快速一步酶法合成海藻糖类似物的全净化水
Summary
Trehalose analogues are emerging as important molecules for bio(techno)logical and biomedical applications. We describe an optimized protocol for enzymatically synthesizing and purifying trehalose analogues that is simple, efficient, fast, and environmentally friendly. Its application to the rapid production and administration of a probe for the detection of mycobacteria is demonstrated.
Abstract
化学修饰的海藻糖，或海藻糖类似物的版本，在生物学，生物技术和制药科学应用，其他领域中。例如，海藻糖类似物轴承可检测标记已被用于检测结核分枝杆菌 ，并且可以具有应用程序作为结核病诊断显像剂。海藻糖水解稳定版本也正在采取由于其用作无热量甜味剂和生物保护剂的潜力。尽管这类的各种应用的化合物的吸引力，其潜在的由于缺乏对他们的生产一个健壮的路由的仍未实现。在这里，我们报告海藻糖类似物的快速，高效的生物催化一步合成绕过与化学合成相关的问题进行详细的协议。通过利用从Thermoproteus TENAX耐高温海藻糖合酶（TRET）酶，海藻糖类似物可以是发电机密封编在从葡萄糖类似物和高收率尿苷二磷酸葡萄糖单一步骤在15-60分钟（不超过定量转化）。一个简单的和快速的非色谱纯化协议，它由旋透析和离子交换的，可以在水溶液中在短短的45分钟递送已知浓度的许多海藻糖类似物。在未反应的葡萄糖类似物仍保持的情况下，可以进行海藻糖类似物产物的色谱纯化。总体而言，该方法提供了快速合成和海藻糖类似物纯化即是有效的，可访问的非化学家“绿色”生物催化的平台。为了举例说明了该方法的适用性，我们描述了一种协议，用于合成，所有水的净化，和基于海藻糖点击化学探针分枝杆菌，所有这些都用了不到1小时，使分枝杆菌的荧光检测的施用。在未来，我们设想，除OTH呃应用中，该协议可以被应用到基于海藻糖探针结核病诊断的快速合成。例如，短寿命核素改性的海藻糖类似物（ 例如 ，（18）F-改性海藻糖）可用于先进的临床成像方式如正电子发射断层扫描，计算机断层扫描（PET-CT）。
Introduction
海藻糖是由由1,1-α，α-糖苷键（ 图1A）连接的两个葡萄糖部分的对称非还原二糖。而海藻糖是从人类和其他哺乳动物不存在，它是在细菌，真菌，植物和无脊椎动物1常见。海藻糖在大多数生物体的主要作用是为了防止环境压力，如干燥1。另外，一些人病原体需要海藻糖毒力，包括结核引起结核分枝杆菌 ，它利用海藻糖作为细胞膜的生物合成的介体和作为一个积木为免疫调节糖脂2的结构。
图1： 海藻糖和海藻糖类似物。 （A天然海藻糖和非天然海藻糖类似物，其中X是一个结构修改的）结构。在具有如biopreservation和生物成像的潜在应用的文献报道海藻糖类似物（B）的实施例。
由于其独特的结构和生理功能，海藻糖已经引起显著悉心生物（TECHNO）使用逻辑和生物医学应用3。在以自然观察如海藻糖的保护性能，其惊人的能力，以帮助维持生命在经历了极度脱水4 -具备刺激了biopreservation应用中的广泛使用的“复活”的植物。海藻糖已被用于保持一个宽的生物样品，如核酸，蛋白质，细胞和组织3个这样的阵列。例如，海藻糖在许多药物t一起使用作为稳定添加剂帽是在市场上，包括几个抗癌单克隆抗体3。还有，海藻糖用作在食品工业中的甜味剂，它广泛地用于在两个食品和化妆品工业产品保存。海藻糖为这些类型的商业应用的采用最初是由无法从天然来源或通过合成获得纯海藻糖的大批量的限制。然而，对于经济的生产从淀粉海藻糖的有效酶促过程最近被开发出来，这刺激了其广泛的商业用途 5。
化学修饰的海藻糖的衍生物，在此称为海藻糖类似物，都获得了越来越多的关注的各种应用（在图1A中所示的通用结构; 图1B示出的海藻糖的类似物的具体例子）6。例如，乳海藻糖海藻糖类似物与半乳糖代替其葡萄糖单位之一，因此它的4-位羟基具有倒置立体化学构。乳海藻糖具有相同的稳定性质海藻糖而是降解抗性通过肠酶，使得它作为一种无热量的食品添加剂6,7吸引力。
本集团的海藻糖类似物的兴趣，主要涉及他们的具体分枝杆菌探针和抑制剂的价值。巴里和Davis组开发了荧光素共轭酮海藻糖类似物，命名为FITC酮基海藻糖，这被证明代谢标记的活结核分枝杆菌的细胞壁，通过荧光显微镜8启用其检测。所述Bertozzi教授实验室开发小叠氮基海藻糖（TreAz）类似物，可以代谢标记细胞壁，随后是DETected使用点击化学和荧光分析9。这些进步指向使用基于海藻糖探针作为结核病诊断显像剂的可能性。海藻糖类似物也已实行如结核分枝杆菌的抑制剂由于其潜在的破坏在用于活性和毒力10，11，12所必需的细菌通路。
