Abstract
המגוון של RNAs ללא קידוד קטן (Srna) היא מתרחבת במהירות ותפקידיהם בתהליכים ביולוגיים, כולל ויסות הגנים, הם מתעוררים. הדבר המעניין ביותר, sRNAs הם גם מצאו מחוץ לתאים ו נמצאים ביציבות בכל נוזלים ביולוגיים. ככזה, sRNAs התאי מייצג סוג רומן של סמנים ביולוגיים למחלות קרובות לוודאי מעורב איתות תא ורשתות תקשורת בין תאית. כדי להעריך את הפוטנציאל שלהם לשמש כסמנים ביולוגיים, sRNAs ניתן לכמת בפלסמה, בשתן, ונוזלים אחרים. אף על פי כן, כדי להבין את ההשפעה מלאה של sRNAs תאי כאותות האנדוקרינית, חשוב לקבוע אילו ספקים מעבירים והגנה אותם הנוזלים ביולוגיים (למשל, פלזמה), אשר תאים ורקמות לתרום ברכות Srna תאיות, ותאים ורקמות מסוגלות קבלה וניצול Srna התאי. כדי להשיג מטרות אלו, חשוב לבודד אוכלוסיות טהורות מאוד של ספקים תאייםעבור פרופיל וכימות Srna. אנחנו הוכחנו בעבר כי ליפופרוטאינים, במיוחד ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL), להעביר מייקרו RNA הפונקציונלי (מירנה) בין תאים ו- HDL-miRNAs הם שינו באופן משמעותי מחלה. כאן, פרט לנו פרוטוקול חדש אשר מנצל בידוד HDL בד בבד עם ultracentrifugation צפיפות שיפוע (DGUC) ומהר-חלבון נוזלי כרומטוגרפיה (FPLC) להשיג HDL טהור מאוד עבור פרופיל במורד וכימות של כל sRNAs, כולל miRNAs, הן באמצעות גבוהה רצף -throughput וגישות PCR בזמן אמת. פרוטוקול זה יהיה משאב יקר ערך עבור החקירה של sRNAs על HDL.
Introduction
RNA הקטן ללא קידוד התאי (sRNAs) מייצג סוג חדש של סמנים ביולוגיים למחל מטרות טיפוליות פוטנציאליות להקל סביר תא אל תא תקשורת 1. הסוג למד הנרחב ביותר של Srna הוא מייקרו-רנ"א (מירנה) שהם כ 22 nts באורך מעובדים מצורות מבשרות עוד תעתיק עיקרי 2. miRNAs הודגם שלאחר יעתיק לווסת ביטוי גנים באמצעות דיכוי תרגום חלבון והאינדוקציה של שפלת mRNA 2. אף על פי כן, miRNAs הוא רק אחד מסוגים רבים של sRNAs; כמו sRNAs ניתן ביקע מן tRNAs הורה (sRNAs הנגזרות tRNA, TDR), RNAs גרעיני קטן (Srna הנגזרות sRNAs, sndRNA), RNAs nucleolar קטן (snoRNA הנגזרות sRNAs, snRNA), RNAs ריבוזומלי (rRNA הנגזרות sRNAs, RDR RNAs, Y) (yDR), ו RNAs השונה אחרת 1. הנה כמה דוגמאות של sRNAs הרומן האלה דווחו לתפקד דומה miRNAs; לעומת זאת, פו הביולוגיnctions של רבי sRNAs אלה עדיין לא נקבע, אף תפקידי ויסות גנים צפויים 3-6. הדבר המעניין ביותר, miRNAs ו sRNAs אחרים נוכחים ביציבות בנוזלי תאיים, כולל רוק, פלזמה, שתן, ומרה. sRNAs התאי מוגן סביר מן RNases דרך התקשרותן עם שלפוחית תאית (EV), ליפופרוטאינים, ו / או מתחמי ribonucleoprotein תאיים.
בעבר, דיווחנו ליפופרוטאינים כי, כלומר ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL), miRNAs תחבורה בפלסמה 7. במחקר זה, HDL בודדו בשיטה סדרתית של ultracentrifugation צפיפות שיפוע (DGUC), כרומטוגרפיה נוזלית מהיר חלבון (סינון ג'ל כרומטוגרפיה בגודל הדרה, FPLC), ו כרומטוגרפיה זיקה (אנטי-אפוליפופרוטאין AI (apoA-לי immunoprecipitation) 7). שימוש בשני מערכים בצפיפות נמוכה בזמן אמת מבוססי PCR מבחני מירנה בודדים, רמות מירנה כומתו על HDL מבודד לרפאעמך ונושאים hypercholesterolemic 7. בגישה זו, הצלחנו פרופיל miRNAs ולכמת miRNAs הספציפי בהכנות HDL טהורות מאוד. מאז 2011, קבענו כי למרות כרומטוגרפיה זיקת משפר טוהרת HDL, רווית נוגדן מגבילה במידה ניכרת תשואה, והוא יכול להיות עלות אוסרני. נכון לעכשיו, הפרוטוקול שלנו ממליץ על שיטת טנדם רציפי שני שלבים של DGUC ואחריו FPLC, שיוצרים גם דגימות HDL באיכות גבוהה עבור בידוד RNA למטה זרם וכימות Srna. בשל ההתקדמות רצף תפוקה גבוהה של sRNAs (sRNAseq), למשל, miRNAs, והגברת המודעות של מעמדות אחרים שאינם מירנה Srna, sRNAseq הוא המדינה- of-the-art הנוכחי פרופיל מירנה Srna. ככזה, הפרוטוקול שלנו ממליץ miRNAs לכימות sRNAs אחר על דגימות HDL באמצעות sRNAseq. אף על פי כן, RNA הכולל מבודד HDL יכול לשמש גם לכמת miRNAs פרט sRNAs אחר או לאמת תוצאות sRNAseq באמצעות בזמן אמת PCRpproaches. כאן אנו מתארים בפרוטרוט פרוטוקול לאיסוף, טיהור, כימות, ניתוח נתונים, ואימות של sRNAs HDL טהור מאוד.
