Introduction
現在のHIV-1治療の限界は、それらが慢性疾患の進行を予防するために投与しなければならないことです。 HIV-1抵抗性Tリンパ球または造血幹細胞の移植、薬物療法1,2の非存在下でHIV-1複製の長期制御を提供する可能性があり、また、HIV-1の硬化を達成するのに有効なアプローチであり得ます3。 HIV-1複製に耐性細胞をレンダリングするための一つの方法は、自己移植4中に感染した個体の細胞内への抗HIV-1のRNAまたはペプチドをコードする1つ以上の遺伝子を挿入することです。いくつかの候補の抗HIV-1遺伝子は、任意の単一遺伝子をHIV-1抵抗性の発達を防止するために、2つの5または三6の組み合わせでいくつかの入力の臨床試験を用いて設計されています。
抗HIV-1 RNAは、免疫応答を誘発するそれらの低電位による組み合わせ遺伝子治療のために、彼らため上位候補の一つであります非常に短い遺伝子配列から転写されます。いくつかの抗HIV-1 RNAは、ウイルスの侵入及び統合を標的とするように設計されています。しかし、ほとんどの抗HIV-1 RNAは、ウイルスのライフサイクルの後の積分ステップ（ 図1）を標的とします。統合後の阻害剤は、このようなリボザイム7、shRNAは8とU1i RNAを9として、HIV-1調節タンパク質Tatのまたは改訂1、およびアンチセンスベースのRNAを標的とするHIV-1 RNAに異なる部位を標的、デコイRNAを含みます。抗HIV-1 RNAの有効性を比較するために使用されている方法は、10の候補のRNAをコードする遺伝子で形質導入した細胞におけるウイルス複製を監視し、一過候補RNAを発現するプラスミドでトランスフェクトした細胞におけるウイルス産生を測定し、HIV-1発現プラスミドを含みます-13。我々は以前に新しいリボザイム標的部位13-15ためのHIV-1 RNAをスクリーニングするために、HIV-1産生アッセイを使用しています。これらの方法は、以降、RNAのフォーマットを最適化するために洗練されています干渉分子は、shRNAのようプラスミドDNAから発現または合成siRNA 16として配信します。このアッセイは、ヒト胚性腎臓（HEK）293T細胞から成熟したウイルスの産生を測定し、HIV-1複製サイクルの後の積分ステップ（ 図1）を標的とする阻害剤の効果を比較するために使用することができます。統合前のステップを標的とする阻害剤は、このようなTZM-BL細胞感染性アッセイ17などの代替アッセイは、抗ウイルス効果を評価するために必要とされます。
診療所での抗HIV-1 RNAの送達のための主要な安全上の懸念は、人間のRNAまたはタンパク質、および先天性免疫センサーの活性化に対する潜在的なオフターゲット効果が含まれます。抗HIV-1 siRNAの毒性を評価するために、我々は、異なる細胞株16における細胞生存率アッセイを使用しています。我々はまた、二本鎖RNA、免疫センサーの活性化を測定し、RNA活性化プロテインキナーゼR（PKR）及び受容体3（TLR3）Toll様、並びにEXインターフェロンのPRESSIONは、遺伝子、ADAR1のP150を刺激しました。これらのアッセイは、抗HIV-1 RNAの有効性は、細胞の生存または免疫センサーの活性化の間接的な影響によるものではないことを確認するために使用することができます。彼らはまた、さらなる開発の潜在的な毒性を有する候補RNAを除くのに有用です。
次のプロトコルでは、新しい治療のRNAを識別し、既存のフォーマットを最適化するための手順が記載されています。方法は、HIV-1複製のRNAベースの統合後の阻害剤をスクリーニングするために有用であり、そのようなウイルスRNA 18または統合された標的とするように設計されたCRISPR / CASシステムの改訂媒介輸出を標的とする小分子などの他の統合後の阻害剤をスクリーニングするために適合させることができますHIV-1 DNA 19。
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Protocol
1.細胞およびトランスフェクション
- ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で培養HEK 293T細胞を、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充しました。細胞培養培地中の2×10 5細胞/ mlの懸濁液を調製します。それぞれ、ウイルス産生のために、24ウェル、96ウェル、12ウェルプレートの各ウェルに細胞の生存および免疫活性化アッセイ細胞懸濁液の500、100〜1,000μLを加える（ 図2A）。
- 静かにプレートを旋回し、5％のCO 2で37℃でO / Nそれらをインキュベートします。百分の50から70の密集度に細胞を増殖させます。
