一步快速酶法合成及全水相纯化海藻糖类似物

摘要

海藻糖类似物正逐渐成为生物（技术）学和生物医学应用中的重要分子。本文介绍了一种优化的酶法合成与纯化海藻糖类似物的实验方案，该方法简便、高效、快速且环境友好。文中展示了该方法在快速制备和使用一种用于检测分枝杆菌的探针中的应用。

摘要

化学修饰的海藻糖或海藻糖类似物在生物学、生物技术、药物科学等领域具有广泛应用。例如，带有可检测标记的海藻糖类似物已被用于检测 结核分枝杆菌 并可作为结核病诊断成像试剂。由于海藻糖的水解稳定型版本具有用作非热量甜味剂和生物保护剂的潜力，相关研究也正在开展。尽管此类化合物在多种应用中颇具吸引力，但因其缺乏高效可靠的合成途径，其潜力尚未得到充分实现。本文报道了一种快速、高效的一步法生物催化合成海藻糖类似物的详细方案，该方法避免了化学合成中存在的问题。通过利用来自 Thermoproteus tenax，海藻糖类似物可通过葡萄糖类似物与尿苷二磷酸葡萄糖在15–60分钟内一步高效生成（转化率可达定量水平）。一种简单快速的非色谱纯化方案，包含离心透析和离子交换步骤，可在短短45分钟内获得多种已知浓度的海藻糖类似物水溶液。若反应后仍有未反应的葡萄糖类似物残留，可对海藻糖类似物产物进行色谱纯化。总体而言，该方法提供了一种 "绿色" 用于快速合成与纯化海藻糖类似物的生物催化平台，具有高效且易于非化学专业人员操作的特点。为展示该方法的适用性，我们描述了一种针对分枝杆菌的海藻糖基点击化学探针的合成、全水相纯化及给药的实验方案，整个过程耗时不足1小时，并实现了分枝杆菌的荧光检测。未来，我们设想该方案可应用于结核病诊断用海藻糖基探针的快速合成。例如，短半衰期放射性核素修饰的海藻糖类似物（例如, ¹⁸F修饰的海藻糖）可用于正电子发射断层扫描-计算机断层扫描（PET-CT）等先进的临床成像技术。

引言

海藻糖是一种对称的非还原性二糖，由两个葡萄糖单元通过1,1-α,α-糖苷键连接而成（图1A）。尽管人类及其他哺乳动物体内不存在海藻糖，但它广泛存在于细菌、真菌、植物和无脊椎动物中¹。在大多数生物体中，海藻糖的主要功能是抵御环境胁迫，例如干燥¹。此外，某些人类病原体的致病性依赖于海藻糖，包括引起结核病的Mycobacterium tuberculosis，该菌利用海藻糖作为细胞包膜生物合成的媒介物，以及构建免疫调节性糖脂的结构单元²。

图 1： 海藻糖及海藻糖类似物。 （A）天然海藻糖与非天然海藻糖类似物的结构，其中 X 为结构修饰位点。（B）文献报道的具有生物保存和生物成像应用潜力的海藻糖类似物示例。

方案

1. 从Top10 E. coli 中表达并纯化TreT

注意：请与作者联系以获取表达 TreT 的 E. coli 菌株（pBAD TreT 质粒，含有在 AraC 蛋白调控下的 T. tenax tret 基因，已转化至 Top10 E. coli¹⁹）及相关材料转移协议。以下实验方案通常可获得约 4 mg/L 的蛋白质产量。

1. 准备3 mL表达TreT的E. coli过夜培养物。
   1. 将转化了pBAD-TreT表达载体的Top10 E. coli在含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB（Luria-Bertani）琼脂平板上划线。
   2. 将平板在37 °C下培养约48小时。
   3. 从平板上挑取单个菌落，接种至含有100 µg/mL氨苄青霉素的3 mL LB液体培养基中，置于培养管内。
   4. 将培养管置于摇床培养箱中，在37 °C、175 rpm条件下振荡培养过夜。
2. 诱导表达TreT的E. coli中的蛋白表达。
   1. 向一个2,800 mL的Fernbach培养瓶中加入750 mL添加了100 μg/mL氨苄青霉素的优质肉汤（Terrific Broth....