המטרה הכללית של מאמר זה היא להוכיח את ההיתכנות ואת תהליך של כימות Srna ב- HDL טהור מאוד מבודד מפלסמה אנושית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. טיהור HDL (~ 5.5 ימים)
- צפיפות-Gradient ultracentrifugation (DGUC, ~ 5 ימים)
- להוסיף 90 μL של 100x ואנטי אוקסידנטים עד 9 מיליליטר של פלזמה מבודדת דם ורידים טרי.
- התאם צפיפות פלזמה עם KBR מ 1.006 גרם / מ"ל 1.025 גרם / מ"ל ידי הוספת 0.251 גרם KBR עד 9 מ"ל של פלזמה משלב 1.1.1 (0.0278 גרם / פלזמה מ"ל KBR). Rock the פלזמה עד שכל מלח מתמוסס בטמפרטורת החדר ומעבירים ultracentrifuge צינורות ולהבטיח את כל הבועות עליית הדף.
- לכופף את קצה מחט 18-G 90 ° 1 ס"מ מהקצה, הצד שיפוע כלפי מעלה. באמצעות מזרק ואת המחט 18-מד, למקם בזהירות 3 מ"ל של תמיסת כיסוי # 1 על פלזמה (טבלה 1).
הערה: המחט הכפופה מבטיחה כל VLDL / IDL, LDL, HDL ו מוסרים ללא ערבוב עם שכבת העל. - הסר את רוב הבועות בחלק העליון, עוזב 2 - שטח מ"מ 3 מ המניסקוס לחלק העליון של הצינור carefully ומקום צינורות דליי SW-40Ti.
- לשקול אחד מהסלים (עם כמוסות) על שיווי משקל, בדיוק לאזן עם הדלי ההפוך (דלי + כובע): # 1 עד 4 #, # 2 עד 5 # ו- # 3 עד 6 #.
הערה: דליים אלה חייבים להיות מאוזנים מתאימים בכל העת. - מניחים הרוטור ultracentrifuge (רשימת חומרים). צנטריפוגה ב 274,400 XG במשך 24 שעות ב 4 ° C עם בלם ביניים 4 #.
- מוציאים בזהירות דליים מן הרוטור את הצינורות מן הדליים.
- מוציא בזהירות 2 מיליליטר מן השכבה העליונה של השכבה באמצעות מזרק ומחט מכופף. זה יהיה חלק VLDL / IDL אשר יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס או -80 מעלות צלזיוס.
- לאחר הסרת חלק VLDL / IDL, לאסוף את הנותרים 7 מ"ל של המדגם (פלזמה) ולמקם אותו לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. תביאו את הנפח של המדגם עד 9 מ"ל עם # 2 פתרון כיסוי (טבלה 1).
- התאם את צפיפות מדגם מ 1.025 גרם / מ"ל 1.080 גרם / מ"ל עם KBR באמצעותכ 0.746 גרם KBR במדגם 9 מ"ל או 0.0828 גרם / מ"ל KBR של המדגם. נער בעדינות את המדגם עד שכל KBR נמס (כ 20 דקות) ומעבירים ultracentrifuge צינור תוך בועות הבטחת עליית הדף.
- עם מזרק ומחט, למקם בזהירות 3 מ"ל של תמיסת כיסוי # 3 על המדגם (טבלה 1). השאיר 2 - 3 מ"מ שטח מ המניסקוס לחלק העליון של הצינור.
- הסר את רוב בועות הנותרות בראש הצינור ומקום צינורות ultracentrifuge ומלאו בזהירות בדליי SW-40Ti.
- לשקול אחד מהסלים (עם כמוסות) על שיווי משקל, בדיוק לאזן עם הדלי + כובע הפוך, כמו 1.1.5.
- מניחים הרוטור ultracentrifuge (ראה רשימה של חומרים). צנטריפוגה ב 274,400 XG במשך 24 שעות ב 4 ° C עם בלם ביניים 4 #.
- מוציאים בזהירות דליים מן הרוטור את הצינורות מן הדליים.
- מוציא בזהירות 2 מיליליטר מן השכבה העליונה של השכבה באמצעות מזרק ולהיותמחט NT. זה יהיה חלק LDL אשר יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס או -80 מעלות צלזיוס.
- לאחר הסרת חלק LDL, לאסוף את דגימת המשוער 7 מ"ל של הנותרים (פלזמה) ולמקם אותו לתוך צינור חדש 15 מ"ל חרוטי. תביאו את הנפח של המדגם (פלזמה) עד 9 מ"ל עם 1.080 גרם / מ"ל פתרון # 4 (טבלה 1).
- התאם את צפיפות מדגם מ 1.080 גרם / מ"ל 1.30 גר '/ מ"ל עם KBR באמצעות 3.33 גרם KBR ב 9 המדגם מ"ל (פלזמה) או 0.37 גרם KBR לכל מ"ל של המדגם. רוק או מעט להתסיס את המדגם עד שכל KBR (מלח) הוא מומס ולהעביר ultracentrifuge צינור.
- עם מזרק ומחט, למקם בזהירות 3 מ"ל של תמיסת כיסוי # 5 על המדגם (טבלה 1).
- הסר את רוב בועות הנותרים בראש הצינור, והשאיר חלל 2- 3 מ"מ המניסקוס לחלק העליון של הצינור ובזהירות והמקום צינורות ultracentrifuge מולא בדליים SW-40Ti.