- トランスフェクションの計画によると、1.5ミリリットルのマイクロチューブ（例、 図2B）に試験RNAおよびそのコントロールの希釈液を準備します。
- ウイルス産生アッセイのために、HIV-1発現プラスミド10ngの/μlの希釈を準備し、各チューブに10μlを添加します。次の5μMの試験RNAの希釈液および陰性対照RNを準備A. 25または100 nMの最終濃度のために、対応するチューブに各試験RNAおよび陰性対照希釈の2.5または10μLを加えます。
- C：細胞生存率アッセイのために、試験RNAおよびポジティブコントロールRNA、低分子量ポリIの10 mg / mlで希釈5μMの希釈液を準備します。それぞれ、100 nMまたはそれを200μg/ mlの最終濃度のために、対応するチューブに試験RNAまたは陽性対照RNA希釈液の2μlを添加します。
- 免疫活性化アッセイのために、ステップ1.3.2で作成した試験RNAまたは陽性対照RNA希釈液の20μlのを追加します。それぞれ100 nMもしくは200 / mlの最終濃度、に対応するチューブに。
テストRNA発現プラスミドのために、試験RNAの5μM希釈液の代わりに、10 ngの/μlの希釈液を調製し、ステップ1.3.1のための25および100 ngの最終的な量を与える：注意してください。およびステップ1.3.2のための100 ngの。および1.3.3。
- ウイルスのprodのための各トランスフェクションチューブにDMEMの50、25または75μLを加えますそれぞれuction、細胞の生存および免疫活性化アッセイ。ウイルス産生アッセイのために、次のステップの前にバイオセーフティレベル3（BSL3）研究室への細胞、準備トランスフェクションチューブをもたらします。
- トランスフェクションチューブにトランスフェクション試薬を順次2μlを添加して、複合体を形成することができるように、15〜20分間インキュベートします。使用される特定のトランスフェクション試薬のための材料の表を参照してください。
- 滴下細胞培養プレートの対応する位置に各マイクロチューブから全トランスフェクション混合物を加えます。ゆっくり旋回し、5％のCO 2で37℃で48時間プレートをインキュベートします。
- 細胞培養プレート中のHIV-1産生（セクション2）、細胞生存率（セクション3）と免疫活性化（セクション4）（ 図2C）を測定します 。
2.ウイルス産生アッセイ
- インキュベーターから24ウェル細胞培養プレートを外し、静かにBSL3細胞培養内部のプレートを旋回フード。 HIV-1産生を定量化するために使用される96ウェル平底プレートに対応するウェルに、各ウェルからの上清150μlのを転送します。
注意：一般的なウイルスの定量アッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）20、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）21によるウイルスRNAを定量することにより、HIV-1キャプシドタンパク質（P24）の発現を測定し、活性を測定することを含みますHIV-1 RT酵素。 2.2 2.5には、HIV-1 RT活性13,15,16を定量化する方法を説明する手順。 - ウイルスの破壊カクテル15（ 表1）の25μLを含む96ウェルプレートの対応するウェルに上清の5μlを採取し、。室温で5分間混合物をインキュベートし、放射能のワークステーションにプレートを転送します。
注：ステップ2.2。放射能ワークステーションがBSL3実験室で利用できない場合のみ必要です。プレートから除去する必要がない場合BSL3実験室は、2.3に進みます。放射性カクテルを25μlの代わりにウイルス/放射性崩壊カクテル（ 表1）の50μlを添加します。 - 放射性カクテル15（ 表1）を準備し、ウイルス上清と混乱カクテルの各ウェルに25μlを添加します。 2時間37℃で培養します。
- スポット5ガラス繊維ディエチルアミノエチル（DEAE）フィルターマット紙で対応する四角の上に反応混合物μlのスポットが10分間乾燥させます。どの2つのサンプルが互いに直接ボーダーないように、他のすべての広場に反応混合物を発見。これは、ステップ2.6で分当たりのカウント（cpm）を決定する際にサンプル間のクロスオーバーを回避するのに役立ちます。
- 紙は、95％エタノールで2つの1分間の洗浄、続いて2×生理食塩水クエン酸ナトリウム（SSC）緩衝液（ 表1）を用いて5分間、5倍洗浄します。論文は、サンプルバッグにそれらを乾燥し、密封することを可能にします。
