Rápida em uma etapa enzimática Síntese e All-aquosa Purificação da trealose Análogos

Summary

Trehalose analogues are emerging as important molecules for bio(techno)logical and biomedical applications. We describe an optimized protocol for enzymatically synthesizing and purifying trehalose analogues that is simple, efficient, fast, and environmentally friendly. Its application to the rapid production and administration of a probe for the detection of mycobacteria is demonstrated.

Abstract

versões de trealose, ou análogos de trealose quimicamente modificados, têm aplicações em biologia, biotecnologia e ciência farmacêutica, entre outros campos. Por exemplo, análogos de trealose rolamento etiquetas detectáveis têm sido utilizados para detectar o Mycobacterium tuberculosis e pode ter aplicações como agentes de imagiologia de diagnóstico de tuberculose. versões hidroliticamente estáveis ​​de trealose também estão sendo perseguidos devido ao seu potencial para uso como adoçantes não calóricos e agentes bioprotetoras. Apesar do recurso desta classe de compostos para diversas aplicações, o seu potencial permanece insatisfeita devido à falta de uma rota robusta para a sua produção. Aqui, relatamos um protocolo detalhado para a síntese de um só passo biocatalítico rápida e eficiente de análogos de trealose que ultrapassa os problemas associados com a síntese química. Através da utilização da enzima termoestável trealose sintase (t Ret) de Thermoproteus tenax, análogos de trealose pode ser generatEd num único passo a partir de análogos de glucose e glucose uridina difosfato com um rendimento elevado (até à conversão quantitativa) em 15-60 min. Um protocolo de purificação de não-cromatográfico simples e rápida, que consiste de diálise e centrifugação de permuta iónica, pode proporcionar muitos análogos de trealose de concentração conhecida em solução aquosa em menos de 45 min. Nos casos em que não reagiu análogo de glucose ainda permanece, purificação cromatográf ica do produto análogo de trealose pode ser realizada. No geral, este método fornece uma plataforma biocatalítico "verde" para a síntese acelerada e purificação de análogos de trealose que seja eficiente e acessível a não-químicos. Para exemplificar a aplicação do presente método, é descrito um protocolo para a síntese, todos aquoso purificação, e administração de um clique sonda química à base de trealose a micobactérias, todas as quais demorou menos de uma hora e permitiu a detecção de fluorescência de micobactérias. No futuro, prevemos que, entre other aplicações, este protocolo pode ser aplicado para a rápida síntese de sondas à base de trealose para diagnóstico de tuberculose. Por exemplo, de curta duração análogos trealose modificado com radionuclídeos (por exemplo, ¹⁸ trealose F-modificada) poderiam ser usados para modalidades de imagens clínicas avançadas como a tomografia por emissão de positrões tomografia-computadorizada (PET-CT).

Introduction

A trealose é um dissacárido não redutor simétrico que consiste em duas metades de glicose que são unidas por uma 1,1-α, ligação α-glicosídica (Figura 1A). Enquanto trealose está ausente de seres humanos e outros mamíferos, ele é normalmente encontrada em bactérias, fungos, plantas e invertebrados ^1. O principal papel da trealose na maioria dos organismos é proteger contra stresses ambientais, tais como dessecação ^1. Além disso, alguns agentes patogénicos humanos exigir trealose para virulência, incluindo o Mycobacterium tuberculosis causadoras de tuberculose, a qual utiliza trealose como um mediador da biossíntese do envelope celular e como um bloco de construção para a construção de glicolípidos imunomoduladores ^2.

Figura 1: A trealose e análogos de trealose. (AEstruturas de trealose) natural e um análogo de trealose não natural, em que X é uma modificação estrutural. (B) Os exemplos de análogos de trealose relatados na literatura que têm aplicações potenciais em biopreservação e bioimaging.