- לשקול אחד מהסלים (עם כמוסות) על שיווי משקל, בדיוק לאזן עם הדלי + כובע הפוך, כמו 1.1.5.
- מניחים הרוטור ultracentrifuge (ראה רשימה של חומרים). צנטריפוגה ב 274,400 XG במשך 48 שעות ב 4 ° C עם בלם # 4.
- מוציאים בזהירות דליים מן הרוטור את הצינורות מן הדליים.
- מוציאים בזהירות כ 2 מ"ל מן השכבה העליונה של שכבת באמצעות מזרק ומחט מכופף. זהו חלק HDL, אשר יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס או -80 מעלות צלזיוס.
הערה: בעקבות HDL DGUC ניתן dialyzed להסיר את פתרונות high-מלח. - כדי dialyze, למקם את החלק היחסי HDL שנאסף בתוך שרוול דיאליזה אטומה (10,000 מגוואט חתוכים) ו dialyze לילה ב 1 ליטר 1x PBS. חיץ דיאליזה שינוי (PBS 1x) 3 פעמים 24 שעות. הפרעות עדינות של PBS עם ומערבבים ברים מגנטי תשפרנה דיאליזה.
- קביעת ריכוז החלבון של DGUC-HDL בשיטת BCA 8.
- Fast-חלבון נוזלי Chromatography (FPLC) או כרומטוגרפיה בגודל הדרה (~ 6 שעות)
- סנן 1.2 מ"ג DGUC-HDL (החלבון הכולל) בשנת 500 μL דרך פילטר 0.22 מיקרומטר מיקרו-צנטריפוגלי (ראה רשימה של חומרים), מיד לפני ההזרקה.
הערה: כרטיס סינון נוסף של מדגם DGUC-HDL דרך פילטר 0.45 מיקרומטר מיקרו-צנטריפוגלי לפני המסנן 0.22 מיקרומטר עשויה להידרש כמה דוגמאות. - אסוף מדגם DGUC-HDL המסונן, לטעון את מזרק הזרקת FPLC (מילוי), ולהבטיח שאין בועות בתוך המזרק לפני ההזרקה לתוך FPLC.
- הגדר את קצב זרימת FPLC 0.3 mL / min עם הגבלת לחץ על 2.6 מגפ"ס. לאזן עמודות עם 0.2 כרכים עמודה (כ 15 מ"ל) של חיץ, לפני לדגום ההזרקה. להזריק את המדגם עם 3 מ"ל של חיץ לתוך המכשיר FPLC (לולאה הזרקה) ולהתחיל את הריצה. אסוף 1.5 שברי מיליליטר עבור סכום כולל של 72 שברים.
- סנן 1.2 מ"ג DGUC-HDL (החלבון הכולל) בשנת 500 μL דרך פילטר 0.22 מיקרומטר מיקרו-צנטריפוגלי (ראה רשימה של חומרים), מיד לפני ההזרקה.
2. RNA קטנים תפוקה גבוההרצף (sRNAseq, ~ 9 ימים)
- בידוד RNA (~ 1 יום)
- זהה את שברי FPLC המתאימים DGUC-HDL ידי קביעת רמות כולסטרול כלליות באמצעות ערכת colorimetric פי הוראות היצרן. שימוש זה הגדרת FPLC, מצפה למצוא 6 - 7 שברים FPLC המכיל DGUC-HDL.
- לאסוף את כל נפח (כ 8 -1 0 מ"ל מאגר של 1.45 כרכים מ"ל שבריר) מתוך שברים DGUC-HDL FPLC ולהתרכז באמצעות 10 kDa MW חתוכים יחידות מסנן צנטריפוגלי ב 4000 XG עבור 1 ש 'ב 4 מעלות צלזיוס או עד להתרכז HDL הוא כ 100 μL.
- אסוף את תרכיז HDL ולכמת ריכוז החלבון הכולל HDL בשיטת BCA 8.
- קבע את הריכוז הגבוה ביותר של חלבון הכולל HDL, עד 1 מ"ג, שניתן aliquoted מכל מדגם במערכה. לדוגמה, לבודד RNA מאותה כמות החלבון הכולל HDL עבור כל דגימה.
- בצע בידוד RNA באמצעותפרוטוקול שונה (ראה רשימה של חומרים).
- להוסיף 10x היקף מגיב תמוגה פנול (ראה רשימה של חומרים) מדגם ו מערבולת דקות 1.
- דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
- הוספת כלורופורם (20% של נפח מגיב תמוגה פנול המשמש בשלב 2.1.5.1) ולנער במרץ למשך 15 שניות.
- דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 - 3 דקות.
- צנטריפוגה במשך 15 דקות ב XG 12,000 ב 4 ° C בצנטריפוגה בקירור.
- מעבירים את השלב מימית העליון לצינור חדש, הימנעות הביניים.
- הוספת נפח 1.5x של אתנול 100% עד שלב המערבולת המימי דקות 1.
- חנות דגימות עבור 1 שעות לפחות או לילה ב -80 ° C.
- המשך עם פרוטוקול בידוד RNA באמצעות עמודות מיניות ספקו.
- Elute עם 30 μL של RNase ללא H 2 O. ראשית להוסיף 15 μL של H 2 O ישירות frit, ספין במהירות נמוכה (2,000 XG) במשך 2 דקות, ולאחרואז לסובב במהירות גבוהה (מקסימום) עבור 1 דקות. חזור על פעולה זו עם 15 μL נוסף של H 2 O.
- מיד להמשיך לדור או חנות הספרייה Srna ב -80 מעלות צלזיוס.