- クリップサンプルバッグCOカセットにフィルターマット紙をntainingし、マイクロプレートシンチレーションカウンターにカセットを挿入します。実験に使用した[32 P] dTTPのバッチのために提供基準日と32 Pのためのcpmを読むためにカウンタを設定します。プレートマップを使用して、読んで、カウンタを開始するためにどのサンプルを選択します。
- 任意のウイルスの定量法については、隣接する負の制御により、各試験RNAについて得られた値を分割し、試験RNAの各反復のためのHIV-1産生の阻害パーセントを取得するには100で、この値を乗算します。異なる濃度での異なる試験RNAを比較した結果の例を図3に提供されます。
3.細胞生存率アッセイ
- / mlのMTT（3- [4.5ジメチル-2-チアゾリル] -2,5-ジフェニル2H-テトラゾリウムブロマイド）ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水で希釈した（インキュベーターから96ウェルプレートを取り外し、5 mgの20μlのを追加各ウェルにDPBS）。 Fプレートをインキュベートまたは37℃で3時間。
- 洗剤（1％NP-40、イソプロパノール中4 mMの塩酸）を各ウェルへと酸性化イソプロパノール150μlを添加して、室温で2時間プレートをインキュベート。
- マイクロプレート分光光度計で570 nmの吸光度を決定します。
- 隣接するトランスフェクション制御によって各サンプルについて得られた値を割ることにより、各陽性対照および試験RNAの相対MTT代謝を計算します。異なる試験RNAおよび陽性対照を比較した結果の一例を図4に設けられています。
4.免疫活性化アッセイ
- インキュベーターから12ウェルプレートを取り外し、培地を吸引除去します。静かDPBSで細胞を2回洗浄し、各ウェルに（プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む、 表1）冷溶解バッファ22の70μlを添加します。氷上で10分間、プレートをインキュベートします。
- マイクロチューブに細胞溶解物を移し、高速浸漬することにより、それらを凍結液体窒素中でチューブ。サンプルは解凍と3の合計2以上の凍結融解サイクルの繰り返しを許可します。
- 細胞破片をペレット化し、4℃、15,700×gで15分間、溶解物を遠心分離します。新しいマイクロチューブに上清を移し、クマシーブルー（ブラッドフォード）メソッド23,24を用いてタンパク質濃度を決定します。
- 10％変性ポリアクリルアミドゲルに各試料からのタンパク質の75μgのを解決し、以前に25,26を説明したように、ニトロセルロース膜に移します。
- 膜に電気泳動転写した後、蒸留水で洗浄し、1分間ポンソーS（ 表1）中で膜をインキュベートすることによってタンパク質バンドを明らかにする。 80と55 kDaので膜をカットするためのガイドとしてバンドおよびタンパク質ラダーを使用してください。
注：カットスルー所定の位置で膜をカットしていないことが容易であるように、ステップでは4.4のサンプルは、34キロダルトンまでの16×18 cm 2のゲル上で実行することができます興味のあるバンド。また、いくつかのゲルは、膜を切断回避するために、同じ試料を用いて実行することができます。 - 0.05％トゥイーン20（TBST、 表1）を含有するトリス緩衝生理食塩水ポンソーS染色を洗い流します。完全に膜をカバーするために、5％無脂肪乳でTBSTを追加します。 1時間攪拌しながら室温で膜をインキュベートします。
- 、ADAR1（110と150キロダルトン）、ホスホPKR（62キロダルトン）、およびホスホIRF3（47キロダルトン）に対して千1に希釈した3％ウシ血清アルブミン（BSA）とTBSTで膜をO / N及び抗体をインキュベートそれぞれトップ、膜の中央部および底部片のため。
- 膜をTBSTで5分間、5倍、1時間（5,000 1に希釈）を5％脱脂乳およびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ二次抗体を用いてTBSTでインキュベート洗います。
- TBSTで5分間膜5回洗浄し、製造元の指示に従って、フィルム上のバンドを可視化するために電気化学発光（ECL）ソリューションを適用します。
- フィルム上のタンパク質バンドを可視化した後、抗体剥離液で10分間、膜の中央と下部の部分を洗います。 IRF3（500中1で）総PKRに対する3％BSAを含むTBSTで膜をO / Nおよび抗体をインキュベート（千1時）、それぞれ中間及び底部片のため。繰り返しは、4.8を繰り返します。 4.9。 PKR膜（中央）、抗ウサギ二次抗体の代わりに、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスを用いました。