Devido à sua estrutura única e as funções fisiológicas, trealose tem atraído uma atenção significativa para utilização em bio (tecno) lógica e aplicações biomédicas ^3. As propriedades de proteção de trealose observados na Natureza, por exemplo, a sua capacidade impressionante para ajudar a sustentar a vida em plantas "ressurreição" que foram submetidos a desidratação extrema ⁴ -ter estimulou sua ampla utilização em aplicações Bioconservação. A trealose foi utilizada para preservar uma grande variedade de amostras biológicas, tais como ácidos nucleicos, proteínas, células e tecidos ^3. Por exemplo, a trealose é utilizado como um aditivo estabilizante em um certo número de produtos farmacêuticos tchapéu estão no mercado, incluindo vários anticorpos monoclonais anti-câncer ^3. Assim, a trealose é utilizado como um adoçante na indústria alimentar e é amplamente utilizado para a conservação do produto em ambos os indústrias alimentar e cosmética. A adopção de trealose para estes tipos de aplicações comerciais foi inicialmente limitada pela incapacidade de obter grandes quantidades de trealose pura a partir de fontes naturais ou através de síntese. No entanto, um processo enzimático eficaz para a produção económica de trealose a partir de amido foi recentemente desenvolvido, que tem estimulado o seu uso comercial generalizado ^5.

Derivados de trealose, quimicamente modificada, aqui referidos como análogos de trealose, ganharam cada vez mais atenção para várias aplicações (estrutura genérica mostrada na Figura 1A; Exemplos específicos de análogos de trealose mostrados na Figura 1B) ⁶. Por exemplo, lacto-trealose é um análogo de trealose com uma das suas unidades de glucose substituída com galactose, assim, o seu grupo hidroxilo na posição 4 tem uma configuração estereoquímica invertida. Lacto-trealose tem as mesmas propriedades estabilizadores como trealose, mas é resistente à degradação por enzimas intestinais, tornando-o atractivo como um aditivo alimentar não calórico ^{6, 7.}

O interesse de nosso grupo no análogos trealose refere-se principalmente ao seu valor como sondas e inibidores específicos de micobactérias. Os grupos Barry e Davis desenvolvido um análogo ceto-trealose fluoresceína conjugado, com o nome de FITC-ceto-trealose, o que foi mostrado para metabolicamente rotular a parede celular de M. tuberculosis ao vivo, permitindo a sua detecção por microscopia de fluorescência ^8. O laboratório Bertozzi desenvolvido menor azido-trealose (TreAz) análogos que poderia metabolicamente rotular a parede celular e, subsequentemente, ser detected usando clique química e análise de fluorescência ^9. Estes avanços apontam para a possibilidade de utilização de sondas baseadas em trealose como agentes de imagiologia de diagnóstico para a tuberculose. Análogos trealose também têm sido perseguido como inibidores de M. tuberculosis devido ao seu potencial para perturbar percursos na bactéria que são essenciais para a viabilidade e virulência ^{de 10, 11, 12.}

Até agora, o principal obstáculo para o desenvolvimento de análogos de trealose para bio (tecno) aplicações lógicas e biomédicas é a falta de métodos sintéticos eficientes. As duas rotas tradicionais para a produção de análogos de trealose dependem de síntese química (Figura 2). Uma via envolve desymmetrization / alteração de trealose natural, enquanto a outra envolve começando com blocos de construção de monossacárido apropriadamente funcionalizadas e realizando a glicosilação químicaforjar a, ligação α-glicosídica 1,1-α. Estas abordagens, que foram recentemente discutidas em artigos de revisão ^{13, 14,} provaram ser úteis para realizar a síntese de várias etapas de pequenas quantidades de produtos naturais contendo trealose complexos, tais como sulfolipido-1 a partir de M. tuberculosis ^15. No entanto, ambas as abordagens são geralmente ineficientes, demorado, inacessível aos não-químicos, e, além disso, não são considerados como sendo amigos do ambiente. Assim, para a síntese de certos tipos de análogos de trealose, estas estratégias não são ideais.

