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Biochemistry

गैर-कोडिंग लघु शाही सेना मात्रा के लिए उच्च घनत्व लिपो प्रोटीन का अलगाव

Published: November 28, 2016 doi: 10.3791/54488
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 3, 1,2
1Department of Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Center for Quantitative Sciences, Vanderbilt University School of Medicine, 3Department of Cancer Biology, Vanderbilt University School of Medicine
* These authors contributed equally

Abstract

छोटे गैर-कोडिंग RNAs की विविधता (sRNA) तेजी से विस्तार हो रहा है और जीन विनियमन सहित जैविक प्रक्रियाओं में उनकी भूमिकाओं में उभर रहे हैं। सबसे दिलचस्प है, sRNAs भी कोशिकाओं के बाहर पाया और स्थिरतापूर्वक सभी जैविक तरल पदार्थ में मौजूद हैं। जैसे, बाह्य sRNAs रोग बायोमार्कर के एक उपन्यास वर्ग का प्रतिनिधित्व करते हैं और संभावना सेल संकेतन और कहनेवाला संचार नेटवर्क में शामिल कर रहे हैं। बायोमार्कर के रूप में उनकी क्षमता का आकलन करने के लिए, sRNAs प्लाज्मा, मूत्र, और अन्य तरल पदार्थ में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। फिर भी, पूरी तरह से अंत: स्रावी संकेतों के रूप में बाह्य sRNAs के प्रभाव को समझने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि कौन कौन से वाहक परिवहन और उन्हें जैविक तरल पदार्थ (जैसे, प्लाज्मा) है, जो कोशिकाओं और ऊतकों बाह्य sRNA पूल के लिए योगदान में रक्षा कर रहे हैं, और कोशिकाओं और ऊतकों में सक्षम है के स्वीकार करने और बाह्य sRNA का उपयोग। इन लक्ष्यों को पूरा करने के लिए, यह बाह्य वाहकों के अत्यधिक शुद्ध आबादी को अलग करने के लिए महत्वपूर्ण हैsRNA रूपरेखा और मात्रा का ठहराव के लिए। हम पहले से दिखा दिया है कि लिपो प्रोटीन, विशेष रूप से उच्च घनत्व लिपो प्रोटीन (एचडीएल), कोशिकाओं और एचडीएल miRNAs के बीच कार्यात्मक microRNAs (miRNA) काफी रोग में बदल रहे हैं परिवहन। यहाँ, हम विस्तार एक नए प्रोटोकॉल है कि घनत्व ढाल ultracentrifugation (DGUC) और तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (FPLC) के साथ मिलकर एचडीएल अलगाव का इस्तेमाल अत्यधिक शुद्ध एचडीएल नीचे की ओर रूपरेखा और miRNAs सहित सभी sRNAs, की मात्रा का ठहराव के लिए प्राप्त करने के लिए, दोनों उच्च का उपयोग कर -throughput अनुक्रमण और वास्तविक समय पीसीआर दृष्टिकोण। इस प्रोटोकॉल एचडीएल पर sRNAs की जांच के लिए एक मूल्यवान संसाधन हो जाएगा।

Introduction

कोशिकी गैर-कोडिंग छोटे RNAs (sRNAs) रोग बायोमार्कर और संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों का एक नया वर्ग का प्रतिनिधित्व करते हैं और संभावना सेल करने वाली कोशिका संचार 1 की सुविधा। SRNA का सबसे व्यापक रूप से अध्ययन प्रकार microRNAs (miRNA) जो लंबाई में लगभग 22 एनटीएस हैं और लंबे समय तक अग्रदूत रूपों और प्राथमिक टेप 2 से कार्रवाई कर रहे हैं कर रहे हैं। miRNAs पोस्ट-transcriptionally प्रोटीन अनुवाद और mRNA गिरावट 2 की प्रेरण के दमन के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए प्रदर्शन किया गया है। फिर भी, miRNAs सिर्फ sRNAs के कई प्रकार के होते हैं; के रूप में sRNAs माता पिता tRNAs (tRNA व्युत्पन्न sRNAs, टीडीआर), छोटे परमाणु आरएनए (sRNA व्युत्पन्न sRNAs, sndRNA), छोटे nucleolar आरएनए (snoRNA व्युत्पन्न sRNAs, snRNA), ribosomal RNAs से चिपके रहते जा सकता है (rRNA व्युत्पन्न sRNAs, आरडीआर ), वाई आरएनए (yDR), और अन्य विविध RNAs 1। इन उपन्यास sRNAs के कुछ उदाहरण miRNAs के समान कार्य करने के लिए सूचित किया गया है; हालांकि, जैविक फूइन sRNAs से कई की nctions, निर्धारित किया जाना बना रहता है, हालांकि जीन विनियमन में भूमिका होने की संभावना 3-6 कर रहे हैं। सबसे दिलचस्प है, miRNAs और अन्य sRNAs लार, प्लाज्मा, मूत्र, और पित्त सहित बाह्य तरल पदार्थ, में स्थिरतापूर्वक मौजूद हैं। कोशिकी sRNAs संभावना बाह्य पुटिकाओं (ईवी), लिपो प्रोटीन, और / या बाह्य ribonucleoprotein परिसरों के साथ अपने सहयोग के माध्यम से RNases से सुरक्षित हैं।

