Introduction
Una limitación de los actuales tratamientos para el VIH-1 es que deben ser administrados crónicamente para prevenir la progresión de la enfermedad. Trasplante de VIH-1 resistentes a los linfocitos T, o células madre hematopoyéticas, tiene el potencial de proporcionar el control a largo plazo del VIH-1 de replicación en ausencia de la terapia con medicamentos 1,2 y también puede ser un enfoque eficaz para alcanzar una cura de VIH-1 3. Una forma de hacer que las células resistentes al VIH-1 de replicación es insertar uno o más genes que codifican anti-VIH-1 ARN o péptidos en células de un individuo infectado durante un trasplante autólogo 4. Varios genes candidatos anti-VIH-1 han sido diseñados con algunos ensayos clínicos que entran en combinaciones de dos o tres 5 6, para prevenir el desarrollo de resistencia del VIH-1 a un solo gen.
Anti-VIH-1 ARN se encuentran entre los mejores candidatos para la terapia génica de combinación debido a su bajo potencial para provocar respuestas inmunes y porquese transcriben a partir de secuencias de genes muy cortos. Algunos ARN anti-VIH-1 se han diseñado para actuar sobre la entrada y la integración viral. Sin embargo, la mayoría de los anti-VIH-1 ARN diana pasos posteriores a la integración en el ciclo de vida viral (Figura 1). Inhibidores de la post-integración incluyen ARN señuelo, apuntando a los VIH-1 proteínas reguladoras Tat o Rev 1, y ARN antisentido basados en, dirigidos a diferentes sitios en el VIH-1 ARN, como las ribozimas 7, 8 y shRNAs U1i ARNs 9. Los métodos que se han utilizado para comparar la eficacia de los anti VIH-1 ARN incluyen la supervisión de la replicación viral en las células transducidas con genes que codifican para los ARN candidatos y medición de la producción viral en células transfectadas transitoriamente con plásmidos que expresan ARN candidatos y un plásmido de expresión del VIH-1 10 -13. Hemos utilizado anteriormente un ensayo de producción de VIH-1 para detectar el VIH-1 RNA para el nuevo ribozima sitios diana 13-15. Estos métodos ya se han refinado para optimizar el formato de un ARNmolécula de interferencia expresa a partir de ADN plásmido como un shRNA o entregada como un ARNsi sintético 16. El ensayo mide la producción de virus maduros a partir de células 293T de riñón embrionario (HEK) humanos, y se puede utilizar para comparar los efectos de los inhibidores que se dirigen a pasos posteriores a la integración en el ciclo de replicación del VIH-1 (Figura 1). Para inhibidores que se dirigen a los pasos de pre-integración, se necesitan ensayos alternativos, tales como un ensayo de infectividad celular TZM-bl 17 para evaluar la eficacia antiviral.
Las principales preocupaciones de seguridad para la entrega de los anti-VIH-1 ARN en la clínica incluyen los posibles efectos fuera de la meta de ARN o proteínas humanas, y la activación de sensores inmune innata. Para evaluar la toxicidad de anti-HIV-1 siRNAs, hemos utilizado un ensayo de viabilidad celular en diferentes líneas celulares 16. También se midió la activación de los sensores inmunes de ARN bicatenario, ARN proteína quinasa activada por R (PKR) y Toll like receptor 3 (TLR3), así como exsión del gen de interferón estimulado, p150 ADAR1. Estos ensayos se pueden usar para confirmar que la eficacia de anti-HIV-1 ARN no se debe a efectos indirectos sobre la viabilidad celular o la activación inmune sensor. También son útiles en la exclusión de los ARN candidatos con los potenciales efectos tóxicos de un mayor desarrollo.
En los siguientes protocolos, procedimientos para identificar nuevos ARN terapéuticas y optimizar el formato de los existentes se describen. Los métodos son útiles para los inhibidores de la post-integración basadas ARN de detección de VIH-1 de replicación y pueden ser adaptados a la pantalla de otros inhibidores de la post-integración, tales como pequeñas moléculas de direccionamiento Rev exportación mediada por ARN viral 18 o CRISPR / sistemas de Cas diseñados para dirigir integrada VIH-1 DNA 19.
