Schnelle Ein-Schritt-enzymatische Synthese und All-wässrige Reinigung von Trehalose Analogen

Summary

Trehalose analogues are emerging as important molecules for bio(techno)logical and biomedical applications. We describe an optimized protocol for enzymatically synthesizing and purifying trehalose analogues that is simple, efficient, fast, and environmentally friendly. Its application to the rapid production and administration of a probe for the detection of mycobacteria is demonstrated.

Abstract

Chemisch-Versionen von Trehalose modifiziert oder Trehalose-Analoga, haben Anwendungen in der Biologie, Biotechnologie und der pharmazeutischen Wissenschaft, unter anderen Bereichen. Zum Beispiel haben Trehalose – Analoga Lager nachweisbar Tags verwendet worden Mycobacterium tuberculosis zu erkennen und können Anwendungen wie Tuberkulose diagnostische Bildgebungsmittel haben. Hydrolysestabile Versionen von Trehalose sind auch für die Verwendung als nicht-kalorische Süßstoffe und biologische Schutzmittel aufgrund ihres Potentials verfolgt. Trotz der Attraktivität dieser Klasse von Verbindungen für verschiedene Anwendungen, bleibt ihr Potenzial unerfüllt aufgrund des Fehlens eines robusten Weg zu ihrer Herstellung. Hier berichten wir ein detailliertes Protokoll für den schnellen und effizienten Ein-Schritt-biokatalytische Synthese von Trehalose-Analoga, die die Probleme im Zusammenhang mit der chemischen Synthese umgeht. Durch die Verwendung der thermo Trehalose – Synthase (Tret) Enzym aus Thermoproteus Tenax, Trehalose – Analoga können generat seined in einem einzigen Schritt aus Glucose-Analoga und Glucose Uridindiphosphat in hoher Ausbeute (bis zu Umsatz) in 15-60 min. Eine einfache und schnelle nicht-chromatographischen Reinigungsprotokoll, das von Spindialyse und Ionenaustausch besteht, können viele Trehalose Analoga bekannter Konzentration in wässriger Lösung in weniger als 45 min zu liefern. In Fällen, in denen nicht umgesetzten Glucoseanalog noch chromatographische Reinigung des Trehalose analogen Produkt verbleibt, kann durchgeführt werden. Insgesamt bietet dieses Verfahren eine "grüne" biokatalytische Plattform für die beschleunigte Synthese und Reinigung von Trehalose-Analoga, die auf nicht-Chemiker effizienter und leichter zugänglich ist. Um die Anwendbarkeit dieses Verfahrens veranschaulichen, beschreiben wir ein Protokoll für die Synthese, die alle wässrigen Reinigung und Verwaltung eines Trehalose-basierten Klick-Chemie-Sonde Mycobakterien, von denen alle dauerte weniger als 1 Stunde und ermöglicht Fluoreszenzdetektion von Mykobakterien. In Zukunft stellen wir uns, dass unter OTHer Anwendungen kann dieses Protokoll zur schnellen Synthese von Trehalose-basierte Sonden für Tuberkulose-Diagnostik eingesetzt werden. Zum Beispiel kurzlebigen Radionuklid-modifizierte Trehalose – Analoga (zB ¹⁸ F-modifizierte Trehalose) könnte für fortgeschrittene klinische Bildgebungsverfahren wie die Positronen – Emissions – Tomographie-Computertomographie (PET-CT) eingesetzt werden.

Introduction

Trehalose ist ein symmetrisches nicht reduzierenden Disaccharid , bestehend aus zwei Glucose – Einheiten, die von einem 1,1-α, α-glycosidische Bindung (1A) verbunden sind. Während Trehalose von Menschen und anderen Säugetieren nicht vorhanden ist, ist es häufig in Bakterien, Pilzen, Pflanzen und wirbellosen Tieren ¹ gefunden. Die primäre Rolle von Trehalose in den meisten Organismen ist gegen Umwelteinflüsse zu schützen, wie Austrocknungs ^1. Darüber hinaus erfordern einige menschliche Pathogene Trehalose für die Virulenz, einschließlich der Tuberkulose verursachende Mycobacterium tuberculosis, die für den Bau von immunmodulatorischen Glycolipide ² Trehalose als Mediator der Zellhülle Biosynthese und als Baustein verwendet.

Abbildung 1: Trehalose Trehalose und Analoga. (A) Strukturen der natürlichen Trehalose und eine unnatürliche Trehalose-Analogon, wobei X eine strukturelle Modifikation ist. (B) Beispiele für Trehalose – Analoga in der Literatur berichtet , dass mögliche Anwendungen in Biokonservierung und bioimaging haben.

