Rapid Ett-trinns Enzymatisk Syntese og All-vandig Rensing av Trehalose analoger

Summary

Trehalose analogues are emerging as important molecules for bio(techno)logical and biomedical applications. We describe an optimized protocol for enzymatically synthesizing and purifying trehalose analogues that is simple, efficient, fast, and environmentally friendly. Its application to the rapid production and administration of a probe for the detection of mycobacteria is demonstrated.

Abstract

Kjemisk modifisert versjon av trehalose, eller trehalose analoger, ha programmer i biologi, bioteknologi og farmasøytisk vitenskap, blant andre felt. For eksempel har trehalose analoger som detekterbare koder blitt anvendt for å detektere Mycobacterium tuberculosis og kan ha applikasjoner som tuberkulose diagnostiske avbildningsmidler. Hydrolytisk stabile versjoner av trehalose blir også forfulgt på grunn av sitt potensial for bruk som ikke-kalori søtstoffer og bio agenter. Til tross for den appell av denne klassen av forbindelser for forskjellige anvendelser, forblir deres potensial ikke oppfylt på grunn av mangel på en robust rute for deres produksjon. Her rapporterer vi et detaljert protokoll for rask og effektiv ett-trinns biokatalytisk syntese av trehalose analoger som omgår problemene knyttet til kjemisk syntese. Ved å benytte den termo trehalose syntase (tret) enzym fra Thermoproteus Tenax, kan trehalose analoger være generated i et enkelt trinn fra glukose analoger og uridindifosfat glukose i høyt utbytte (opp til kvantitativ omdannelse) i 15-60 min. En enkel og hurtig ikke-kromatografisk renseprotokoll, som består av spinndialyse og ionebytting, kan levere mange trehalose analoger av kjent konsentrasjon i vandig oppløsning i så lite som 45 minutter. I de tilfeller hvor ikke-omsatt glukoseanalogenen fremdeles kan kromatografisk rensing av trehalose analoge produkt utføres. Samlet sett gir denne metoden en "grønn" biokatalytisk plattform for rask syntese og rensing av trehalose analoger som er effektiv og tilgjengelig for ikke-kjemikere. For å eksemplifisere anvendelsen av denne metoden, beskriver vi en protokoll for syntese, all-vandig rensing og administrering av en trehalose-baserte klikk-kjemi sonde til mykobakterier, alle som tok mindre enn en time og aktivert fluorescens deteksjon av mykobakterier. I fremtiden vi ser for oss at blant otheh anvendelser kan denne protokoll anvendes for hurtig syntese av trehalose-baserte prober for tuberkulose diagnostikk. For eksempel, kortvarige radionuklide-modifisert trehalose analoger (f.eks ¹⁸ F-modifisert trehalose) kan brukes for avanserte kliniske bildediagnostikk som positronemisjonstomografi-computertomografi (PET-CT).

Introduction

Trehalose er en symmetrisk ikke-reduserende disakkarid som består av to glukosedelene som er forbundet med en 1,1-α, α-glykosidisk binding (figur 1A). Mens trehalose er fraværende fra mennesker og andre pattedyr, er det funnet vanligvis i bakterier, sopp, planter og virvelløse dyr ^1. Den primære rolle av trehalose i de fleste organismer, er å beskytte mot ytre påvirkninger, slik som uttørking ^1. I tillegg er noen humane patogener krever trehalose for virulens, inkludert tuberkulose-forårsaker Mycobacterium tuberculosis, som benytter trehalose som en formidler av celle konvolutt biosyntese og som en byggestein for bygging av immunmoduler glykolipider ^2.

Figur 1: Trehalose og trehalose analoger. (En) Strukturer av naturlig trehalose og en unaturlig trehalose-analog, hvor X er en strukturell modifikasjon. (B) Eksempler på trehalose analoger rapportert i litteraturen som har potensielle anvendelser i biopreservation og Bioimaging.