- דור הספרייה (~ 6 שעות)
- הכן ספריות cDNA Srna באמצעות פרוטוקול ערכת הספרייה הדור Srna, לפי הוראות היצרן עם שינוי אחד הגברה PCR כמפורט להלן.
- הכן את mastermix PCR על הקרח המכיל 0.5 μL DNase / RNase ללא H 2 O, 15 μL PCR מיקס (PML) ו 1 μL RNA PCR פריימר (RP1) לדגימה (כולל% נוספים 10 pipetting שגיאה).
- להוסיף 16.5 μL של PCR לערבב מדגם (cDNA).
- הקצאת מספר ברקוד מדד / מדגם עבור ריבוב ולהוסיף 1 מדד μL PCR פריימר (למספר המקביל) המדגם.
- בצע סיבוב מהיר באמצעות microfuge.
הערה: נפח בסך הכל צריךעכשיו להיות 30 μL לדגימה. - בצעו את תנאי רכיבה על אופניים הגברה PCR כמפורט בלוחות 2 ו -3.
- הכן ספריות cDNA Srna באמצעות פרוטוקול ערכת הספרייה הדור Srna, לפי הוראות היצרן עם שינוי אחד הגברה PCR כמפורט להלן.
- גודל בחר Srna הספרייה להסיר מתאם: מתאמים (~ 1.5 שעות)
- בצע גודל בחירת ספרייה באמצעות בורר גודל DNA אוטומטית לפי הוראות יצרן עם פרמטרי הגודל הבאים: יעד: 156 נ"ב, התחל: 135 נ"ב, סוף: 177 נ"ב, טווח דגל: Broad.
- DNA Clean Up (~ 0.5 שעות)
- לנקות שנבחר גודל Srna cDNA פי הוראות היצרן.
- Elute נקי ומרוכז cDNA Srna עם 2 x 7 μL DNase / RNase ללא H 2 O.
- לכמת ולהעריך Srna cDNA הספרייה היבול ואיכותו (~ 1 שעות)
- להעריך Srna cDNA הספרייה איכות וגודל באמצעות שבב DNA רגישות גבוהה על bioanalyzer (רשימת חומרים) לפי manufactההוראות של urer.
- לכמת את ריכוזי הספרייה Srna cDNA בודדים באמצעות assay DNA רגישות גבוהה (רשימת חומרים), לפי הוראות היצרן.
הערה: מומלץ לקיים את כל דגימות עם מדדים שונים שיופעל על אותו נתיב של התא זרימה במידת האפשר. אם יותר נתיב אחד נדרש, לערבב דגימות במקרה ובקר כראוי.
- תפוקה גבוהה רצף Srna (~ 7 ימים)
- פרט ברכה באינדקס ספריות Srna מבוסס על ריכוזי equimolar.
- מסך ונקווה ספריות Srna עבור איכות באמצעות שבב DNA רגישות גבוהה על bioanalyzer ולקבוע ריכוז ה- DNA ספריה כמו 2.5.1 - 2.5.2.
- בצע PCR כמותי (qPCR) של תוכן מתאם כדי להבטיח עומק רצף המתאים באמצעות ערכת כימות qPCR הספרייה הייצור כפי לפי הוראות היצרן (רשימת חומרים).
- בצע רצף באמצעות קריאה אחת, 50 בפרוטוקול עמ 'כדי להגיע לעומק של כ 20 - 25 M קורא / המדגם, לפי הוראות היצרן.
3. ניתוח נתונים (~ 1 יום)
- השתמש bcl2fastq2, בהתאם להנחיות מדריך למשתמש, לקבצים fastq גלם preprocess של דגימות demultiplexed (רשימת חומרים).
- השתמש Cutadapt לקצץ מתאמי 9 ולהסיר קורא <16 נוקלאוטידים (NTS) באורך, בהתאם להנחיות מדריך למשתמש (רשימת חומרים).
- הסר רצפים זיהום נוכח ספריות Srna, כולל רצף להפסיק פתרון (STP: CCACGTTCCCGTGG) ומתאם ה- carry-over (CTACAGTCCGACGATC) באמצעות הפונקציה removeSequenceInFastq במסגרת NGSPERL, בהתאם להנחיות מדריך למשתמש (רשימת חומרים).
- בצע מדדי בקרת איכות על ידי FastQC באמצעות מרכז למדעי כמוני (CQS) כלים, בהתאם להנחיות מדריך למשתמש (רשימת חומרים).
- צור רשימה לא מיותרת של "זהה", נכתב (redunda קריסהNT כניסות) ומספרי שיא עותק באמצעות CQSTools, בהתאם להנחיות מדריך למשתמש (רשימת חומרים).
- יישר מקריא הגנום האנושי באמצעות Bowtie1.1.2 המאפשר 1 התאמה (אפשרויות: -a -m 100 --best --strata -v 1), בהתאם להנחיות מדריך למשתמש (רשימת חומרים).
- בצע לקרוא יישור, ספירה, ולגרום משימות סיכום באמצעות NGSPERL, לפי ההוראות במדריך למשתמש.
- המרת שולחן ספירה לייצא לקובץ גיליון אלקטרוני.
- לנרמל קורא של למחלקה מסוימת (למשל, miRNAs) למספר הכולל של קורא לשיעור כי (למשל, המספר הכולל של miRNAs כניסות) ואותות הדו"ח כפי קורא Per ממופים מירנה (RPMM). (למשל, RPMM = (Mir-X / # סך של מירנה כניסות) * 1,000,000).
- קלט מנורמל ספירת שולחן כמו טכנולוגיית צבע אחד הגנרית לתוך תוכנה עבור ברמה נמוכה הפרש ברמה גבוהה מנתח לפי הוראות במדריך למשתמש (רשימת חומרים).