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Protocol
1. Las células y transfecciones
- Cultura células HEK 293T en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina. Preparar una suspensión 2 x 10 5 células / ml en el medio de cultivo celular. Añadir 500, 100 y 1.000 l de la suspensión celular a cada pocillo de 24 pocillos, placas de 96 pocillos y 12 pocillos, para la producción viral, la viabilidad celular y ensayos de activación inmune, respectivamente (Figura 2A).
- Hacer girar suavemente las placas y se incuban O / N a 37 ° C con 5% de CO2. Se cultivan las células a 50-70% de confluencia.
- De acuerdo con un plan de la transfección, se preparan diluciones de ARN de prueba y sus controles en tubos de 1,5 ml (micro ejemplo, la Figura 2B).
- Para el ensayo de la producción viral, preparar una 10 ng / l de dilución de un plásmido de expresión del VIH-1 y añadir 10 l a cada tubo. Siguiente preparar 5 M diluciones de ARN de ensayo y un control negativo RNA. Añadir 2,5 o 10 l de cada dilución de ARN de ensayo y de control negativo a los tubos correspondientes para 25 ó 100 nM concentraciones finales.
- Para el ensayo de viabilidad celular, preparar 5 M diluciones de ARN de prueba y un 10 mg / ml de dilución de la RNA control positivo, de bajo peso molecular de poli I: C. Añadir 2 l de ARN de ensayo o diluciones de ARN de control positivo a los tubos correspondientes para 100 nM o concentraciones finales ml 200 g /, respectivamente.
- Para el ensayo de la activación inmune, añadir 20 l de RNA de ensayo o las diluciones de ARN de control positivo preparados en la etapa 1.3.2. a los tubos correspondientes para 100 nM o 200 mg / ml concentración final, respectivamente.
Nota: Para las pruebas de ARN plásmidos de expresión, preparar 10 ng diluciones / l en lugar de las 5 micras diluciones de ARN de ensayo, dando cantidades finales de 25 y 100 ng para el paso 1.3.1. y 100 ng para los pasos 1.3.2. y 1.3.3.
- Añadir 50, 25 o 75 l de DMEM a cada tubo para la transfección viral producción, la viabilidad celular y ensayos de activación inmune, respectivamente. Para los ensayos de producción viral, llevar las células y los tubos de transfección preparados a un nivel 3 de laboratorio bio-seguridad (BSL3) antes del siguiente paso.
- Añadir 2 l de la secuencialmente reactivo de transfección a los tubos de transfección y se incuba de 15 a 20 min para permitir que los complejos a la forma. Ver la Tabla de materiales para el reactivo de transfección específico a utilizar.
- Añadir toda la mezcla de transfección de cada tubo micro gota a gota a las posiciones correspondientes en las placas de cultivo celular. Hacer girar suavemente y se incuban las placas durante 48 horas a 37 ° C con 5% de CO2.
- Medir el VIH-1 de producción (sección 2), la viabilidad celular (sección 3) y la activación inmune (sección 4) en las placas de cultivo celular (Figura 2C).
2. Ensayo de la producción viral
- Eliminar las placas de cultivo celular de 24 pocillos de la incubadora y agitar suavemente las placas en el interior del cultivo celular BSL3capucha. Transferir 150 l de sobrenadante de cada pocillo a un pocillo correspondiente en una placa de 96 pocillos de fondo plano, que se utiliza para cuantificar la producción de VIH-1.
Nota: ensayos de cuantificación virales comunes incluyen la medición de la expresión de la proteína de la cápside del VIH-1 (p24) por ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) 20, la cuantificación de ARN viral mediante transcripción inversa reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) 21 y la medición de la actividad de la enzima de VIH-1 RT. Los pasos 2.2 a 2.5 explicar los métodos para cuantificar VIH-1 RT actividad 13,15,16. - Transferencia de 5 l de sobrenadante a los pocillos correspondientes en una placa de 96 pocillos, que contiene 25 l de un cóctel viral interrupción 15 (Tabla 1). Incubar la mezcla durante 5 min a TA y la transferencia de la placa a una estación de trabajo radiactividad.
Nota: El paso 2.2. sólo es necesario si una estación de trabajo radiactividad no está disponible en el laboratorio NBS3. Si las placas no tienen que ser retirados de laNBS3 laboratorio, continúe en el paso 2.3. y añadir 50 l de cóctel de interrupción radiactivo / viral (Tabla 1) en lugar de los 25 l de cóctel radiactivo. - Preparar un cóctel radiactiva 15 (Tabla 1), y añadir 25 l a cada pocillo de sobrenadante viral y cóctel de interrupción. Incubar las placas a 37 ° C durante 2 horas.