På grunn av sin unike struktur og fysiologiske funksjoner, har trehalose trukket betydelig oppmerksomhet for bruk i bio (techno) logisk og biomedisinske applikasjoner ^3. Den beskyttende egenskaper trehalose observert i natur- f.eks til sin slående evne hjelpe opprettholde livet i "oppstandelse" planter som har gjennomgått ekstrem dehydrering ⁴ -har ansporet sin omfattende bruk i biopreservation applikasjoner. Trehalose har blitt brukt for å bevare et bredt spekter av biologiske prøver, slik som nukleinsyrer, proteiner, celler og vev ^3. For eksempel er trehalose anvendt som et stabiliserende tilsetningsmiddel i en rekke farmasøytiske produkter thatten er på markedet, blant annet en rekke ^anti-kreft-3 monoklonale antistoffer. I tillegg er trehalose brukt som søtningsmiddel i næringsmiddelindustrien, og det er mye brukt for produktet bevaring i både mat og kosmetikk industri. Fastsettelsen av trehalose for disse typer kommersielle programmer var i utgangspunktet begrenset av manglende evne til å få bulk mengder ren trehalose fra naturlige kilder eller gjennom syntese. Imidlertid har en effektiv enzymatisk prosess for økonomisk produksjon av trehalose fra stivelse nylig blitt utviklet, noe som har påvirket sin utbredt kommersiell anvendelse ^5.

Kjemisk modifiserte derivater av trehalose, her betegnet som trehalose analoger, har fått økende oppmerksomhet for forskjellige anvendelser (generisk struktur er vist på figur 1A; spesielle eksempler på trehalose analoger er vist i figur 1B) ⁶. For eksempel, er lakto-trehalose en trehalose analog med en av sine glukoseenheter erstattet med galaktose, og dermed dens 4-stilling hydroksylgruppen har en invertert stereokjemiske konfigurasjon. Lakto-trehalose har samme stabiliserende egenskaper som trehalose, men er motstandsdyktig mot nedbrytning ved tarmenzymer, noe som gjør den attraktiv som en ikke-kalori tilsetningsstoff ^{6, 7.}

Vår gruppe interesse i trehalose analoger er hovedsakelig knyttet til deres verdi som mykobakterier spesifikke prober og hemmere. Barry og Davis grupper utviklet en fluorescens-konjugert keto-trehalose analog, oppkalt FITC-keto-trehalose, som ble vist til metabolsk merke celleveggen av levende M. tuberculosis, slik at dens deteksjon av fluorescens mikroskopi ^8. Den Bertozzi lab utviklet mindre azido-trehalose (TreAz) analoger som kunne metabolsk merke celleveggen og deretter være Fondetected bruker klikk kjemi og fluorescens analyse ^ni. Disse fremskrittene peker til muligheten for å bruke trehalose-baserte prober som diagnostiske avbildningsmidler for tuberkulose. Trehalose-analoger har også blitt ivaretatt som inhibitorer av M. tuberculosis på grunn av deres evne til å forstyrre baner i bakterien som er essensielle for levedyktigheten og virulens ^{10, 11, 12.}

Så langt det største hinderet for å utvikle trehalose analoger for bio (techno) logiske og biomedisinske applikasjoner er mangel på effektive syntesemetoder. De to tradisjonelle ruter til fremstilling av trehalose-analoger er avhengige av kjemisk syntese (figur 2). Én rute omfatter desymmetrization / modifisering av naturlig trehalose, mens den andre involverer starter med riktig funksjonaliserte monosakkarid byggesteiner og å utføre kjemiske glykosylering tilsmi 1,1-α, α-glykosidbinding. Disse fremgangsmåtene, som nylig er blitt diskutert i oversiktsartikler ^{13, 14,} har vist seg nyttig for å oppnå flertrinns syntese av små mengder av komplekse trehalose-inneholdende naturlige produkter, slik som sulfolipid-1 fra M. tuberculosis ^15. Men begge fremgangsmåter er vanligvis ineffektive, tidkrevende, utilgjengelig for ikke-kjemikere, og, i tillegg, ikke anses å være miljøvennlig. Således, for å syntetisere visse typer av trehalose analoger, disse strategiene er ikke ideelt.