הערה: נכון לעכשיו, אין היטב מאופיין גני משק / sRNבאשר HDL-Srna. פקד ספייק-in ניתן להשתמש, אבל יכול להיות בעייתי. נרמול כדי HDL קלט החלבון הכולל או נפח מומלץ. והכי חשוב, זה מומלץ לאמת תוצאות רצף אחד של אסטרטגיות שונות כדי לכמת miRNAs ו sRNAs באמצעות PCR בזמן אמת או PCR כמותי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זוהי סדרה של שיטות הוקמה מקושר יחד כדי לאפשר כימות של sRNAs על HDL טהור מאוד על ידי רצף תפוקה גבוהה או בזמן אמת PCR (איור 1). כדי להוכיח את ההיתכנות וההשפעה של פרוטוקול זה, HDL היה מטוהרים מפלסמה אנושית בשיטת טנדם DGUC ו FPLC. מקטעים שנאספים FPLC המתאים HDL (על ידי חלוקת כולסטרול) רוכזו ו- RNA הכולל היה מבודד 1 מ"ג של HDL (חלבון כולל). ספריות Srna נוצרו עם HDL שנאסף n = 4 בבני אדם בריאים. כל דגימות והדם / פלזמה נאספו תחת פרוטוקול פעיל מוסדי מועצה לביקורת (# 070,416), ונושאי אדם לומדים עם הסכמה מדעת, כפי שאושרו על ידי האוניברסיטה ונדרבילט לרפואה. ספריות Srna הוכנו היו רצף ב טכנולוגיות ונדרבילט עבור Genomics המתקדם (VANTAGE) ניתוחי מרכז רצפי DNA ונתונים בוצעובאמצעות צינורות ללא צורך במיקור חוץ. תצוגות נתונים שנוצרו על ידי גרפי תוכנה.
הצורך הקריטי לבצע שיטה שנייה (FPLC) לבידוד HDL לאחר DGUC נובע אפשרית שיתוף טיהור של EVS. מכוניות חשמליות הם מחלקה כללית של שלפוחית הנגזרות הממברנה כי מקורן בגופים multivesicular (exosomes), קרום הפלזמה ניצני (microvesicles), ותהליכים אחרים, לרבות גופים אפופטוטיים 10. כלי רכב חשמליים, כלומר exosomes, דווחו יש צפיפות דומה כמו HDL הקטן (איור 2 א), ובכך, יכולים להיות נוכח שבר צפיפות HDL (1.063-1.21 g / מיליליטר) לאחר DGUC 11,12. כדי להסיר כלי רכב חשמליים ו ליפופרוטאינים אחרים (למשל, LDL), מ DGUC-HDL, FPLC שימש HDL נפרד מן שלפוחית וחלקיקים אחרים לפי גודל; HDL (7 - 12 ננומטר בקוטר) ו כלי רכב חשמליים (40 - 220 ננומטר בקוטר) הם מופרדים בקלות בשל הבדלי הגודל שלהם (איור 2 א ', ב'). חלק HDLהים היה ברור ממבט הראשון בשל חלוקת הכולסטרול, DGUC-HDL FPLC שברים היו נקוו ומרוכז באמצעות 10 kDa חתוכים מסננים צנטריפוגה. המרוכז HDL נאסף והשתמש לניתוח RNA במורד זרם (איור 2 ב). כדי להמחיש את הנקודה הזו, פלזמה מראש DGUC היה מופרד באמצעות FPLC וחלוקת פוספוליפידים (phosphatidylcholine, PC); כולסטרול כללי (TC), ורמות חלבון כומתו זממו ברחבי שברים. PC, TC, וחלבוני רמות כומתו באמצעות שלוש ערכות colorimetric. כל שלושה הפרמטרים שהוגדרו שברי HDL בבירור (19 - 24) ושברי VLDL / LDL (14 - 18). בפלזמה FPLC-מופרד, אותות חלבון והשומן אותרו מינימאליים או לא זוהו כלל שברים מתאימים שלפוחית גדלה יותר מ VLDL (שנשארה קופסא כתומה) (איור 3 א). כדי להדגים הפרדת DGUC של HDL, DGUC-HDL היה מופרד גם על ידי FPLC ו- PC, TC, ורמות חלבונים היו quantifIED (איור 3 ב). שרטוט ערכים אלה ממחיש את שיתוף חלוקה של כמות קטנה של LDL באמצעות DGUC ומחזק את הצורך להשתמש טנדם הגישה DGUC-FPLC לבודד HDL טהור מאוד. למרות מכוניות חשמליות הם חזו לשתף fractionate עם HDL במהלך DGUC חל מעט במעלה נמצא השומנים והחלבונים שברים המתאימים שלפוחית גדלה יותר מ LDL (איור 3 ב). שומני EV וחתימת חלבון בטווח גודל החזה הוא גם מינימאלי לזיהוי או נעדר DGUC-VLDL ו DGUC-LDL כאשר יחלקו FPLC (מידע לא מוצג). לניתוח RNA, RNA הכולל היה מבודד 1 מ"ג של HDL מטוהרים במקביל לייצור הספרייה Srna. בקצרה, מתאמים היו ligated ל 3 'ולאחר מכן 5' קצוות הטרמינל של sRNAs, כולל miRNAs ו tDRs (איור 4 א). מוצרים ligated תומללו הפוך (RT) ו- PCR מוגבר באמצעות פריימרים PCR מחסה אינדקסים ספציפיים המיועדים דגימות ריבוב במהלך דאותגובות רצף nstream (איור 4 א). כל מתאם הוא 61 nts באורך; אם כן, ligated מירנה (כ 22 nts אורך) יפיק תוצר של 144 nts באורך. SRNAs הלא מירנה הרב מעט יותר miRNAs (למשל, 30 - 35 nts אורך). ככזה, האורך של מוצר במיקוד שלנו היה 156 bps באורך. מוצרים מוגברים היו שנבחר גודל באמצעות בורר גודל DNA אוטומטית וכל מוצרי cDNA 135 - 177 bps באורך נאספו (איור 4 א). האיכויות של ספריות גודל שנבחרו הוערכו על ידי שבבי דנ"א רגישות גבוהה באמצעות bioanalyzer (איור 4B). Srna cDNA ספריות בגודל זה הופיע מעט גדול בגודל בשל אפשרי "מבעבע" תופעות במהלך הניתוח. עבור סידור מרובב, ריכוזים equimolar של ספריות cDNA היו נקווה, ניקה, מרוכז, reanalyzed באמצעות bioanalyzer (איור 4B). המדגם מרובב היה אז sequenCED באמצעות פרוטוקול נ"ב יחיד לקרוא 50. ללא צורך במיקור חוץ צינורות ניתוח הנתונים שמשו demultiplex דגימות מבוססות על אינדקסים, לקצץ מתאמים, מדדי בקרת איכות לרוץ, ליישר את הגנום האנושי ולספור sRNAs המבואר. חלוקת מנורמל קורא (קורא למיליון, סל"ד),> 16 nts אורך, להמחיש את העשרת sRNAs 20 - 22 nts באורך ו -34 - 35 nts באורך על HDL (איור 4C).