- Punto 5 l de la mezcla de reacción en las casillas correspondientes en una fibra de vidrio Di Etil amino etil (DEAE) Filtermat de papel y permitir que las gotas se sequen durante 10 min. Detectar la mezcla de reacción en cada otra cuadrado, de manera que no hay dos muestras Boarder directamente entre sí. Esto ayuda a evitar el cruce entre las muestras para determinar las cuentas por minuto (cpm) en el paso 2.6.
- Lavar los papeles 5X para 5 min con tampón 2x citrato de sodio salino (SSC) (Tabla 1), seguido de dos lavados de 1 min con 95% de etanol. Permitir que los papeles se sequen y sellan en bolsas de muestra.
- Clip bolsas de muestras containing el papel Filtermat en un casete e inserte el cassette en un contador de centelleo de microplacas. Poner el contador a leer cpm de 32P con la fecha de referencia que establece el lote de [32P] dTTP utilizado en el experimento. Seleccione el que las muestras de leer Cómo utilizar el mapa plato y activar el contador.
- Para cualquier método de cuantificación viral, dividir los valores obtenidos para cada ARN de ensayo por el control negativo adyacente y multiplicar este valor por 100 para obtener el porcentaje de inhibición de producción de VIH-1 para cada réplica de los ARN de prueba. Un ejemplo de los resultados que comparan diferentes ARN de ensayo a diferentes concentraciones se proporciona en la Figura 3.
3. ensayo de viabilidad de la célula
- Retire las placas de 96 pocillos de la incubadora y se añaden 20 l de 5 mg / ml de MTT (3- [4,5-dimetil-2-tiazolil] -2,5-difenil-2H-tetrazolio) diluido en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco ( DPBS) a cada pocillo. Se incuban las placas fo 3 horas a 37 ° C.
- Añadir 150 ml de isopropanol acidificado con detergente (1% NP-40, HCl 4 mM en isopropanol) a cada pocillo e incubar las placas durante 2 horas a RT.
- Determinar la absorbancia a 570 nm en un espectrofotómetro de microplacas.
- Calcular el metabolismo de MTT relativa para cada ARN de control positivo de la prueba y dividiendo el valor obtenido para cada muestra por su control de transfección adyacente. Un ejemplo de los resultados que comparan diferentes ARN de ensayo y un control positivo se proporciona en la Figura 4.
4. Ensayo de Activación Inmune
- Retire las placas de 12 pocillos de la incubadora y aspirar el medio de cultivo. Lavar suavemente las células dos veces con DPBS y añadir 70 l de tampón de lisis frío 22 (incluyendo inhibidores de la proteasa y de fosfatasa, la Tabla 1) a cada pocillo. Se incuban las placas durante 10 minutos en hielo.
- Transferir lisados celulares para microtubos y rápido congelarlos por inmersión de latubos en nitrógeno líquido. Dejar que las muestras se descongelen y se repiten durante 2 ciclos de congelación y descongelación más para un total de 3.
- Centrifugar los lisados durante 15 min a 4 ° C, 15.700 xg, para sedimentar los residuos celulares. Transferir el sobrenadante a tubos nuevos micro y determinar la concentración de proteína usando el método de azul de Coomassie (Bradford) 23,24.
- Resolver 75 g de proteína de cada muestra en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 10% y la transferencia a una membrana de nitrocelulosa como se ha descrito previamente 25,26.
- Después de la electroforesis y la transferencia a una membrana, revelar bandas de proteínas mediante la incubación de la membrana en Ponceau S (Tabla 1) durante 1 min seguido de lavado en agua doblemente destilada. Usar las bandas y la escalera de proteína como una guía para cortar la membrana en 80 y 55 kDa.
Nota: En el paso 4.4 muestras se pueden ejecutar en 16 x 18 cm 2 geles abajo a 34 kDa, de manera que es fácil de cortar la membrana en las posiciones especificadas y no cortar a través de labandas de interés. Por otra parte, varios geles se pueden ejecutar con las mismas muestras para evitar el corte de la membrana. - Lavar la tinción Ponceau S con solución salina tamponada con Tris que contenía 0,05% de Tween 20 (TBST, Tabla 1). Añadir TBST con leche no grasa al 5% para cubrir completamente las membranas. Se incuban las membranas a temperatura ambiente con agitación durante 1 hr.