- TBSTで5分間膜5倍の底部片を洗浄し（5000で1に希釈）アクチンに対する抗体で1時間、3％BSAを含むTBST中で膜をインキュベートします。繰り返しは、4.8を繰り返します。 4.9。抗ウサギ二次抗体の代わりに、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスを用いました。異なる試験RNAおよびポジティブコントロールを比較した結果の一例を図5に設けられている。使用される特定の抗体のための材料の表を参照してください。
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Representative Results
手順の一般的な概略図は、3つの試験RNAおよび図2Bに設けられたコントロールRNAのための例示的トランスフェクション計画を図2に示されています。ウイルスの産生および細胞生存率アッセイのために、各試験構築物のための読み出しは、陰性対照に正規化されます。各試験RNAは、その隣接する負の対照に対して標準化されるように複製が、セットでトランスフェクトされます。これは、例えば、陰性対照のすべてが最初にトランスフェクトされ、場合に生じ得る、複合体およびトランスフェクションの間の時間に関連した不正確なデータを避けるために行われています。 HIV-1は、免疫応答27,28に影響を与えることができるので、細胞の生存および免疫活性化アッセイは、HIV-1を発現するプラスミドの添加なしに行われます。
HIV-1 RNA（位置1498から1415で保存された部位を標的RNA干渉分子の最適な長さを特定するために、HIV-1株NL4-3 19）13は 、siRNAのセットは（ 図3A）を設計しました。 HIV-1産生アッセイを使用して、長いダイサー基質ナンセンスsiRNAでトランスフェクトした細胞と比較して、RT活性の割合は、（罪）を発現するプラスミド100ngの同時トランスフェクションの異なる量で各試験siRNAでトランスフェクトされた細胞のために計算されましたHIV-1株NL4-3（ 図3B）。
細胞生存率アッセイを使用して、MTTのパーセント代謝は、図3Bに同定された最も有効なsiRNAをトランスフェクトした細胞について測定しました。データは、単独でトランスフェクション試薬（ 図4）で処理した細胞中でMTT代謝に対して標準化しました。長い二本鎖RNA（ポリI：C）は、細胞生存率を減少させました。しかし、効果が評価され、最高用量でのみ有意でした。細胞生存率の有意な減少は、1498年SIを標的とするsiRNAについて観察されませんでした HIV-1 RNAのTEに関係なく、その長さの。免疫活性化アッセイを用いて、RNAの同じセットは、免疫応答（ 図5）を誘発するそれらの能力について評価しました。ポリIの条件では：CはADAR1のP150の発現およびPKRとIRF3のリン酸化を誘導を活性化し、免疫活性化のマーカーに対する有意な効果は、試験RNAのいずれについても観察することができませんでした。
図1. HIV-1複製サイクルの前後の統合手順の概略プレインテグレーション（1-3）およびHIV-1複製サイクルにおける統合後（4-7）ステップが概説ボックスに表示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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ウイルス産生、細胞の生存および免疫活性化アッセイの 図2の 概略図 （A）プレート接着細胞と24時間培養。細胞は、それぞれ、ウイルス産生、細胞の生存および免疫活性化アッセイのための細胞培養培地の500、100 1000μlのウェルプレート96、24に播種し、12-されます。 （B）48時間トランスフェクション管、トランスフェクト細胞、および文化を準備します。 3つのテストのRNA（RNA1-3）のセットの例のトランスフェクション計画は適切なコントロールで示されています。トランスフェクション手順も示されています。 （C）リードアウト。ウイルス産生、細胞生存率および免疫活性化アッセイのための読み出しが書かれており、セクション2、3および4で詳細に説明され、それぞれ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 </ P>