结果

T. tenax TreT 通过标准的蛋白质表达与纯化技术从 E. coli 中获得，产率约为 4 mg/L。仅需一步镍亲和层析即可从 E. coli 裂解液中纯化 TreT（典型的 FPLC 色谱图见图4）。根据我们此前关于 TreT 合成过程的首次报道，重组的 T. tenax TreT 能够高效地将多种葡萄糖类似物（其中许多为商业化可得）转化为相应的海藻糖类似物¹⁹。表1列出了采用我们最初报道的实验方案时，多种起始葡萄糖类似物经 HPLC 测定的反应产率，展示了 TreT 对底物的广泛兼容性及其在合成应用中的适用性。野生型酶可耐受糖环不同位置上的多种结构修饰，包括氟代、脱氧、叠氮、硫代以及立体化学修饰，主要例外是 4 位的修饰。

讨论

海藻糖类似物在多个领域具有潜在应用价值，从食品和药品的保存到微生物感染的诊断与治疗⁶。现有的多步化学合成方法可用于制备在多个位点发生修饰的复杂海藻糖类似物（例如，天然存在的复杂分枝杆菌糖脂）。然而，即使用于合成相对简单的单取代海藻糖类似物，这些方法也 invariably 耗时较长且效率低下^{9, 13, 14}。因此，亟需开发替代性的合成策略，以快速、高效地制备各类在上述领域具有应用潜力的海藻糖类似物。利用自然界中海藻糖合成酶的生物催化方法最具前景。尽管自然界中存在多种海藻糖合成途径，但我们认为来自T. tenax¹⁸的TreT酶是用于海藻糖类似物合成的理想酶，原因如下。

T. tenax 来源的 TreT 具有热稳定.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LB 琼脂	Research Products International	L24021
氨苄青霉素钠盐	Sigma Aldrich	A9518
LB 肉汤	Research Products International	L24045
优质肉汤（Terrific Broth）	Research Products International	T15050
L-(+)-阿拉伯糖	Sigma Aldrich	A3256
磷酸盐缓冲液（PBS）	GE Healthcare	SH30256
咪唑	Sigma Aldrich	I5513
氯化钠	BDH	BDH9286
磷酸二氢钠	Fisher Scientific	S374
注射器滤器，0.45 µm	Fisher Scientific	09719D
蛋白酶抑制剂迷你片剂，不含 EDTA	Thermo Scientific	88666
HisTrap HP 镍亲和层析柱，5 mL	GE Healthcare	17-5248-02
TRIS 碱，超纯	Research Products International	T60040
透析袋，截留分子量 12–14,000	Fisher Scientific	21-152-16
葡萄糖类似物	CarboSynth, Sigma Aldrich, Santa Cruz Biotechnology, American Radiolabeled Chemicals		提供多种葡萄糖类似物的供应商示例
6-叠氮-6-脱氧葡萄糖（6-GlcAz）	CarboSynth	MA02620
UDP-葡萄糖	abcam Biochemicals	ab120384
六水合氯化镁	Fisher Scientific	M33
Amicon Ultra-15 离心过滤装置	EMD Millipore	UFC901008
Bio-Rex RG 501-X8 混合床离子交换树脂	Bio-Rad	444-9999
超细 Bio-Gel P2 层析介质	Bio-Rad	150-4118
玻璃背衬硅胶薄层层析板	EMD Millipore	1056280001
n-丁醇	Fisher Scientific	A399
乙醇	Fisher Scientific	S25310A
硫酸	Fisher Scientific	A300
乙腈	EMD Millipore	AX0145
氘代水，99.8%	Acros Organics	351430075
氨基丙基 HPLC 柱	Sigma Aldrich	58338
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	5470
对苯二甲醛	Ted Pella	18505
炔烃-488	Sigma Aldrich	761621
抗坏血酸钠	Sigma Aldrich	A7631
三[(1-苄基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基]胺（TBTA）	Click Chemistry Tools	1061
tert-丁醇	Sigma Aldrich	360538
二甲基亚砜	Sigma Aldrich	W387520
硫酸铜(II)	Sigma Aldrich	C1297
Fluoromount-G 封片剂	Southern Biotechnology	10001