- Se incuban las membranas de O / N en TBST con 3% de albúmina de suero bovino (BSA) y los anticuerpos se diluyó a 1 en 1000 contra ADAR1 (110 y 150 kDa), fosfo-PKR (62 kDa), y fosfo-IRF3 (47 kDa), para las piezas superior, media e inferior de la membrana, respectivamente.
- Lavar las membranas 5X para 5 min con TBST y se incuban en TBST con leche 5% sin grasa y de cabra anti-conejo anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa (diluido a 1 en 5000) durante 1 hora.
- Lavar las membranas 5x durante 5 min con TBST y aplicar la solución de electroquimioluminiscencia (ECL) para visualizar las bandas en las películas según las instrucciones del fabricante.
- Después de visualizar las bandas de proteína en las películas, lavar las piezas intermedias de la membrana durante 10 min con una solución de anticuerpo de extracción. Se incuban las membranas O / N en TBST con BSA al 3% y anticuerpos contra PKR total de (a 1 en 500) y IRF3 (a 1 de cada 1.000), por el medio y piezas inferiores, respectivamente. Repita los pasos 4.8. y 4.9. utilizando marcado con peroxidasa de cabra anti-ratón en lugar del anticuerpo secundario anti-conejo para la membrana de PKR (medio).
- Lavar la pieza inferior de la membrana 5x durante 5 min con TBST y se incuba la membrana en TBST con BSA al 3% durante 1 hora con un anticuerpo contra actina (diluido a 1 en 5000). Repita los pasos 4.8. y 4.9. utilizando marcado con peroxidasa de cabra anti-ratón en lugar del anticuerpo secundario anti-conejo. Un ejemplo de los resultados que comparan diferentes ARN de ensayo y un control positivo se proporciona en la Figura 5. Ver la Tabla de materiales para los anticuerpos específicos para ser utilizados.
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Representative Results
Un esquema general de los procedimientos se muestra en la Figura 2 con un plan de transfección ejemplo para tres ARN de prueba y un ARN de control proporcionada en la Figura 2B. Para los ensayos de producción y la viabilidad celular virales, La lectura para cada construcción de prueba es normalizada a un control negativo. Las réplicas se transfectan en conjuntos, de modo que cada ARN de ensayo se normalizó a su control negativo adyacente. Esto se hace para evitar que los datos inexactos relacionados con el tiempo entre complejante y transfección, que puede resultar si, por ejemplo, todos los controles negativos se transfectan primero. Dado que el VIH-1 puede afectar a la respuesta inmune 27,28, la viabilidad celular y ensayos de activación inmune se realizan sin la adición de un plásmido que expresa el VIH-1.
Para identificar la longitud óptima de las moléculas de ARN de interferencia dirigida a un sitio conservado en ARN VIH-1 (posición 1498-141519 en el VIH-1 cepa NL4-3) 13, un conjunto de siRNAs fueron diseñados (Figura 3A). Usando el ensayo de la producción de VIH-1, el porcentaje de la actividad RT en comparación con las células transfectadas con un largo Dicer siRNA sustrato sin sentido (Sins) se calculó para las células transfectadas con cada siRNA de ensayo a diferentes cantidades de co-transfección con 100 ng de un plásmido que expresa VIH-1 NL4-3 cepa (Figura 3B).
Usando el ensayo de viabilidad celular, se determinó el metabolismo por ciento de MTT para células transfectadas con los siRNAs más eficaces identificadas en la Figura 3B. Los datos se normalizaron con el metabolismo del MTT en células tratadas con el reactivo de transfección solo (Figura 4). Un RNA de doble cadena larga (Poly I: C) redujo la viabilidad celular; Sin embargo, sólo fue un efecto significativo en la dosis más alta evaluada. No se observó ninguna reducción significativa en la viabilidad celular por siRNAs dirigidos a la SI 1498 te en el VIH-1 ARN, independientemente de su longitud. Usando el ensayo de la activación inmune, se evaluó el mismo conjunto de ARN por su potencial para desencadenar la respuesta inmune (Figura 5). En condiciones en Poly I: C activa la expresión de p150 ADAR1 y la fosforilación inducida de PKR y IRF3, no tiene efecto significativo sobre los marcadores de activación inmune se observó para cualquiera de los ARN de prueba.