HIV-1産生に対するテストsiRNAの 図3. 影響。異なる長さおよび対称性を有するsiRNAの（A）のデザイン。 HIV-1 RNA（1498標的部位）で保存された配列は、異なる長さ（17〜29ヌクレオチドのセンス鎖）との対称および非対称のsiRNA（si1498-）を設計するために使用されました。予想される意味（トップ、黒）およびアンチセンス（下、赤）ストランドが示されています。 （B）si1498長さ変異体によるHIV-1産生の阻害。対称または非対称si1498長変種でトランスフェクトしたHEK293T細胞の上清中のHIV-1 RT活性のパーセント（％）阻害が長いダイサー基質ナンセンスのsiRNA（罪）に関連して示されています。各試験RNAは2〜3の複製で少なくとも2つの独立したトランスフェクションにおける異なる用量での罪と比較しました。データは、exprのです標準エラー出力手段（SEMの）±平均値としてessed。この図は、著作権のアメリカの社会は微生物学のために、16から変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
細胞生存率に対するsi1498長さ変異体の 図4. 効果 HEK293T細胞をポリIでトランスフェクトした：100 nmで50とを200μg/ mlの（pIC 50とPIC200）でCとsi1498の異なる長さと形式。 MTTの％代謝は2〜3反復と3の独立したトランスフェクションにおける単独のトランスフェクション試薬（モック、M）で処理した細胞と比較して決定しました。データは、SEMの±平均値として表現されています。不対スチューデントt検定を、異なるトランスフェクションするかどうかを決定するために使用されたsignificantlY（*、P <0.05）モックトランスフェクト細胞への減少した細胞生存率の相対。この図は、著作権のアメリカの社会は微生物学のために、16から変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
自然免疫応答にsi1498長さ変異体の 図5. 影響。HEK293T細胞はpIC 50、PIC200と異なる長さおよび100 nmでsi1498のフォーマットをトランスフェクトしました。 PKR及びTLR3の活性化は、それぞれ、リン酸化PKR及びIRF3を測定することにより評価しました。インターフェロン刺激遺伝子（ISG）の発現は、構成的に発現される変異体、ADAR1のP110に対するISG ADAR1のP150レベルを測定することにより評価しました。アクチンの発現をローディング対照として使用しました。このfigureは、著作権のアメリカの社会は、微生物学のために、16から変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| バッファ/試薬の名前 | 組成 |
| ウイルス破壊カクテル | 60mMのトリス-HCl、75mMの塩化カリウム、5mMのMgCl 2、1.04 mMのEDTA、1％NP-40（1 Mトリス-HCl、pHが7.8から）。 |
| 放射性カクテル | 60mMのトリス-HCl、75mMの塩化カリウム、5mMのMgCl 2、1.04 mMのEDTA、10 / mlのポリ（A）、0.33 / mlのオリゴdT（1 Mトリス-HCl、pHが7.8から）。使用直前に追加しました：8 mMのジチオスレイトール（DTT、C 4 H 10 O 2 S 2）と5μlの[32 P] dTTPを（3000 CI /ミリモル）カクテルの各500μlのため。 |
| 放射性/ウイルスの破壊カクテル | （1 Mトリス-HCl、pHが7.8から）60mMのトリス-HCl、75mMの塩化カリウム、5mMのMgCl 2、1.04 mMのEDTA、0.1％NP-40、5μg/ mlのポリ（A）、0.16 / mlのオリゴdTを。使用直前に追加しました：8 mMのジチオスレイトール（DTT、C 4 H 10 O 2 S 2）とカクテルの各1ミリリットルのための5μlの[32 P] dTTPを（3000 CI /ミリモル）。 |
| 2×SSC | 17.53グラムのNaClおよび8.82グラムのクエン酸ナトリウム- 2H 2 O 1 LH 2 Oで |
| 溶解バッファー | 50mMのトリス-HCl、150mMのNaCl、5mMのEDTA（1 Mトリス-HCl、pHが7.4から）、10％（v / v）のグリセロール、1％v / vの（0.5 M、pHが8.0から）NP-40。 |
| ポンソーS | 2.5グラムポンソーSと5ミリリットル500ミリリットルのH 2 O中の酢酸 |
| TBST 6.05グラムのTris、8.76グラムのNaClと1 LH 2 Oで1ミリリットルのTween 20 |
表1：非商用のバッファーと試薬のコンポーネントすべて非商用のバッファーと試薬のためのレシピが用意されています。
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Discussion