Figur 2: Approaches to trehalose analog syntese. Kjemisk tilnærminger til trehalose analog syntese, vises til venstre, kan du bruke flertrinnsprosedyrer som involverer vanskelig protecsjon / avbeskyttelsestrinn, desymmetrization, og / eller glykosylering trinn. Enzymatisk syntese, som vises til høyre, bruker enzym (er) for å stereoselektivt konvertere enkle, ubeskyttet underlag til trehalose analoger i vandig løsning. Den enzymatiske protokollen angitt heri anvender en trehalose-syntase (tret) enzym for å omdanne glukose analoger og UDP-glukose til trehalose analoger i et enkelt trinn. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

En effektiv biokatalytisk rute til trehalose analoger ville lette produksjon, evaluering og anvendelse av denne lovende klasse av molekyler. Mens den kommersielle enzymatisk prosess for produksjon av trehalose ⁵ er ikke tilpasses for å syntetisere analoger fordi den utnytter stivelse som et substrat, er det andre biosyntetisk banemåter i naturen som kan utnyttes for trehalose analog syntese. Men forskning på dette området, som nylig ble anmeldt ^6, har vært begrenset. En rapport brukt en metode inspirert av Escherichia coli trehalose biosyntetiske vei for å få tilgang til en enkelt fluor-trehalose analogt fra de tilsvarende fluor-glukose. Imidlertid krever denne tilnærmingen en tre-enzymsystem som har begrenset effektivitet og generalitet ^8. En annen tilnærming som har vært utforsket, er å bruke trehalose fosforylase (Trep) i motsatt retning, som i prinsippet tillater en-trinns syntese av trehalose analoger fra glukose analoger og glukose-1-fosfat ^{6, 16, 17.} Selv om denne tilnærmingen kan ha fremtiden løfte, både inverterende og beholde TrePs har for tiden ulemper for analog syntese. For eksempel inverteringsmidler TrePs har en uoverkommelig erfansive donor molekyl (β-D-glukose-1-fosfat) og holde TrePs har dårlig enzym ekspresjonssystemer utbytter / stabilitet og begrenset substrat promiscuity. Betydelige forbedringer (f.eks, via enzym engineering) vil være nødvendig før Trep-mediert analog syntese er praktisk.

I dag er den mest praktiske tilnærmingen for den enzymatiske syntese av trehalose analoger for å bruke en trehalose-syntase (tret) som omdanner glukose og uridin-difosfat (UDP) -glukose i trehalose i et enkelt trinn ^6. Vi har nylig rapportert bruk av Thermoproteus Tenax tret-en termo og ensrettet enzym ¹⁸ -til syntetisere trehalose analoger fra glukose analoger og UDP-glukose (figur 3) ^19. Dette enzym virker kun i den syntetiske retning og unngår problemet med trehalose nedbrytning funnet i Trep systemet. Dette ett-trinns reaksjon could være avsluttet i en time, og et bredt spekter av trehalose analoger ble tilgjengelige i høyt utbytte (opp til> 99% som bestemt ved høy-ytelses væskekromatografi (HPLC)) fra lett tilgjengelige glukose analoge substrater (se Tabell 1 i det Representative Resultater seksjon).

Figur 3: tret-katalysert ett-trinns syntese av trehalose analoger. Den tret enzym fra T. tenax kan stereoselektivt bli lett tilgjengelig glukose analoger og UDP-glukose for å danne trehalose analoger i ett trinn. R ¹ -R ⁴ = Variable strukturell endring, for eksempel azido-, fluor-, deoxy-, tio, stereo, eller isotoper label modifikasjoner; Y = variabel heteroatom, for eksempel oksygen eller svovel, eller isotopisk merket heteroatom.

Her gir vi annonsenetailed protokoll for tret synteseprosessen, inkludert ekspresjon og rensing av tret fra E. coli, optimalisert tret reaksjonsbetingelser, og en forbedret rensemetode som utføres i sin helhet i den vandige fase. Denne modifiserte protokollen muliggjør hensiktsmessig og effektiv syntese og rensing av forskjellige trehalose analoger på en semi-preparativ skala (10-100 mg). Vi viser også bruk av denne protokollen for fremstilling og administrering av et trehalose-baserte sonde til mykobakterier i løpet av mindre enn 1 time, noe som muliggjorde hurtig fluorescens påvisning av mykobakterielle celler.

