevehan, D. L., Miller, W. M., Papoutsakis, E. T. Differential expression and phosphorylation of distinct STAT3 proteins during granulocytic differentiation. Blood. 99 (5), 1627-1637 (2002).
- Yoo, J. Y., Huso, D. L., Nathans, D., Desiderio, S. Specific ablation of Stat3beta distorts the pattern of Stat3-responsive gene expression and impairs recovery from endotoxic shock. Cell. 108 (3), 331-344 (2002).
- Stahl, N., et al. Choice of STATs and other substrates specified by modular tyrosine-based motifs in cytokine receptors. Science. 267 (5202), 1349-1353 (1995).
- Zheng, M., et al. A mix of S and DeltaS variants of STAT3 enable survival of activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells in culture. Oncogenesis. 4, 184 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103 (2004).
- Kelly, E. A., Liu, L. Y., Esnault, S., Quinchia Johnson, B. H., Jarjour, N. N. Potent synergistic effect of IL-3 and TNF on matrix metalloproteinase 9 generation by human eosinophils. Cytokine. 58 (2), 199-206 (2012).
- Whelan, J. A., Russell, N. B., Whelan, M. A. A method for the absolute quantification of cDNA using real-time PCR. J Immunol Methods. 278 (1-2), 261-269 (2003).
- Too, H. P. Real time PCR quantification of GFRalpha-2 alternatively spliced isoforms in murine brain and peripheral tissues. Brain Res Mol Brain Res. 114 (2), 146-153 (2003).
- Turton, K. B., Annis, D. S., Rui, L., Esnault, S., Mosher, D. F. Ratios of Four STAT3 Splice Variants in Human Eosinophils and Diffuse Large B Cell Lymphoma Cells. PloS One. 10 (5), e0127243 (2015).
- Maurer, L. M., et al. Extended binding site on fibronectin for the functional upstream domain of protein F1 of Streptococcus pyogenes. J Biol Chem. 285 (52), 41087-41099 (2010).
- Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Greene Pub. Associates; J. Wiley. (1987).
- Grant, S. G., Jessee, J., Bloom, F. R., Hanahan, D. Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylation-restriction mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (12), 4645-4649 (1990).
- Kocsis, L., Herman, P., Eke, A. The modified Beer-Lambert law revisited. Phys Med Biol. 51 (5), N91-N98 (2006).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29 (9), e45 (2001).
- A-Z of quantitative PCR. Bustin, S. A. , International University Line. (2004).
- Zhang, H. F., Lai, R. STAT3 in cancer-friend or foe. Cancers (Basel). 6 (3), 1408-1440 (2014).
- Caldenhoven, E., et al. STAT3beta, a splice variant of transcription factor STAT3, is a dominant negative regulator of transcription. J Biol Chem. 271 (22), 13221-13227 (1996).
- Zammarchi, F., et al. Antitumorigenic potential of STAT3 alternative splicing modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (43), 17779-17784 (2011).
- Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance. Cell. 165 (3), 535-550 (2016).
- Narimatsu, M., et al. Tissue-specific autoregulation of the stat3 gene and its role in interleukin-6-induced survival signals in T cells. Mol Cell Biol. 21 (19), 6615-6625 (2001).
- Szafranski, K., et al. Physiological state co-regulates thousands of mammalian mRNA splicing events at tandem splice sites and alternative exons. Nucleic Acids Res. 42 (14), 8895-8904 (2014).
- Sundin, M., et al. Novel STAT3 mutation causing hyper-IgE syndrome: studies of the clinical course and immunopathology. J Clin Immunol. 34 (4), 469-477 (2014).
- Oltean, S., Bates, D. O. Hallmarks of alternative splicing in cancer. Oncogene. 33 (46), 5311-5318 (2014).
- Boultwood, J., Dolatshad, H., Varanasi, S. S., Yip, B. H., Pellagatti, A. The role of splicing factor mutations in the pathogenesis of the myelodysplastic syndromes. Adv Biol Regul. 54, 153-161 (2014).
- Tilgner, H., et al. Comprehensive transcriptome analysis using synthetic long-read sequencing reveals molecular co-association of distant splicing events. Nat Biotechnol. 33 (7), 736-742 (2015).
- Hiller, M., et al. Widespread occurrence of alternative splicing at NAGNAG acceptors contributes to proteome plasticity. Nat Genet. 36 (12), 1255-1257 (2004).
- Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing. Nucleic Acids Res. 38 (18), 6102-6111 (2010).