HIV-1産生アッセイを説明11,31標的部位をHEK293T細胞（ 図2）を使用して実施し、効果的なリボザイム13、shRNAを10,29のためのHIV-1 RNAをスクリーニングするために使用されるアッセイと類似して、siRNAの30、及びU1i RNAました。 HIV-1産生を定量するために異なる方法を使用して、ほとんどの研究は、候補RNAとHIV-1発現プラスミドのコトランスフェクションした後、ウイルス産生の48時間を測定しました。 HIV-1の産生に続いて、未成熟ビリオンは、新しい細胞に感染することができる成熟ビリオン、となるようにHIV-1プロテアーゼによるそのポリタンパク質のタンパク質分解的切断を受けます。工程2.2に記載のHIV-1 RT酵素活性アッセイのために。 RT酵素が成熟ビリオンでのみアクティブになりますので、2.5に。、生産および成熟段階の両方が、評価されます。対照的に、カプシドタンパク質及びウイルスのRNAの両方の成熟と未成熟ビリオン中に存在してもよいです。したがって、p24のELISAまたはRT-PCRメートルによってHIV-1産生を定量化しますAY、HIV-1ビリオン32およびHIV-1タンパク質の発現13に加えて、ギャグの処理を阻害するアンチセンスベースの分子に局在するようなリボザイムなどのHIV-1複製サイクルの成熟段階に作用する治療RNAの効果を、逃します31。ウイルス産生アッセイの制限は、使用される細胞は、HIV-1の侵入のための適切な受容体を発現せず、HIV-1の侵入または統合の治療RNAの効果を評価するために使用することができないことです。
全体の複製サイクルの抗HIV-1 RNAの効果を評価するために、種々のHIV-1感染モデルは、異なるTリンパ球細胞株または初代血液細胞5,33に使用されてきました。これらの細胞株をトランスフェクトすることが困難であるので、このようなレンチウイルスベクターの遺伝子挿入またはアプタマー/ペプチド結合などの多くの労働集約的な方法は、HIV-1複製に対する効果を観察するために、抗HIV-1 RNAの十分な量を送達するために必要です。この制限は、ディなります迅速に特定の抗HIV-1 RNAの変異体との間の構造活性相関を比較または抗HIV-1 RNAの新規クラスの最適な標的部位を同定するための大規模なスクリーニングを行うためのfficult。ウイルス産生アッセイは、TZM-BL細胞などのHIV-1複製をサポート容易にトランスフェクトされた細胞株における新規な抗HIV-1 RNA分子、代替細胞モデルを同定するために有用であったが、抗HIV-1をスクリーニングするために有用であろうそのようなエントリや統合などの複製サイクルの他のステップを、標的とするRNA。
抗HIV-1 RNAのクラスに依存して、毒性のいくつかの潜在的なメカニズムが記載されています。例えば、アンチセンスベースのRNAは、HIV-1 RNAにそれらの意図される標的部位と同一または類似の配列を含有する細胞RNAのオフターゲット効果を有することができます。同様に、RNAアプタマーは、トランス活性化応答エレメント（TAR）または改訂応答エレメント（RRE）をモデルにした、携帯広報の機能に影響を与える可能性がありますこのようなTAR RNA結合タンパク質（TRBP）34としてoteins、。 shRNAおよびsiRNAは、RNAiのタンパク質35といくつかのU1i分子を隔離することによって、RNA干渉経路に影響を与える追加された可能性がU1小核RNAタンパク質複合体36のタンパク質を隔離することによって細胞RNAのスプライシングおよび処理に影響を与えることが示されているいます。これらの効果の一部は、注意深い設計によって最小化することができるが、新たな抗HIV-1 RNA分子についてのスクリーニングにおける細胞毒性の測定は、さらなる開発の潜在的なオフターゲット効果を有する分子を除外するのに有用です。また、オフターゲット効果は、間接的に細胞毒性をHIV-1産生のスクリーニングから同定された新規な抗HIV-1分子の有効性を検証する上で重要な測定を行う、HIV-1産生を阻害し得ます。
細胞生存率アッセイは、工程3.1に記載します。 3.4。多様な抗ウイルス分子をスクリーニングするために使用されている標準的なアッセイの変形であります 37です。アッセイは、ホルマザン、その不溶性紫色形態にMTT試薬を減少させるために、NAD（P）H依存性細胞酵素の活性を測定します。プロトコルは、以前に公開された方法38から適応される、いくつかのキットはMTTまたは他の密接に関連する試薬を使用してご利用いただけます。それは、抗HIV-1 RNAをスクリーニングするために使用される細胞株における細胞生存率を測定することが重要であるが、異なる細胞株は、RNA誘導毒性に向かって、その感度が変化することに留意すべきです。例えば、レイノルズらは 39 MCF7、DU145およびHeLa S3細胞においてダイサー基質siRNAはHEK293T細胞における細胞生存率に影響を及ぼさなかったことを実証したが、有意に減少し、細胞の生存率。本明細書に記載のアッセイのために、HEK293T細胞を、実施例（ 図4）として使用されます。しかしながら、同一のアッセイはまた、小さなRNAによって誘導される毒性16に対してより感受性である細胞株における潜在的な毒性を評価するために、MCF7細胞において行われました。