יישור וניתוח לספור של ארבע ספריות HDL-Srna מצא כי 38% של קורא יישור לאזורים המבואר של הגנום האנושי היו miRNAs (איור 5 א). לא פחות בשפע (37%) היו sRNAs-נגזר tRNAs (tDRs). sRNAs-נגזר RNAs השונה (למשל, Y RNAs), rRNAs, smRNAs, snoRNAs, ו RNAs ללא קידוד הארוך (lincRNAs) נכח גם על HDL (איור 5 א). לאחר נורמליזציה למספר הכולל של קורא לכל קבוצה, 50 העליון ביותר miR בשפעNAS (קורא Per ממופה מירנה, RPMM, איור 5), tDRs (קורא Per ממופה tDRs, RPMT, איור 5 ג), ו-TDR הלא sRNAs הלא מירנה האחרת (קורא Per ממופה Srna, RPM, איור 5D) אורגנו על ידי heatmaps . נתונים אלה ממחישים את הדמיון (למשל, HDL-miRNAs) והבדלים (למשל, tDRs) של HDL-sRNAs הנפוץ ביותר על פני אנשים בריאים (איור 5 ב-ד). תוצאות אלו מראות את העצמה של אסטרטגיה זו ופרוטוקול לספק תובנות מדהימים לתוך להובלת sRNAs ידי HDL. אף על פי כן, רצף Srna אין להסתמך על כדי לכמת מוחלט. sRNAs עניין צריך להיות מאומת על ידי PCR בזמן אמת. כמו כן, חוקרים רבים עשויים לדרוש רק את כימות של miRNAs פרט על HDL. ככזה, הכולל HDL RNA היה מבודד מכל נושא כימות יחסית של HDL-miRNAs באמצעות בזמן אמת PCR. חמישה miRNAs שופע יותר זוהה על HDL ידי sRNAseq שימשו Real-פעמית מבחני PCR כדי לקבוע רמות שלהם על כל דגימה HDL (איור 5E). הערכים הכמותיים ביחס חושבו באמצעות משק שרירותי CT של 32 (RQV = 2 - ΔCtArb) מנורמל 1,000 מיקרוגרם של קלט חלבון HDL לתוך בידוד RNA 13. תוצאות מהמחקר בזמן אמת PCR להוכיח כי פרוטוקול זה הוא גם יקר באיתור HDL-miRNAs וכימות ההבדלים על פני יחידים. באופן קולקטיבי, השרטוטים שהוצגו להגדיר את הפרטים הקריטיים של השיטות, והתוצאות משתי רצף תפוקה גבוהה בזמן אמת גישות PCR לייצג את התוצרים של פרוטוקול זה.
איור 1. נציגי זרימת תרשים של הפרוטוקול. HDL טהור מבודד ultracentrifugation שיפוע צפיפות chromatog מהר חלבון נוזלי רפים. סה"כ HDL RNA יכול להיות מנוצל אז עבור RNA הקטן (Srna) רצף. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
בידוד איור 2. של HDL. (א) תרשים של הצפיפות בקוטר של ליפופרוטאינים ועל שלפוחית תאית (EV). (ב) סכמטי של בידוד HDL טנדם הרציף, כולל הפרדת פלזמה, ultracentrifugation שיפוע צפיפות (DGUC), מהר-חלבון כרומטוגרפיה נוזלית (FPLC), סינון, וריכוז. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
pload / 54488 / 54488fig3.jpg "/>
איור 3. כרומטוגרפיה נוזלית מהיר-חלבון (FPLC) הפרדה ליפופרוטאינים EV, שלפוחית תאית.; VLDL, ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מאוד; LDL, ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה; HDL, בצפיפות גבוהה ליפופרוטאינים; FP, חלבון חופשי; PC, phosphatidylcholine; ו TC, כולסטרול כללי. קו אדום, TC; קו כחול, חלבון, וקו שחור, PC. הפרדת ליפופרוטאינים מ- (A) מפלסמה אנושית לפני ultracentrifugation צפיפות שיפוע (DGUC) ו- (ב) חלק HDL לאחר DGUC. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
דור איור 4. RNA קטנים הספריות. (א) סכמטי של RNA הקטן (Srna) ג ספרייהonstruction וגדל-בחירה. מירנה, microRNA; TDR, tRNA הנגזרות sRNAs; Srna, הלא מירנה שאינם TDR sRNAs; RT, שעתוק לאחור; נ"ב, זוג בסיס; ו cDNA, משובטים DNA. (ב) ניתוח של ספריות HDL-Srna לפני ואחרי ריבוב באמצעות שבבים DNA רגישות גבוהה bioanalyzer. (C) חלוקת אורך של HDL-Srna קורא לאחר רצף. סל"ד, קורא למיליון; M, בו נבדקים ממין זכר; F, נושאים נקבה; ו NT, נוקליאוטידים. N = 4. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
גיוון איור 5. של HDL-sRNAs. (א) חלוקת HDL-sRNAs בסוגי Srna. שבר של קורא מיושר sRNAs המבואר בגנום האנושי. (BD) heatmaps N = 4 דגימות HDL-Srna.