इससे पहले, हम उस लिपो प्रोटीन, अर्थात् उच्च घनत्व लिपो प्रोटीन (एचडीएल), प्लाज्मा 7 में परिवहन miRNAs की सूचना दी। इस अध्ययन में, एचडीएल घनत्व ढाल ultracentrifugation के एक अनुक्रमिक विधि (DGUC), तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी जेल निस्पंदन, FPLC), और आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (विरोधी apolipoprotein ऐ (apoA I) immunoprecipitation का उपयोग कर अलग कर रहे थे ) 7। दोनों वास्तविक समय पीसीआर आधारित कम घनत्व सरणियों और व्यक्तिगत miRNA assays का उपयोग करना, miRNA के स्तर पर एचडीएल मात्रा निर्धारित किया गया चंगा से अलगतेरा और hypercholesterolemic विषयों 7। इस दृष्टिकोण का प्रयोग, हम miRNAs प्रोफ़ाइल और अत्यधिक शुद्ध एचडीएल तैयारी में विशिष्ट miRNAs यों करने में सक्षम थे। 2011 के बाद से, हमने पाया कि हालांकि आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी एचडीएल पवित्रता को बढ़ाता है, एंटीबॉडी संतृप्ति बहुत उपज को सीमित करता है, और लागत निषेधात्मक जा सकता है। वर्तमान में, हमारे प्रोटोकॉल DGUC की एक दो कदम अनुक्रमिक मिलकर विधि FPLC है, जो भी डाउन स्ट्रीम शाही सेना अलगाव और sRNA मात्रा का ठहराव के लिए उच्च गुणवत्ता एचडीएल नमूने पैदा करता है के द्वारा पीछा सिफारिश की। SRNAs (sRNAseq), उदाहरण के लिए, miRNAs की उच्च throughput अनुक्रमण, और अन्य गैर miRNA sRNA कक्षाओं की वृद्धि की जागरूकता में हाल के अग्रिमों के कारण, sRNAseq है वर्तमान राज्य के अत्याधुनिक miRNA और sRNA रूपरेखा में। जैसे, हमारे प्रोटोकॉल बढ़ाता miRNAs और sRNAseq का उपयोग कर एचडीएल नमूनों पर अन्य sRNAs की सिफारिश की। बहरहाल, कुल शाही सेना एचडीएल से अलग भी व्यक्ति miRNAs और अन्य sRNAs यों या वास्तविक समय पीसीआर एक का उपयोग कर sRNAseq परिणाम को मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताpproaches। यहाँ हम विस्तार से संग्रह, शुद्धि, मात्रा का ठहराव, डेटा विश्लेषण, और अत्यधिक शुद्ध एचडीएल sRNAs के सत्यापन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है।

इस पत्र के समग्र लक्ष्य मानव प्लाज्मा से अलग अत्यधिक शुद्ध एचडीएल में व्यवहार्यता और sRNA मात्रा का ठहराव करने की प्रक्रिया का प्रदर्शन है।

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Protocol

1. एचडीएल शोधन (~ 5.5 दिन)