到目前为止，主要障碍显影海藻糖类似物的生物（TECHNO）逻辑和生物医学应用是缺乏有效的合成方法。这两个传统路线，以生产海藻糖类似物依靠化学合成（ 图2）。一种途径涉及天然海藻糖desymmetrization /修改，而另一个涉及开始适当官能化单糖积木并且执行化学糖基化，以伪造1,1-α，α-糖苷键。这些方法中，最近已在综述文章13,14所讨论的，已经证明了从结核分枝杆菌 15完成小批量的复杂含海藻糖的天然产品，例如sulfolipid-1的多步合成是有用的。然而，这两种方法一般是低效率的，耗费时间，不能访问非化学家和，另外，不被认为是环境友好的。因此，用于合成某些类型的海藻糖类似物，这些策略是不理想的。
图2： 途径海藻糖合成类似物。化学方法对海藻糖合成类似物，如左图所示，使用包括难以PROTEC多步程序化/去保护，desymmetrization，和/或糖基化的步骤。酶法合成，如右图所示，使用酶，以立体转换简单，未受保护的基材海藻糖在水溶液中的类似物。本文所报道酶促协议使用海藻糖合酶（TRET）酶对葡萄糖类似物和UDP-葡萄糖转化成海藻糖类似物在一个单一的步骤。 请点击此处查看该图的放大版本。
海藻糖类似物的高效生物催化路线将促进生产，评价，这个充满希望的类分子的应用。而海藻糖生产5商用酶促过程并不适用于合成的类似物，因为它利用淀粉作为底物，还有其它生物合成路径在大自然的方式，可为海藻糖合成类似物被利用。但是，这方面的研究，这是最近点评 ，是有限的。一份报告使用的大肠杆菌海藻糖合成途径的启发方法，从相应的氟葡萄糖访问单个氟海藻糖类似物。然而，这种方法需要一个三酶系统具有有限的效率和通用性8。已探索了另一种方法是在相反方向，这在原理允许从葡萄糖类似物和葡萄糖-1-磷酸6，16，17海藻糖类似物的一步合成使用海藻糖磷酸酶（TREP）。虽然这种方法可能有未来的承诺，反相以及留住TrePs目前有用于模拟合成的缺点。例如，反相TrePs具有令人望而却步EXPEnsive供体分子（β-D-葡萄糖-1-磷酸）和保留TrePs具有差的酶表达产率/稳定性和有限的基板滥交。显著的改善（ 例如 ，通过酶工程）将前TREP介导的模拟合成需要的是实用的。
目前，对于海藻糖类似物的酶促合成的最实际的方法是使用一个海藻糖合酶（TRET）酶，它转换葡萄糖和尿苷二磷酸（UDP）的葡萄糖转化为海藻糖在一个单一的步骤6。我们最近报道了使用Thermoproteus TENAX TRET-热稳定和单向酶18的-to从葡萄糖类似物和UDP-葡萄糖（ 图3）19合成海藻糖类似物。这种酶只操作在合成方向，并且避免在TREP系统中发现海藻糖降解的问题。这一步反应库仑ð在1小时内完成，并且各种各样海藻糖类似物在高产率被访问从容易获得的葡萄糖类似物基板（ 见表1中的代表性的成果（高达> 99％为通过高效液相色谱法（HPLC）测定）部分）。
图3： 海藻糖类似物TRET催化一步法合成。从T. TENAX所述TRET酶可立体选择性加入现成的葡萄糖类似物和UDP-葡萄糖以形成海藻糖类似物中的一个步骤。 R 1〜R 4 =可变结构修饰，例如叠氮，氟，脱氧，硫代，立体，或同位素标记的修改; Y =可变的杂原子，例如氧或硫，或同位素标记的杂原子。
在这里，我们提供的广告etailed协议用于TRET合成过程中，其中包括从大肠杆菌表达和TRET的纯化，优化TRET反应条件，那就是在水相中完全进行的改进纯化方法。该修改协议使得在半制备规模（10-100毫克）多样海藻糖类似物的权宜和高效合成和纯化。我们还证明了制备和在不到1小时，这使分枝杆菌细胞的快速荧光检测施用基于海藻糖探针分枝杆菌使用该协议。
Protocol
Representative Results
Discussion
海藻糖类似物有冲击各个领域，从食物和药品的保存到微生物感染6的诊断和治疗的潜力。现有的多步化学合成方法是要修改后的多个站点生产复杂海藻糖类似物有用的（ 如 ，自然发生的复杂的分枝杆菌糖脂）。然而，这些方法不可避免地冗长和低效的，即使当施加到比较简单的单取代海藻糖类似物9，13，14</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a grant from the National Institutes of Health (R15 AI117670) to B.M.S and P.J.W, as well as a Cottrell College Scholar Award from the Research Corporation (20185) to P.J.W. L.M.M. was supported by a Provost’s Fellowship from CMU.
Materials
| LB agar | Research Products International | L24021 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | |
| Luria broth | Research Products International | L24045 | |