e_content ">抗HIV-1 RNAは、適応免疫系に加工し、提示することができないので、それらは、抗HIV-1タンパク質またはペプチドと比較して免疫原性が低いと見なされているが、それらの配列または構造に応じて、それらが生来の誘発することができます免疫応答、およびいくつかの免疫センサーおよびシグナル伝達経路は、（40に概説されている）の小さなRNAに対応できることが確認されている。免疫活性化アッセイでは、ここで説明するリン酸化PKR及びIRF3のレベルはとして低分子RNAでトランスフェクトした細胞で比較しましたPKRまたはTLR3活性化の指標で、それぞれ。両方のRNAセンサーは、細胞株の広い範囲に存在し、それらの活性化はPKR、翻訳でシャットダウンの場合には、1型インターフェロンの産生をもたらすことができます。評価するために抗HIV-1のRNAの可能性が代替経路によって1型インターフェロンの産生を活性化するために、インターフェロン刺激遺伝子ADAR1（P150）のレベルもでトランスフェクトした細胞で比較しました抗HIV-1のRNA。長いdsRNA陽性対照の効果によって実証されるように、ポリI：C、これらの応答のすべてが（ 図5）HEK293T細胞において活性であり、同様の効果がMCF7細胞16で観察されました。これらの応答は、細胞生存率に対する効果の非存在下でHIV-1産生を阻害し得るので、免疫活性化アッセイは、新規な抗HIV-1 RNAの有効性のための付加的な検証を提供します。この評価に追加することができ、さらに、測定は、細胞培養上清中の炎症性サイトカインおよび1型インターフェロンの産生を測定し、さらにインターフェロン刺激遺伝子の発現を測定することが挙げられます。そのようなCD4 + T細胞およびマクロファージのようなHIVの標的細胞は、自然免疫センサの異なるレベルを発現することができるので、このプロトコルに記載のアッセイで同定された候補は、これらの細胞タイプの潜在的な免疫刺激のために評価されるべきです。記述のアッセイのすべてのためにD、再現性及び正確な結果を得るための重要な工程は、DNAまたはRNAのトランスフェクションチューブの調製である（ステップ1.3）。濃度が正確に決定して、プラスミドDNAまたはRNAは高純度であるべきです。また、適切なコントロールをすることが重要です。ウイルス産生アッセイにおいて新しいテストRNA発現プラスミドを評価するために、適切なネガティブコントロールは、空の発現プラスミドです。アンチセンスベースのRNAについて、非標的RNAを発現する追加の陰性対照プラスミドも含まれるべきです。 HIV産生に影響を与えない非標的リボザイムのための配列およびshRNAが13に設けられています。試験のsiRNAを使用することができる唯一の陰性対照は非標的RNAと16に設けられたウイルス産生アッセイに適した非標的化siRNA配列です。細胞の生存および免疫活性化アッセイでは、陰性対照細胞は、単独でトランスフェクション試薬で処理されるべきであり、それはcこのようなポリI陽性対照としてそのritical：Cは、細胞がRNA誘導毒性や免疫活性化に応答性であることを確認するために含まれています。 RNA発現プラスミドのために、空のプラスミドはまた、ベクター自体が細胞に対して毒性効果を有していないことを確実にするために含まれるべきです。
全体的に、本明細書に記載のアッセイは、HIV-1遺伝子または薬物療法で使用するための安全で効果的なRNA療法の同定に向けて良好な最初のステップを表しています。 HIV-1 RNAを標的とする分子では、以前に15公表されている配列の保存を計算するために、HIV-1の循環株におけるそれらの標的部位の保護、および詳細な方法を考慮することも重要です。臨床試験へ前進分子を移動するには、長期毒性と有効性の研究は、特定された候補者が安全と診療所で有効になることを確認するために、初代ヒト細胞および動物モデルで実行する必要があります。
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Acknowledgments
ここで紹介する作品は、（AGにDCB-120266、PPP-133377およびHBF-348967を付与）健康研究（CIHR）のカナダの研究所によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM HyClone | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| FBS HyClone | GE Healthcare | SH30396.03 | |