| 1. אנטי-אוקסידנטים להפרדת Lipoprotein | בצע פתרון המניה ב 100x |
| EDTA | חומצת Ethylenediaminetetraacetic (0.5 M מלאי) |
| AZT | 3-אמינו-1,2,4-triazole: 42 מ"ג / מ"ל H 2 O |
| BHT | Butylated Hydroxytoluene: 25 מ"ג / 100 μL EtOH |
| TROLOX | (+) - 6-הידרוקסי-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-קרבוקסיליות חומצה: 41.7 מ"ג / 500 μL EtOH |
| 2. פתרונות כיסוי | |
| פתרון # 1 | 1.019 גרם / מ"ל H 2 O |
| פתרון # 2 | 1.025 גרם / מ"ל KBR / H 2 O |
| פתרון # 3 | 1.063 גרם / מ"ל KBR / H 2 O |
| פתרון # 4 | 1.080 גרם / מ"ל KBR / H 2 O |
| פתרון # 5 | 1.255 גרם / מ"ל KBR / H 2 O |
| 3. הצפת FPLC | </ Tr> |
| 1 מתכון L | 50 מ"ל 3M NaCl; 20 מ"ל 0.5 Tris-HCl, pH 7.6; 2 מ"ל של 10% נתרן אזיד; 930 מ"ל H 2 O |
טבלת 1. ריאגנטים מיוחדים.
| שלב | Temp (° C) | זְמַן | מחזורים |
| א | 98 | 30 s | 1 |
| B | 98 | 10 שניות | 25 |
| 60 | 30 s | ||
| 72 | 15 שניות | ||
| C | 72 | 10 דק ' | 1 |
טבלה 2.צעדי הגברת דור ספרייה.
| תֶחֶל | סדר פעולות |
| פריימר 1.1 | AATGATACGGCGACCACCGAGAT |
| פריימר 2.1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGA |
Primers לוח 3. PCR.
| שלב | Temp (° C) | זְמַן | מחזורים |
| א | 95 | 10 דק ' | 1 |
| B | 95 | 10 שניות | 40 |
| 60 |
לוח 4. צעדי הגברת כימות הספרייה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה נועד לכמת miRNAs ו sRNAs אחרים על ידי רצף תפוקה גבוהה או בזמן אמת PCR על HDL טהור מאוד. כמו בכל גישה, שיקולים מיוחדים יש לתת לכל שלב בתהליך של HDL מטהר RNA ואז לכימות sRNAs. פרוטוקול זה מיועד פרויקטים החל ≥ 2 מ"ל של הפלזמה. אף על פי כן, ניתוחי RNA באיכות גבוהה ניתן להשלים בהצלחה עם HDL מטוהר מ קטן כמו 80 μL של מפלזמה אנושית או עכבר באמצעות כרומטוגרפיה זיקה; עם זאת, כרכי פלזמת מוצא גדולים לייצר נתונים טובים יותר באמצעות השיטות שהוצגו כאן. שיטות עיבוד והפקה לדוגמא יכולה דרסטי לשנות מירנה / Srna איכות ואת תשואה. שימוש תרופות נגד קרישת הדם, בעוד חיוני לאיסוף פלזמה, הנראה ישפיע על חילוץ במורד זרם. לדוגמה, הפרין לא יוסר בקלות במהלך החילוץ RNA 14,15, והוא יכול לעכב אנזימים במורד מנוצל PCR 16-18. בנוסף, הere דיווחים כי נתרן ציטרט יכול גם להפריע מדידות qPCR שבו miRNAs ממדגמים EDTA מוצגים השתפרו פרופיל הביטוי לעומת דגימות נתרן ציטרט 16,19,20. מחקרים אלה ממחישים את הצורך שיקול דעת בעת בחירת נוגד קרישה. יתר על כן, בשל פוטנציאל מוגבר תמוגה התא במהלך קרישה, דגימות סרום אינם מומלצים כמו miRNAs הסלולר lysed עשויים לשייך באופן מלאכותי עם ליפופרוטאינים. כמו כן, פלזמה אידיאלי מבודדת מיד כולו דם כדי למנוע זיהום מתאי דם היקפיים אחרים, כולל לויקוציטים lysed. כמו טמפרטורה קרה ידועה להשפיע הפעלה טסיות, דגימות דם כולו הם הסתחררו הרחק אריתרוציטים, לויקוציטים וטסיות ב 3000 XG במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר. המוליזה גם מומלצת חולה כמו אריתרוציטים מקרע דווחו גם כדי להשפיע על תוצאות מירנה 21,22, כפי שהם מכילים miRNAs שעשוי להישפך במהלך hemolיסיס 23,24. פלזמה אז יכולה להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 - 4 שבועות או לחלופין פלזמה עשויה להיות קפוא ב -80 ° C שבו תוכן מירנה הוא יציבה ובת קיימא הוא בטווח קצר והן בטווח אחסון לטווח ארוך (מקסימום 4 שנים) 25. למיטב הנוכחי שלנו, הקפאת דגימות פלזמה לא נחזה לפגוע HDL-miRNAs דגימות פלזמה מוקפאות מתאימות לניתוח. כפי ליפופרוטאינים ורכיבי דם כולו אחרים יכולים להיות מושפעים על ידי צריכת מזון, איסוף דם בצום הוא מועדף.