  1. घनत्व ढाल ultracentrifugation (DGUC, ~ 5 दिन)
    1. 100x विरोधी oxidants के 90 μL प्लाज्मा के 9 एमएल ताजा शिरापरक रक्त से अलग करने के लिए जोड़ें।
    2. चरण 1.1.1 (0.0278 जी / एमएल KBR प्लाज्मा) से प्लाज्मा के 9 मिलीलीटर 0.251 जी KBR जोड़कर 1.025 g / एमएल के लिए 1.006 ग्राम / मिलीलीटर से KBR के साथ प्लाज्मा घनत्व को समायोजित करें। प्लाज्मा रॉक जब तक सभी नमक कमरे के तापमान पर भंग कर दिया और ट्यूबों ultracentrifuge और सभी बुलबुले शीर्ष करने के लिए वृद्धि सुनिश्चित करने के हस्तांतरण है।
    3. बेंड नोक से 90 डिग्री 1 सेमी करने के लिए एक 18-जी सुई की नोक, बेवल ऊपर की ओर का सामना करना पड़। एक सिरिंज और 18 गेज सुई का प्रयोग, ध्यान प्लाज्मा (तालिका 1) से अधिक की ओवरले # 1 समाधान 3 एमएल जगह है।
      नोट: तुला सुई सभी वीएलडीएल / आईडीएल, एलडीएल सुनिश्चित करता है, और एचडीएल ओवरले के साथ मिश्रण के बिना हटा रहे हैं।
    4. ट्यूब और carefu के शीर्ष करने के meniscus से 3 मिमी अंतरिक्ष - शीर्ष पर बुलबुले का बहुमत है, 2 छोड़ने हटायेlly दप-40Ti बाल्टी में ट्यूबों की जगह।
    5. संतुलन पर (टोपी के साथ) प्रत्येक बाल्टी वजन, और बिल्कुल विपरीत बाल्टी (बाल्टी + कैप) के साथ संतुलन: # 5, # 3 करने के लिए # से 6 # 4, # 2 के लिए # 1।
      नोट: ये बाल्टी संतुलित और सभी समय पर मिलान किया जाना चाहिए।
    6. (सामग्री की सूची) ultracentrifuge में रोटर रखें। एक # 4 मध्यवर्ती ब्रेक के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 274,400 XG पर अपकेंद्रित्र।
    7. ध्यान से बाल्टी से रोटर से बाल्टी और ट्यूबों को हटा दें।
    8. ध्यान से ओवरले एक सिरिंज और तुला सुई का उपयोग कर के शीर्ष स्तर से 2 एमएल हटा दें। इस वीएलडीएल / आईडीएल अंश जो 4 पर संग्रहित किया जा सकता है किया जाएगा डिग्री सेल्सियस या -80 सी।
    9. वीएलडीएल / आईडीएल अंश हटाने के बाद, नमूना (प्लाज्मा) की शेष 7 एमएल इकट्ठा करने और एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में जगह। नमूने की मात्रा के साथ ओवरले # समाधान 2 (1 टेबल) 9 एमएल अप करने के लिए ले आओ।
    10. 1.080 ग्राम के लिए 1.025 ग्राम / मिलीलीटर से नमूना घनत्व को समायोजित / KBR साथ एमएल का उपयोग9 एमएल नमूना या 0.0828 ग्राम में लगभग 0.746 जी KBR / नमूना एमएल KBR। धीरे नमूना रॉक जब तक सभी KBR (लगभग 20 मिनट) को भंग कर दिया और ट्यूब ultracentrifuge करने के लिए, जबकि यह सुनिश्चित बुलबुले शीर्ष करने के लिए वृद्धि हस्तांतरण है।
    11. सिरिंज और सुई के साथ, ध्यान से नमूना (तालिका 1) से अधिक की ओवरले # 3 समाधान 3 एमएल जगह है। ट्यूब के शीर्ष करने के लिए meniscus से 3 मिमी अंतरिक्ष - 2 छोड़ दें।
    12. ट्यूब के शीर्ष पर किसी भी शेष बुलबुले के बहुमत निकालें और ध्यान दप-40Ti बाल्टी में भरा ultracentrifuge ट्यूबों की जगह।
    13. संतुलन पर (टोपी के साथ) प्रत्येक बाल्टी वजन, और वास्तव में, विपरीत बाल्टी + टोपी के साथ संतुलन 1.1.5 के रूप में।
    14. ultracentrifuge में रोटर की जगह (सामग्री की सूची देखें)। एक # 4 मध्यवर्ती ब्रेक के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 274,400 XG पर अपकेंद्रित्र।
    15. ध्यान से बाल्टी से रोटर से बाल्टी और ट्यूबों को हटा दें।