| Penicillin/Streptomycin Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well. | Corning | 353075, 353047, 353043 | |
| Micro tubes Axygen | Corning | 311-08-051 | |
| Low molecular weight Poly I:C | InvivoGen | 3182-29-6 | |
| DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | transfection reagent for synthetic RNAs |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2300 | transfection reagent for RNA expression plasmids |
| Nonidet P40 (NP-40) | USB | 19628 | |
| [32P]dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
| poly(A) RNA template | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
| oligo(dT)12-18 DNA primer | Thermo Fisher | 18418-012 | |
| DEAE filtermat paper | Perkin Elmer | 1450-522 | |
| Microplate scintillation counter | Perkin Elmer | 1450-024 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
| DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
| Microplate spectrophotometer | Bio-rad | 1706930 | |
| Lysis buffer tablets | Roche | 4693159001, 4906837001 | protease and phosphatase inhibitors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Bradford reagent | Bio-rad | 500-0006 | |
| Gel running chamber | Hoefer | SE600 | |
| Semi-dry transfer cell | Bio-rad | 1703940 | |
| Protein ladder EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 162-0094 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
| Antibody stripping solution | Millipore | 2504 | |
| ECL - Pierce | Thermo Fisher | PI32106 | |
| ADAR1 antibody | from Dr. B.L. Bass | ||
| phospho-T446-PKR antibody | Abcam | ab32036 | |
| phospho-S396-IRF3 antibody | Cell Signaling | 4947 | |
| PKR antibody | from Dr. A. Hovanessian | ||
| IRF3 antibody | Cell Signaling | 11904 | |
| Actin antibody | Millipore | MAB1501 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-rabbit | KPL | 474-1506 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-mouse | KPL | 474-1806 | |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | 6226-79-5 |
References
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