כאמור, HDL בפלזמה ניתן לבודד באמצעות מספר שיטות סטנדרטיות, כולל DGUC, FPLC, ו כרומטוגרפיה זיקה נגד apoA-לי. . בידוד של ליפופרוטאינים פלזמה ידי DGUC באמצעות KBR, כפי שתואר על ידי Redgraves ואח 26, מפריד VLDL (ד = 0.94 - 1,006 גר '/ מ"ל), LDL (ד = 1,006 - 1,063 גרם / מ"ל) וה- HDL (ד = 1.063-1.21 g / מיליליטר) ומהווה שיטה אידיאלית עבור כמויות גדולות של פלזמה (2 - 60 מיליליטר לדגימה). המגבלהבאמצעות גישה זו לבדה היא exosomes ו מירנה אחרת המכילה כלי רכב חשמליים מדווחות יש צפיפות דומה HDL ועלולים להיות נוכח HDL DGUC (איור 2 א). חסרונות נוספים כוללים ניזק מבנים ניתן חלבונים כתוצאה מחשיפת מלח גבוהה מאגרים וכוחות ultracentrifugation חזקים כמו גם יציבות הפרש של תת-מחלקות HDL 27,28. למרות זאת, DGUC הוא נפוץ כמו התוצאה היא תשואה גבוהה של חלבון ה- HDL, ייצור קרוב ל -1 מ"ג של חלבון HDL לכל 1 מ"ל של פלזמה 29. הגישה FPLC, הכוללת סינון ג'ל בגודל הדרה, דורש פחות זמן, תלוי בקצב זרימה (כ 6 שעות), ויש לו דיוק רב יותר להפריד HDL מן ליפופרוטאין המכיל apoB (לפי גודל) ותת-בכיתותיהם, כולל כלי רכב חשמליים כי הם הרבה יותר גדולים מאשר HDL אבל יש צפיפויות דומות. יצוין כי שימוש בשיטות שפורטו בפרוטוקול זה, שלפוחית פלזמה בין כ 220 - 75 ננומטר בקוטר לאלעורר חתימת שומנים או חלבון שניתן לזיהוי כאשר מופרדות FPLC. בהתאם ההגדרה, FPLC דורש קלט קטן יחסית, 0.3 - 1 מיליליטר, אשר הוא שימושי עבור פלזמה מכרסמת aliquots הקפוא הקטן. מבחני כולסטרול colorimetric מהירים חשובים אף הם באים FPLC לאשר חלוקת HDL או שברים ליפופרוטאין אחרים. חלוקה מדללת דגימות ליפופרוטאינים; עם זאת, דגימות אז יכולות להיות מרוכזות באמצעות מסנני גודל צנטריפוגלי סטנדרטיים (למשל, 10 kDa MW חתוכים מסנן). בידוד HDL ידי apoA-I IP באמצעות עמודות מיקרו-ספין הם המהירה של שלוש גישות, אבל הם מוגבלים על ידי קלט נמוך (0.08 - 1 μL) נפח תשואה נמוכה (כ 0.1 מ"ג). בעוד apoA-I IP יכול להיות מייגע, שיטה זו היא אידיאלית עבור supernatants תרבית תאים בנפח נמוך. בעוד כל אחת משיטות אלו יש את נקודות החוזק והחולשה, ניתן להפחית אלה אם נעשה שימוש טנדם (למשל, DGUC ואחריו FPLC). שימוש בשתי גישות במקבילות, תוצאות בטהרה גדולה יותר שלHDL לניתוח מירנה Srna.
כאן, אנו פירט את הצעדים הנדרשים כדי לבודד HDL טהור מאוד בשיטת טנדם של DGUC ואחריו FPLC והתווה את הצעדים המשמשים לכמת HDL-miRNAs ו sRNAs או באמצעות רצף תפוקה גבוהה או בזמן אמת PCR. למרות בפרוטוקול זה תוכנן עבור HDL, יש לו תחולה גדולה בכימות sRNAs על ליפופרוטאינים אחרים, כולל LDL ו- VLDL, מבוסס על הצפיפויות והגדלים שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3x FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45 µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
References
- Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Haussecker, D., et al. Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing. RNA. 16, 673-695 (2010).
- Li, Z., et al. Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs. Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).
- Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).
- Maute, R. L., et al. tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).
- Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences. Source Code Biol Med. 9, 8 (2014).
- Vickers, K. C., Remaley, A. T. Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication. Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).
- Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods. Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).
- Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion. Nat Commun. 6, 7164 (2015).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens. Biotechniques. 23, (1997).
- Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).
- Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis. J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).
- Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).
- Bai, X., et al. Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients. J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).
- McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume. Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circ Res. 107, 677-684 (2010).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, e24145 (2011).
- Kannan, M., Atreya, C. Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs. Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).
- Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS One. 3, e2360 (2008).
- Balzano, F., et al. miRNA Stability in Frozen Plasma Samples. Molecules. 20, 19030-19040 (2015).
- Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
- Cheung, M. C., Wolf, A. C. Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations. J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).
- Kunitake, S. T., Kane, J. P. Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge. J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).
- Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. J Extracell Vesicles. 4, 26533 (2015).