Figura 1. Esquema de las fases previas y posteriores a la integración en el ciclo de replicación del VIH-1. Pre-integración (1-3) y después de la integración (4-7) pasos en el ciclo de replicación del VIH-1 se muestran en las cajas señaladas . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 2. Esquema de la producción viral, la viabilidad celular y ensayos de activación del sistema inmune. Células adherentes (A) de la placa y la cultura durante 24 horas. Las células se sembraron en 24, 96 y 12- placas de pocillos en 500, 100 y 1.000 l de medio de cultivo celular para la producción viral, la viabilidad celular y ensayos de activación inmune, respectivamente. (B) Preparar tubos de transfección, las células transfectar, y la cultura durante 48 horas. Un ejemplo de plan de transfección de un conjunto de tres ARNs de ensayo (RNA1-3) se muestra con controles apropiados. También se ilustra el procedimiento de transfección. (C) de lectura. La lectura para la producción viral, la viabilidad celular y ensayos de activación inmune se escriben y se explica en detalle en las secciones 2, 3 y 4, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. </ P>
Figura 3. Efecto de siRNAs de ensayo sobre la producción de VIH-1. (A) El diseño de siRNAs con diferentes longitudes y simetrías. Una secuencia conservada en el VIH-1 RNA (1498 sitio de destino) se utilizó para diseñar siRNAs simétricas y asimétricas (si1498-) con diferentes longitudes (17 a 29 hebras de nucleótidos con sentido). El sentido esperado (arriba, negro) y antisentido (abajo, de color rojo) capítulos se indican. (B) La inhibición de la producción de VIH-1 por variantes de longitud si1498. El porcentaje de inhibición (%) del VIH-1 actividad de RT en el sobrenadante de las células HEK293T transfectadas con variantes de longitud si1498 simétricas o asimétricas se muestra en relación con un largo sin sentido sustrato Dicer siRNA (pecados). Cada ARN de ensayo se comparó con Sins a diferentes dosis en al menos dos transfecciones independientes con dos a tres repeticiones. Los datos son exprcomputan como valores medios ± error estándar medio (SEM). Esta cifra se ha modificado desde el 16, el derecho de autor Sociedad Americana de Microbiología. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Efecto de la longitud si1498 variantes sobre la viabilidad celular células HEK293T fueron transfectadas con poli I:. C a 50 y 200 g / ml (pCI50 y PIC200) y diferentes longitudes y formatos de si1498 a 100 nM. El metabolismo% de MTT se determinó en relación con las células tratadas con el reactivo de transfección solo (Mock, M) en tres transfecciones independientes con dos o tres repeticiones. Los datos se expresan como valores medios ± SEM. Se utilizaron Student pruebas t para determinar si la diferencia de transfecciones significantly (*, p <0,05) redujo la viabilidad celular en relación con las células transfectadas de forma simulada. Esta cifra se ha modificado desde el 16, el derecho de autor Sociedad Americana de Microbiología. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Efecto de la longitud si1498 variantes en las respuestas inmunes innata. Células HEK293T fueron transfectadas con pIC50, PIC200 y diferentes longitudes y formatos de si1498 a 100 nM. La activación de PKR y TLR3 se evaluó mediante la medición de PKR fosforila y IRF3, respectivamente. La expresión de un gen de interferón estimulado (ISG) se evaluó mediante la medición de los niveles de P150 ISG ADAR1 relativas a la variante expresada constitutivamente, P110 ADAR1. La expresión de actina se utilizó como control de carga. este figurE se ha modificado a partir de 16, los derechos de autor Sociedad Americana de Microbiología. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre de búfer / Reactivo | Composición |
| Cóctel de interrupción viral | 60 mM Tris-HCl (de 1 M Tris-HCl, pH 7,8), KCl 75 mM, 5 mM MgCl 2, EDTA 1,04 mM, 1% NP-40. |