Aufgrund seiner einzigartigen Struktur und physiologischen Funktionen hat Trehalose ³ große Aufmerksamkeit für den Einsatz in Bio (techno) logischer und biomedizinische Anwendungen gezogen. Die schützenden Eigenschaften von Trehalose beobachtet in natur- zB seine auffällige Fähigkeit in "Auferstehung" Pflanzen Leben erhalten zu helfen , die extreme Austrocknung ⁴ -Haben spornte seine umfangreichen Einsatz in Biokonservierung Anwendungen unterzogen wurden. Trehalose wurde ³ eine Vielzahl von biologischen Proben, wie Nukleinsäuren, Proteine, Zellen und Gewebe zu erhalten , verwendet. So wird beispielsweise Trehalose als Stabilisierungszusatz in einer Reihe von Arzneimitteln verwendet tHut auf dem Markt sind , darunter mehrere Anti-Krebs – monoklonalen Antikörpern ^3. Wie gut, Trehalose als Süßstoff in der Lebensmittelindustrie verwendet werden, und es ausgiebig für Produktschutz sowohl in der Lebensmittel- und Kosmetikindustrie verwendet wird. Die Annahme von Trehalose für diese Arten von kommerziellen Anwendungen wurde zunächst durch die Unfähigkeit beschränkt auf größere Mengen von reinem Trehalose, die aus natürlichen Quellen oder durch Synthese erhalten. Jedoch hat ein effizientes enzymatisches Verfahren zur wirtschaftlichen Herstellung von Trehalose aus Stärke vor kurzem entwickelt worden, die ihre weit verbreitete kommerzielle Nutzung angespornt hat ^5.

Chemisch Derivate von Trehalose modifiziert, die hierin als Trehalose Analoga bezeichnet werden , gewonnen haben zunehmende Aufmerksamkeit für verschiedene Anwendungen (generische Struktur gezeigt in 1A; spezifische Beispiele für Trehalose – Analoga in 1B gezeigt) ⁶. Beispielsweise Lacto-Trehalose ist ein Trehalose-Analogon mit einem seiner Glucose-Einheiten mit Galactose ersetzt, wodurch seine 4-Stellung eine Hydroxylgruppe hat eine invertierte stereochemische Konfiguration. Lacto-Trehalose hat die gleichen Eigenschaften wie Stabilisierungs Trehalose ist jedoch beständig gegenüber Abbau durch Verdauungsenzyme, wodurch es attraktiv als nicht-kalorischen Lebensmittelzusatzstoff ^{6, 7.}

Unsere Gruppe Interesse an Trehalose-Analoga bezieht sich in erster Linie auf ihren Wert als Mykobakterien-spezifischen Sonden und Inhibitoren. Die Barry und Davis Gruppen entwickelten ein Fluorescein-konjugiertes keto-Trehalose – Analogon, genannt FITC-keto-Trehalose, die metabolisch gezeigt wurde , die Zellwand von lebenden M. tuberculosis beschriften, so dass seine Detektion durch Fluoreszenzmikroskopie ^8. Das Bertozzi Labor entwickelte kleinere Azido-Trehalose (TreAz) Analoga, die metabolisch die Zellwand bezeichnen könnte und anschließend det seinektiert mit Klick – Chemie und Fluoreszenzanalyse ^9. Diese Fortschritte weisen auf die Möglichkeit der Verwendung von Trehalose-basierten Sonden als diagnostische Bildgebungsmittel für Tuberkulose. Trehalose – Analoga wurden auch als Inhibitoren von M. tuberculosis aufgrund ihres Potentials zu stören Wege in dem Bakterium verfolgt worden , die mit ¹⁰ für die Lebensfähigkeit und Virulenz wesentlich ^{sind, 11, 12.}

Bisher ist das Haupthindernis für Trehalose-Analoga bio (Techno) logisch und biomedizinische Anwendungen zu entwickeln, ist der Mangel an effizienten Synthesemethoden. Die beiden traditionellen Routen zu produzieren Trehalose – Analoga verlassen sich auf die chemische Synthese (Abbildung 2). Ein Weg beinhaltet Desymmetrisierung / Modifizierung von natürlichen Trehalose, während die andere beinhaltet mit geeignet funktionalisierten Monosaccharid-Bausteine ​​Starten und Durchführen der chemischen Glykosylierungschmieden, um die 1,1-α, α-Glykosid-Bindung. Diese Ansätze, die vor kurzem in Übersichtsartikeln diskutiert ^{13, 14,} haben sich als nützlich erwiesen , für die Erfüllung mehrstufige Synthese kleiner Mengen komplexer Trehalose haltige Naturprodukte, wie Sulfolipids-1 von M. tuberculosis ^15. Allerdings sind beide Ansätze im allgemeinen ineffizient, zeitaufwendig, unzugänglich nicht-Chemiker, und zusätzlich werden nicht als umweltfreundlich angesehen. So sind bestimmte Arten von Trehalose-Analoga zu synthetisieren, sind diese Strategien nicht ideal.