Figura 2: Abordagens para a síntese de trealose analógico. Chemical abordagens para a síntese de trealose analógico, mostrada à esquerda, utilize os procedimentos de várias etapas que envolvem difícil protecpassos ção / desprotecção, desymmetrization, e / ou glicosilação. Síntese enzimática, mostrado no lado direito, utiliza enzima (s) para converter substratos estereosselectivamente simples, não protegida para trealose análogos em solução aquosa. O protocolo enzimática aqui relatada utiliza um enzima sintase de trealose (t Ret) para converter os análogos de glucose e UDP-glicose em análogos de trealose num único passo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Uma rota biocatalítico eficiente de análogos de trealose facilitaria a produção, avaliação e aplicação desta classe promissora de moléculas. Embora o processo enzimático comercial para a produção de trealose ⁵ não é adaptável para a síntese de análogos, porque utiliza o amido como um substrato, há outro caminho biossintéticoformas de arte na natureza que podem ser exploradas para a síntese analógica trealose. No entanto, a investigação nesta área, que foi recentemente revisto ^6, tem sido limitada. Um relatório usou um método inspirado na via biossintética trealose Escherichia coli para acessar um único analógico fluoro-trealose do flúor-glucose correspondente. No entanto, esta abordagem requer um sistema de três-enzima que tenha a eficiência e a generalidade ⁸ limitado. Outra abordagem que tem sido explorada é a utilização de trealose-fosforilase (TREP) no sentido inverso, o que, em princípio, permite a síntese de uma etapa de análogos de trealose a partir de análogos de glucose e ^{glucose-1-fosfato-6, 16, 17.} Embora esta abordagem pode ter promessa de futuro, ambos os inversores e reter TrePs atualmente têm desvantagens para a síntese analógica. Por exemplo, TrePs invertendo ter uma expe proibitivamentensive molécula de dador (β-D-glucose-1-fosfato) e TrePs de retenção têm rendimentos de expressão de enzima pobre / estabilidade e promiscuidade substrato limitada. Melhorias significativas (por exemplo, através de engenharia enzimática) serão necessários antes da síntese analógica TREP-mediada é prático.

Actualmente, a abordagem mais prática para a síntese enzimática de análogos de trealose é a utilização de uma enzima sintetase de trealose (t Ret), que converte a glicose e difosfato de uridina (UDP) -glucose em trealose num único passo ^6. Recentemente, relatou a utilização de Thermoproteus tenax-Tret uma enzima termoestável e unidireccional ¹⁸ -para sintetizar análogos de trealose a partir de análogos de glucose e UDP-glucose (Figura 3) ^19. Esta enzima funciona apenas no sentido sintético e evita o problema de degradação de trealose foi encontrado no sistema TREP. Este coul reacção de um passod ser completada em 1 hora, e uma ampla variedade de análogos de trealose foram acedidos com um rendimento elevado (até> 99% tal como determinado por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)) a partir de substratos análogo da glicose prontamente disponíveis (ver Tabela 1 nos resultados representativos seção).

Figura 3: síntese de um só passo Tret-catalisada de análogos de trealose. A enzima Tret de T. tenax estereosselectivamente pode juntar-se análogos de glicose prontamente disponíveis e UDP-glicose para formar análogos de trealose em um passo. R ¹ -R ⁴ = modificação estrutural variável, por exemplo azido, fluoro, desoxi-, tio-, estereoquímica, ou modificações marcador isotópico; Y = heteroátomo variável, por exemplo oxigénio ou enxofre, ou heteroátomo marcado isotopicamente.

Aqui, nós fornecemos adProtocolo PORMENORIZADA para o processo de síntese Tret, incluindo a expressão e purificação de Tret partir de E. coli, as condições de reacção optimizado Tret, e um método de purificação melhorado, que é levada a cabo inteiramente na fase aquosa. Este protocolo modificado permite a síntese conveniente e eficiente e purificação de diversos análogos de trealose à escala semi-preparativa (10-100 mg). Nós também demonstrar o uso deste protocolo para preparar e administrar uma sonda à base de trealose a micobactérias em menos de 1 hora, o que permitiu a detecção de fluorescência rápida de células de micobactérias.