| cóctel radiactivo | 60 mM Tris-HCl (de 1 M Tris-HCl, pH 7,8), KCl 75 mM, 5 mM MgCl 2, EDTA 1,04 mM, 10 mg / ml de poli (A), 0,33 g / ml oligo dT. Añadido inmediatamente antes de su uso: 8 mM ditiotreitol (DTT, C 4 H 10 O 2 S 2) y 5 l [32P] dTTP (3.000 Ci / mmol) Por cada 500 l de cóctel. |
| Radiactivo cóctel de interrupción / viral | 60 mM Tris-HCl (de 1 M Tris-HCl, pH 7,8), KCl 75 mM, 5 mM MgCl 2, EDTA 1,04 mM, 0,1% NP-40, 5 mg / ml de poli (A), 0,16 g / ml oligo dT. Añadido inmediatamente antes de su uso: ditiotreitol 8 mM (DTT, C 4 H 10 O 2 S 2) y 5 l [32 P] dTTP (3.000 Ci / mmol) para cada 1 ml de cóctel. |
| 2x SSC | 17,53 g de NaCl y 8,82 g de citrato de sodio - 2H 2 O en 1 LH 2 O. |
| tampón de lisis | 50 mM Tris-HCl (de 1 M Tris-HCl, pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM (de 0,5 M, pH 8,0), 10% v / v glicerol, 1% v / v de NP-40. |
| Ponceau S | 2,5 g Ponceau S y 5 ml de ácido acético en 500 ml de H2O |
| TBST 6,05 g de Tris, 8,76 g de NaCl y 1 ml de Tween 20 en 1 LH 2 O. |
Tabla 1:. Los componentes de tampones no comerciales y reactivos Recetas para todos los tampones no comerciales y los reactivos se proporcionan.
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Discussion
El ensayo de la producción de VIH-1 descrito se realizó utilizando células HEK293T (Figura 2) y es similar a los ensayos utilizados para la detección de VIH-1 RNA de ribozima eficaz 13, shRNA 10,29, siRNA 30, y ARN U1i sitios 11,31 objetivo. El uso de diferentes métodos para cuantificar la producción de VIH-1, la mayoría de estudios han medido la producción viral 48 horas después de la co-transfección de un plásmido de expresión de VIH-1 con los ARN candidatos. Después de la producción de VIH-1, los viriones inmaduros se someten a escisión proteolítica de sus poliproteínas por la proteasa del VIH-1 para convertirse en viriones maduros, capaces de infectar nuevas células. Para el ensayo de actividad de la enzima RT del VIH-1 descrito en las etapas 2.2. a 2.5., la producción y pasos de maduración se evalúan, ya que el enzima RT está activa sólo en los viriones maduros. En contraste, la proteína de la cápside y el ARN viral pueden estar presentes en ambos viriones maduros e inmaduros. Por lo tanto, la cuantificación de la producción de VIH-1 por p24 ELISA o RT-PCR may pierda efectos de los ARN terapéuticos que actúan sobre la etapa de maduración del ciclo de replicación del VIH-1, tales como ribozimas que localizar a VIH-1 viriones 32 y moléculas basadas en antisentido que inhiben el procesamiento de Gag además del VIH-1 de expresión de proteínas 13, 31. Una limitación de los ensayos de producción viral es que las células utilizadas no expresan los receptores apropiados para el VIH-1 de entrada y no se pueden utilizar para evaluar los efectos de los ARN terapéuticos sobre el VIH-1 de entrada o de integración.
Para evaluar los efectos de anti-VIH-1-ARN en todo el ciclo de replicación, diversos modelos de infección por VIH-1 se han utilizado en diferentes líneas celulares de linfocitos T o células de sangre primarios 5,33. Desde estas líneas celulares son difíciles de transfectar, son necesarias para suministrar cantidades suficientes de VIH-1 anti-ARN para observar los efectos sobre el VIH-1 de replicación más métodos intensivos de mano de obra, tales como la inserción de genes del vector lentiviral o aptámero / conjugación de péptidos. Esta limitación hace que sea difficult comparar rápidamente la relación estructura-actividad entre las variantes de un determinado anti-HIV-1 RNA o efectuar pruebas de detección a gran escala para identificar el sitio de destino óptimo para nuevas clases de anticuerpos anti-VIH-1 ARN. Mientras que los ensayos de producción viral han sido útiles para la identificación de nuevas moléculas anti-HIV-1 RNA, modelos celulares alternativos en líneas celulares fácilmente transfectadas que apoyan el VIH-1 de replicación, tales como células-bl TZM, sería útil para la detección de anti-HIV-1 ARNs dirigidas a otras etapas del ciclo de replicación, como la entrada y la integración.