Abbildung 2: Ansätze zur Trehalose analoge Synthese. Chemische Ansätze zur Trehalose analoge Synthese, auf der linken Seite gezeigt, verwenden mehrstufige Verfahren, die schwer protec beinhaltention / Entschützen Desymmetrisierungen und / oder Glykosylierungsschritte. Die enzymatische Synthese, auf der rechten Seite gezeigt, verwendet Enzym (en) zu konvertieren stereoselektiv einfache, ungeschützte Substrate Analoga in wässriger Lösung zu Trehalose. Die enzymatische Protokoll berichtet hierin verwendet eine Trehalose-Synthase (t Ret) Enzym Glucose-Analoga und UDP-Glucose in Trehalose-Analoga in einem einzigen Schritt zu konvertieren. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Eine effiziente biokatalytische Route zu Trehalose-Analoga würde die Produktion, Auswertung und Anwendung dieser vielversprechenden Klasse von Molekülen ermöglichen. Während die kommerzielle enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Trehalose ⁵ bis Synthetisieren Analoga nicht anpassungsfähig ist , weil es Stärke als Substrat nutzt, gibt es andere biosynthetische WegWege in der Natur, die für Trehalose analoge Synthese ausgenutzt werden kann. Die Forschung in diesem Bereich, die vor kurzem ⁶ überprüft wurde, begrenzt. Ein Bericht über ein Verfahren , durch das coli Trehalose Biosyntheseweg Escherichia inspiriert eine einzige Fluor-Trehalose zuzugreifen analog aus den entsprechenden Fluor-Glucose. Allerdings erfordert dieser Ansatz ein Drei-Enzym – System , das die Effizienz und Allgemeinheit ⁸ begrenzt ist. Ein weiterer Ansatz, der untersucht worden ist , ist zu Trehalose – Phosphorylase (TREp) in der umgekehrten Richtung zu verwenden, die im Prinzip erlaubt die einstufige Synthese von Trehalose Analoga von Glucose – Analogen und Glucose-1-phosphat ^{6, 16, 17.} Obwohl dieser Ansatz künftig Versprechen haben kann, beide Invertierung und Halte TREP noch Nachteile für analoge Synthese. Zum Beispiel haben invertierende TREP einen prohibitiv expensive Donatormolekül (β-D-Glucose-1-Phosphat) und Halte TREP schlechte Enzym Expressionsausbeuten / Stabilität und begrenzte Substratpromiskuität. Signifikante Verbesserungen (zB über Enzym – Engineering) werden vor dem Trep-vermittelte analoge Synthese benötigt werden , ist praktisch.

Derzeit ist die praktischste Vorgehensweise für die enzymatische Synthese von Trehalose – Analoga ist eine Trehalose – Synthase (t Ret) Enzym zu verwenden, die Glucose umwandelt und Uridindiphosphat (UDP) -Glucose in Trehalose in einem einzigen Schritt ^6. Wir berichteten vor kurzem die Verwendung von Thermoproteus tenax Tret-und einer thermostabilen Enzyms unidirektionale ¹⁸ -bis Trehalose Analoga von Glucose – Analoga und UDP-Glukose (Abbildung 3) ¹⁹ synthetisieren. Dieses Enzym wirkt nur in der synthetischen Richtung und vermeidet das Problem von Trehalose Abbau im Trep System nicht gefunden. Dieses einstufige Reaktions could in 1 Stunde abgeschlossen werden, und eine Vielzahl von Trehalose – Analoga wurden in hoher Ausbeute zugänglich aus leicht verfügbaren Glucoseanalog Substrate (siehe Tabelle 1 in den Repräsentative Ergebnisse (bis wie durch Hochleistungs – Flüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt> 99%) Abschnitt).

Abbildung 3: t Ret-katalysierte Ein-Schritt – Synthese von Trehalose – Analoga. Der Tret – Enzym von T. tenax stereoselektiv beitreten leicht verfügbar Glukose – Analoga und UDP-Glucose Trehalose – Analoga in einem Schritt zu bilden. R ¹ -R ⁴ = Variable strukturelle Modifikation, beispielsweise Azido-, Fluoro-, Deoxy-, Thio- stereochemischen oder Isotopenmarkierung Modifikationen; Y = variable Heteroatom, beispielsweise Sauerstoff oder Schwefel, oder isotopenmarkierten Heteroatom.