Protocol

1. Expressão e purificação de t Ret de Top10 de E. coli NOTA: Entre em contato com os autores para solicitar a estirpe de E. coli Tret expressando (plasmídeo pBAD Tret, contendo o gene tret T. tenax sob o controle da proteína AraC, transformado em Top10 de E. coli 19) eo acordo de transferência de material acompanhante . O protocolo seguinte tipicamente dá um rendimento de proteína de aproximadamente 4 mg / L. Prepara-se uma cultura d…

Representative Results

T. tenax Tret foi obtido a partir de E. coli com um rendimento de aproximadamente 4 mg / L, utilizando técnicas de expressão e purificação de proteínas padrão. Uma etapa de cromatografia de afinidade de níquel único foi suficiente para purificar Tret a partir de lisados de E. coli (um vestígio de FPLC representativo é mostrado na Figura 4). Tal como estabelecido na nossa publicação inicial no processo de síntese Tret, recombinante …

Discussion

Análogos trealose têm o potencial de afetar várias áreas, desde a preservação de alimentos e medicamentos para diagnóstico e tratamento de infecções microbianas ^6. Existentes métodos de síntese química de várias etapas são úteis para a produção de análogos de trealose complexos com vários locais de modificação (por exemplo, glicolípidos de ocorrência natural micobacterianas complexos). No entanto, estes métodos são invariavelmente demorado e ineficiente, mesmo qu…

Materials

LB agar	Research Products International	L24021
Ampicillin sodium salt	Sigma Aldrich	A9518
Luria broth	Research Products International	L24045
Terrific Broth	Research Products International	T15050
L-(+)-Arabinose	Sigma Aldrich	A3256
Phosphate-buffered Saline	GE Healthcare	SH30256
Imidazole	Sigma Aldrich	I5513
Sodium chloride	BDH	BDH9286
Sodium phosphate,	Fisher Scientific	S374
monobasic
Syringe filter, 0.45 µm	Fisher Scientific	09719D
Protease Inhibitor mini-tablets, EDTA-free	Thermo Scientific	88666
HisTrap HP nickel affinity column, 5 mL	GE Healthcare	17-5248-02
TRIS base ultrapure	Research Products International	T60040
Dialysis tubing, MWCO 12–14,000	Fisher Scientific	21-152-16
Glucose analogues	CarboSynth,		Examples of vendors that offer numerous glucose analogues
	Sigma Aldrich,
	Santa Cruz Biotechnology, American Radiolabeled Chemicals
6-Azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz)	CarboSynth	MA02620
UDP-Glucose	abcam Biochemicals	ab120384
Magnesium chloride hexahydrate	Fisher Scientific	M33
Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit	EMD Millipore	UFC901008
Bio-Rex RG 501-X8 mixed-bed ion-exchange resin	Bio-Rad	444-9999
Extra-Fine Bio-Gel P2 media	Bio-Rad	150-4118
Glass-backed silica gel thin-layer chromatography plates	EMD Millipore	1056280001
n-Butanol	Fisher Scientific	A399
Ethanol	Fisher Scientific	S25310A
Sulfuric acid	Fisher Scientific	A300
Acetonitrile	EMD Millipore	AX0145
Deuterium oxide, 99.8%	Acros Organics	351430075
Aminopropyl HPLC column	Sigma Aldrich	58338
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	5470
Para-formaldehyde	Ted Pella	18505
Alkyne-488	Sigma Aldrich	761621
Sodium ascorbate	Sigma Aldrich	A7631
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)	Click Chemistry Tools	1061
tert-Butanol	Sigma Aldrich	360538
Dimethylsulfoxide	Sigma Aldrich	W387520
Copper(II) sulfate	Sigma Aldrich	C1297
Fluoromount-G mounting medium	Southern Biotechnology	10001