Dependiendo de la clase de anticuerpos anti VIH-1-RNA, se han descrito varios mecanismos potenciales de toxicidad. Por ejemplo, los ARN basadas en antisentido pueden tener efectos fuera de objetivo en los ARN celulares que contienen la misma o una secuencia similar a su sitio de destino previsto en el VIH-1 ARN. Del mismo modo, los aptámeros de ARN, siguiendo el modelo del elemento de respuesta de trans-activación (TAR) o elemento de respuesta Rev (RRE), podrían afectar la función de pr celularoteins, tales como la proteína de unión de ARN TAR (TRBP) 34. shRNAs y siRNAs tienen el potencial añadido de afectar a la vía de la interferencia de ARN por proteínas RNAi secuestrantes 35 y algunas moléculas U1i han sido demostrado que afectan el empalme y el procesamiento de los ARN celulares por secuestrar las proteínas de la U1 pequeña de ARN-proteína nuclear complejo 36. Mientras que algunos de estos efectos pueden minimizarse mediante un diseño cuidadoso, determinación de la toxicidad celular en las pantallas de nuevas moléculas anti-HIV-1 RNA son útiles en la exclusión de las moléculas con potenciales efectos fuera de la meta de un mayor desarrollo. Por otra parte, fuera de objetivo efectos podrían inhibir indirectamente la producción de VIH-1, por lo que la toxicidad celular una medida importante en la validación de la eficacia de los nuevos fármacos anti-VIH-1 moléculas identificadas de las pantallas de VIH-1 de producción.
El ensayo de viabilidad celular descrito en los pasos 3.1. a 3,4. es una variación de un ensayo estándar que se ha utilizado para detectar diversa molécula antiviral s 37. El ensayo mide la actividad de las enzimas celulares NAD (P) H-dependientes para reducir el reactivo MTT a su forma púrpura insoluble, formazan. El protocolo es una adaptación de los métodos publicados anteriormente 38 y varios kits están disponibles usando MTT u otros reactivos estrechamente relacionadas. Si bien es importante para someter a ensayo la viabilidad celular en la línea celular utilizada para la detección de anti-VIH-1-ARN, hay que señalar que las diferentes líneas celulares varían en su sensibilidad hacia la toxicidad inducida por ARN. Por ejemplo, Reynolds et al. Demostrado que Dicer siRNAs sustrato no tuvieron efecto sobre la viabilidad celular en las células HEK293T, pero redujo significativamente la viabilidad celular en las células MCF7, DU145 y HeLa S3 39. Para el ensayo descrito en el presente documento, las células HEK293T se utilizan como un ejemplo (Figura 4); sin embargo, el mismo ensayo también se ha hecho en las células MCF7 para evaluar la toxicidad potencial en una línea celular que es más sensible a la toxicidad pequeño ARN inducida 16.
e_content "> Desde-HIV-1 anti-ARN no puede ser procesado y presentado al sistema inmune adaptativo, se consideran menos inmunogénico en comparación con anti-1-HIV-proteínas o péptidos. Sin embargo, dependiendo de su secuencia o estructura, que pueden provocar innata las respuestas inmunes, y varios sensores inmunes y vías de señalización han sido identificados que pueden responder a los ARN pequeños (revisado en 40). en el ensayo de activación inmune se describe aquí, los niveles de PKR fosforila y IRF3 se compararon en células transfectadas con ARN pequeños como una indicación de la activación de PKR o TLR3, respectivamente. Ambos sensores de ARN están presentes en una amplia gama de líneas de células y su activación pueden conducir a la producción de interferones de tipo 1 y, en el caso de PKR, un apagado en la traducción. para evaluar el potencial para la lucha contra el VIH-1 ARN para activar la producción de interferones de tipo 1 por vías alternativas, los niveles de la ADAR1 gen de interferón-estimulado (p150) también se compararon en las células transfectadas conanti-HIV-1 ARN. Como se demuestra por los efectos de la larga dsRNA de control positivo, Poly I: C, todas estas respuestas se activa en las células HEK293T (Figura 5) y no se observaron efectos similares en las células MCF7 16. Dado que estas respuestas podrían inhibir la producción de VIH-1 en ausencia de efectos sobre la viabilidad celular, el ensayo de activación inmune proporciona una validación adicional para la eficacia de nuevos anti-VIH-1 ARN. Otras medidas que podrían añadirse a esta evaluación incluyen la medición de la producción de citocinas inflamatorias y los interferones tipo 1 en el sobrenadante de cultivo de células, y la medición de la expresión de genes de interferón más estimulada. Dado que las células diana del VIH, tales como macrófagos y las células T CD4 + pueden expresar diferentes niveles de sensores inmunes innatas, los candidatos identificados a partir de los ensayos