Protocol

1. Uttrykk og rensing av tret fra Top10 E. coli MERK: Ta kontakt med forfatterne til å be om tret-uttrykke E. coli-stamme (pBAD tret plasmid, som inneholder T. tenax tret genet under kontroll av AraC protein, forvandlet til Top10 E. coli-19) og tilhørende materiell overføringsavtalen . Følgende protokoll gir typisk et proteinutbytte på omtrent 4 mg / l. Forbered en 3 ml over natten kultur av tret-uttrykke E. coli. Strek…

Representative Results

T. Tenax tret ble oppnådd fra E. coli i et utbytte på omtrent 4 mg / l ved anvendelse av standard protein expression og renseteknikker. En enkelt nikkel affinitetskromatografitrinn var tilstrekkelig til å rense tret fra E. coli lysat (en representativ FPLC kontur er vist i figur 4). Som etablert i vår første publikasjon på tret synteseprosessen, er rekombinant T. tenax tret stand til å omdanne et bredt spekter av glukose-analoge…

Discussion

Trehalose analoger har potensial til å påvirke ulike felt, fra bevaring av mat og legemidler til diagnostisering og behandling av mikrobielle infeksjoner ^6. Eksisterende flertrinns kjemiske syntesemetoder er nyttige for fremstilling av komplekse trehalose-analoger med flere områder av modifikasjon (f.eks, naturlig forekommende komplekse mykobakterielle glykolipider). Men disse fremgangsmåter er alltid lang og ineffektiv, selv når den brukes til syntese av forholdsvis enkle monosubst…

Materials

LB agar	Research Products International	L24021
Ampicillin sodium salt	Sigma Aldrich	A9518
Luria broth	Research Products International	L24045
Terrific Broth	Research Products International	T15050
L-(+)-Arabinose	Sigma Aldrich	A3256
Phosphate-buffered Saline	GE Healthcare	SH30256
Imidazole	Sigma Aldrich	I5513
Sodium chloride	BDH	BDH9286
Sodium phosphate,	Fisher Scientific	S374
monobasic
Syringe filter, 0.45 µm	Fisher Scientific	09719D
Protease Inhibitor mini-tablets, EDTA-free	Thermo Scientific	88666
HisTrap HP nickel affinity column, 5 mL	GE Healthcare	17-5248-02
TRIS base ultrapure	Research Products International	T60040
Dialysis tubing, MWCO 12–14,000	Fisher Scientific	21-152-16
Glucose analogues	CarboSynth,		Examples of vendors that offer numerous glucose analogues
	Sigma Aldrich,
	Santa Cruz Biotechnology, American Radiolabeled Chemicals
6-Azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz)	CarboSynth	MA02620
UDP-Glucose	abcam Biochemicals	ab120384
Magnesium chloride hexahydrate	Fisher Scientific	M33
Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit	EMD Millipore	UFC901008
Bio-Rex RG 501-X8 mixed-bed ion-exchange resin	Bio-Rad	444-9999
Extra-Fine Bio-Gel P2 media	Bio-Rad	150-4118
Glass-backed silica gel thin-layer chromatography plates	EMD Millipore	1056280001
n-Butanol	Fisher Scientific	A399
Ethanol	Fisher Scientific	S25310A
Sulfuric acid	Fisher Scientific	A300
Acetonitrile	EMD Millipore	AX0145
Deuterium oxide, 99.8%	Acros Organics	351430075
Aminopropyl HPLC column	Sigma Aldrich	58338
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	5470
Para-formaldehyde	Ted Pella	18505
Alkyne-488	Sigma Aldrich	761621
Sodium ascorbate	Sigma Aldrich	A7631
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)	Click Chemistry Tools	1061
tert-Butanol	Sigma Aldrich	360538
Dimethylsulfoxide	Sigma Aldrich	W387520
Copper(II) sulfate	Sigma Aldrich	C1297
Fluoromount-G mounting medium	Southern Biotechnology	10001