| Terrific Broth | Research Products International | T15050 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma Aldrich | A3256 | |
| Phosphate-buffered Saline | GE Healthcare | SH30256 | |
| Imidazole | Sigma Aldrich | I5513 | |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286 | |
| Sodium phosphate, | Fisher Scientific | S374 | |
| monobasic | |||
| Syringe filter, 0.45 µm | Fisher Scientific | 09719D | |
| Protease Inhibitor mini-tablets, EDTA-free | Thermo Scientific | 88666 | |
| HisTrap HP nickel affinity column, 5 mL | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| TRIS base ultrapure | Research Products International | T60040 | |
| Dialysis tubing, MWCO 12–14,000 | Fisher Scientific | 21-152-16 | |
| Glucose analogues | CarboSynth, | Examples of vendors that offer numerous glucose analogues | |
| Sigma Aldrich, | |||
| Santa Cruz Biotechnology, American Radiolabeled Chemicals | |||
| 6-Azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz) | CarboSynth | MA02620 | |
| UDP-Glucose | abcam Biochemicals | ab120384 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fisher Scientific | M33 | |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit | EMD Millipore | UFC901008 | |
| Bio-Rex RG 501-X8 mixed-bed ion-exchange resin | Bio-Rad | 444-9999 | |
| Extra-Fine Bio-Gel P2 media | Bio-Rad | 150-4118 | |
| Glass-backed silica gel thin-layer chromatography plates | EMD Millipore | 1056280001 | |
| n-Butanol | Fisher Scientific | A399 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | S25310A | |
| Sulfuric acid | Fisher Scientific | A300 | |
| Acetonitrile | EMD Millipore | AX0145 | |
| Deuterium oxide, 99.8% | Acros Organics | 351430075 | |
| Aminopropyl HPLC column | Sigma Aldrich | 58338 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Para-formaldehyde | Ted Pella | 18505 | |
| Alkyne-488 | Sigma Aldrich | 761621 | |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Click Chemistry Tools | 1061 | |
| tert-Butanol | Sigma Aldrich | 360538 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | W387520 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | |
| Fluoromount-G mounting medium | Southern Biotechnology | 10001 |
References
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