descritos en este protocolo también deben ser evaluados para una posible estimulación inmune en estos tipos de células.Para todos los ensayos describend, el paso crítico para la obtención de resultados reproducibles y precisos es la preparación de los tubos de ADN o ARN de transfección (paso 1.3.). El ADN plásmido o ARN deben ser de alta pureza con concentraciones determinadas con precisión. También es fundamental para incluir los controles apropiados. Para la evaluación de nuevos plásmidos de expresión de ARN de ensayo en el ensayo de la producción viral, un control negativo adecuado es el plásmido de expresión vacía. Para ARN basadas en antisentido, un plásmido de control negativo adicional que expresa un ARN no la orientación también deben ser incluidos. Las secuencias para una ribozima no director y shRNA que no afectan a la producción de VIH se proporcionan en el 13. Para siRNAs de prueba, el único control negativo que se puede utilizar es un ARN no la focalización y una secuencia de siRNA no la orientación apropiada para el ensayo de la producción viral se proporciona en 16. Para la viabilidad celular y ensayos de activación inmune, el control negativo debe células tratadas con el reactivo de transfección solo y es critical que un control positivo tales como poli I: C se incluye para confirmar que las células son sensibles a la toxicidad inducida por ARN o la activación inmune. Para ARN plásmidos de expresión, el plásmido vacío también debe ser incluido para asegurar que el propio vector no tiene efectos tóxicos sobre las células.
En general, los ensayos descritos en este documento representan un buen primer paso hacia la identificación de terapias de ARN seguros y eficaces para el uso en el VIH-1 gen o terapia con medicamentos. Para las moléculas que atacan al VIH-1 RNA, también es importante tener en cuenta la conservación de su sitio diana en el VIH-1 cepas circulantes, y los métodos detallados para calcular la secuencia de conservación se han publicado previamente 15. Para mover una molécula adelante en los ensayos clínicos, estudios de toxicidad y eficacia a largo plazo deben ser realizados en células humanas primarias y en modelos animales para confirmar que los candidatos identificados estarán seguros y eficaces en la clínica.
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Acknowledgments
El trabajo presentado aquí fue apoyada por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) (otorga DCB-120266, PPP-133377 y 348967 a HBF-AG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM HyClone | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| FBS HyClone | GE Healthcare | SH30396.03 | |
| Penicillin/Streptomycin Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well. | Corning | 353075, 353047, 353043 | |
| Micro tubes Axygen | Corning | 311-08-051 | |
| Low molecular weight Poly I:C | InvivoGen | 3182-29-6 | |
| DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | transfection reagent for synthetic RNAs |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2300 | transfection reagent for RNA expression plasmids |
| Nonidet P40 (NP-40) | USB | 19628 | |
| [32P]dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
| poly(A) RNA template | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
| oligo(dT)12-18 DNA primer | Thermo Fisher | 18418-012 | |
| DEAE filtermat paper | Perkin Elmer | 1450-522 | |
| Microplate scintillation counter | Perkin Elmer | 1450-024 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
| DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
| Microplate spectrophotometer | Bio-rad | 1706930 | |
| Lysis buffer tablets | Roche | 4693159001, 4906837001 | protease and phosphatase inhibitors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Bradford reagent | Bio-rad | 500-0006 | |
| Gel running chamber | Hoefer | SE600 | |
| Semi-dry transfer cell | Bio-rad | 1703940 | |
| Protein ladder EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 162-0094 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
| Antibody stripping solution | Millipore | 2504 | |
| ECL - Pierce | Thermo Fisher | PI32106 | |
| ADAR1 antibody | from Dr. B.L. Bass | ||
| phospho-T446-PKR antibody | Abcam | ab32036 | |
| phospho-S396-IRF3 antibody | Cell Signaling | 4947 | |
| PKR antibody | from Dr. A. Hovanessian | ||
| IRF3 antibody | Cell Signaling | 11904 | |
| Actin antibody | Millipore | MAB1501 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-rabbit | KPL | 474-1506 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-mouse | KPL | 474-1806 | |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | 6226-79-5 |
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