Hier bieten wir adETAILLIERTE Protokoll für den Tret – Syntheseverfahren, einschließlich der Expression und Reinigung von t Ret von E. coli, optimierte Tret Reaktionsbedingungen und ein verbessertes Reinigungsverfahren , die vollständig in der wäßrigen Phase durchgeführt wird. Dieses modifizierte Protokoll ermöglicht die zweckmäßige und effiziente Synthese und Reinigung von Trehalose verschiedenen Analoga auf einer semi-präparativen Maßstab (10-100 mg). Wir zeigen auch die Verwendung dieses Protokolls für die Zubereitung und eine Trehalose-basierenden Sonde mit Mycobakterien in weniger als 1 Stunde verabreicht, die die schnelle Fluoreszenzdetektion von mykobakteriellen Zellen aktiviert.

Protocol

1. Expression und Reinigung von t Ret von E. coli Top10 HINWEIS: Bitte beachten Sie die Autoren Kontakt mit dem Tret-exprimierenden E. coli – Stamm zu verlangen (pBAD Tret – Plasmid, enthaltend das T. tenax tret – Gen unter der Kontrolle des AraC Protein, verwandelt in Top10 E. coli – 19) und die dazugehörige Materialübertragungsvereinbarung . Das folgende Protokoll gibt typischerweise eine Proteinausbeute von etwa 4 mg / L. Bereiten Sie ei…

Representative Results

T. tenax Tret wurde aus E. coli in einer Ausbeute von etwa 4 mg / L unter Verwendung von Standard – Proteinexpression und Reinigungstechniken erhalten. Eine einzelne Nickel – Affinitätschromatographie Schritt war ausreichend Tret aus E. coli – Lysat (a repräsentativen FPLC trace gezeigt in 4) zu reinigen. Wie in unserer ersten Veröffentlichung auf dem Syntheseverfahren Tret gegründet, ist rekombinantes T. tenax Tret der Lage , eine…

Discussion

Trehalose – Analoga haben das Potenzial , verschiedene Felder zu beeinflussen, von Konservierung von Lebensmitteln und Arzneimitteln zur Diagnose und Behandlung von mikrobiellen Infektionen ^6. Bestehenden vielstufige chemische Syntheseverfahren sind nützlich für komplexe Trehalose Analoga mit mehreren Standorten Modifikations Herstellung (beispielsweise natürlich vorkommende komplexe mykobakterielle Glykolipide). Jedoch sind diese Verfahren immer langwierig und ineffizient, auch wenn …

Materials

LB agar	Research Products International	L24021
Ampicillin sodium salt	Sigma Aldrich	A9518
Luria broth	Research Products International	L24045
Terrific Broth	Research Products International	T15050
L-(+)-Arabinose	Sigma Aldrich	A3256
Phosphate-buffered Saline	GE Healthcare	SH30256
Imidazole	Sigma Aldrich	I5513
Sodium chloride	BDH	BDH9286
Sodium phosphate,	Fisher Scientific	S374
monobasic
Syringe filter, 0.45 µm	Fisher Scientific	09719D
Protease Inhibitor mini-tablets, EDTA-free	Thermo Scientific	88666
HisTrap HP nickel affinity column, 5 mL	GE Healthcare	17-5248-02
TRIS base ultrapure	Research Products International	T60040
Dialysis tubing, MWCO 12–14,000	Fisher Scientific	21-152-16
Glucose analogues	CarboSynth,		Examples of vendors that offer numerous glucose analogues
	Sigma Aldrich,
	Santa Cruz Biotechnology, American Radiolabeled Chemicals
6-Azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz)	CarboSynth	MA02620
UDP-Glucose	abcam Biochemicals	ab120384
Magnesium chloride hexahydrate	Fisher Scientific	M33
Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit	EMD Millipore	UFC901008
Bio-Rex RG 501-X8 mixed-bed ion-exchange resin	Bio-Rad	444-9999
Extra-Fine Bio-Gel P2 media	Bio-Rad	150-4118
Glass-backed silica gel thin-layer chromatography plates	EMD Millipore	1056280001
n-Butanol	Fisher Scientific	A399
Ethanol	Fisher Scientific	S25310A
Sulfuric acid	Fisher Scientific	A300
Acetonitrile	EMD Millipore	AX0145
Deuterium oxide, 99.8%	Acros Organics	351430075
Aminopropyl HPLC column	Sigma Aldrich	58338
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	5470
Para-formaldehyde	Ted Pella	18505
Alkyne-488	Sigma Aldrich	761621
Sodium ascorbate	Sigma Aldrich	A7631
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)	Click Chemistry Tools	1061
tert-Butanol	Sigma Aldrich	360538
Dimethylsulfoxide	Sigma Aldrich	W387520
Copper(II) sulfate	Sigma Aldrich	C1297
Fluoromount-G mounting medium	Southern Biotechnology	10001