    16. ध्यान से एक सिरिंज का उपयोग ओवरले के ऊपर परत से 2 एमएल हटाने और होNT सुई। यह एलडीएल अंश जो 4 पर संग्रहित किया जा सकता है किया जाएगा डिग्री सेल्सियस या -80 सी।
    17. एलडीएल अंश हटाने के बाद, नमूना (प्लाज्मा) की शेष लगभग 7 एमएल इकट्ठा करने और एक नया 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में जगह। 1.080 ग्राम / मिलीलीटर समाधान # 4 (1 टेबल) के साथ 9 एमएल नमूना (प्लाज्मा) की मात्रा लाओ।
    18. 1.30 छ 1.080 ग्राम / मिलीलीटर से नमूना घनत्व को समायोजित / KBR नमूना के प्रत्येक एमएल के लिए 9 एमएल नमूना (प्लाज्मा) में 3.33 जी KBR का उपयोग कर या 0.37 छ KBR साथ एमएल। रॉक या थोड़ा नमूना आंदोलन जब तक सभी KBR (नमक) भंग कर रहा है और ट्यूब ultracentrifuge के लिए स्थानांतरण।
    19. सिरिंज और सुई के साथ, ध्यान से नमूना (तालिका 1) से अधिक की ओवरले समाधान # 5 3 एमएल जगह है।
    20. ट्यूब के शीर्ष पर किसी भी शेष बुलबुले के बहुमत निकालें, ट्यूब के शीर्ष करने के लिए meniscus से 2- 3 मिमी जगह छोड़ने और ध्यान से दप-40Ti बाल्टी में भरा ultracentrifuge ट्यूबों की जगह।
    21. प्रत्येक बाल्टी वजन (संतुलन पर टोपी), और बिल्कुल विपरीत साथ बाल्टी + टोपी के साथ संतुलन, 1.1.5 के रूप में।
    22. ultracentrifuge में रोटर की जगह (सामग्री की सूची देखें)। एक # 4 ब्रेक के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए 274,400 XG पर अपकेंद्रित्र।
    23. ध्यान से बाल्टी से रोटर से बाल्टी और ट्यूबों को हटा दें।
    24. ध्यान से ओवरले एक सिरिंज और तुला सुई का उपयोग कर के शीर्ष स्तर से लगभग 2 एमएल हटा दें। इस एचडीएल अंश है, जो 4 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
      नोट: DGUC एचडीएल के बाद उच्च नमक समाधान दूर करने के लिए dialyzed जा सकता है।
    25. dialyze करने के लिए, एक मोहरबंद डायलिसिस आस्तीन (10,000 मेगावाट कट ऑफ) में एकत्र एचडीएल अंश जगह और 1 एल 1x पीबीएस में रात भर dialyze। डायलिसिस बदलें बफर (1x पीबीएस) 24 घंटे से अधिक 3 बार। एक चुंबकीय हलचल-पट्टी के साथ पीबीएस के कोमल गड़बड़ी डायलिसिस में सुधार होगा।
    26. DGUC-एचडीएल के प्रोटीन एकाग्रता एक बीसीए विधि 8 का उपयोग निर्धारित करते हैं।
  2. फास्ट प्रोटीन तरल Chromatography (FPLC) या आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (~ 6 घंटे)
    1. एक 0.22 माइक्रोन सूक्ष्म केन्द्रापसारक फिल्टर के माध्यम से 500 μL में DGUC-एचडीएल (कुल प्रोटीन) के 1.2 मिलीग्राम फिल्टर (सामग्री की सूची देखें), तुरंत इंजेक्शन से पहले।
      नोट: एक 0.45 माइक्रोन सूक्ष्म केन्द्रापसारक फिल्टर 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से करने से पहले DGUC-एचडीएल नमूना का एक अतिरिक्त छानने के कुछ नमूने के लिए आवश्यक हो सकता है।
    2. फ़िल्टर DGUC-एचडीएल नमूना ले लीजिए, FPLC (भरने) इंजेक्शन सिरिंज लोड, और यह सुनिश्चित वहाँ FPLC में इंजेक्शन लगाने से पहले सिरिंज में कोई बुलबुले हैं।
    3. 2.6 एमपीए पर एक दबाव की सीमा के साथ 0.3 एमएल / मिनट के लिए FPLC प्रवाह की दर निर्धारित करें। बफर के 0.2 स्तंभ की मात्रा (लगभग 15 मिलीलीटर), इंजेक्शन नमूना करने के लिए पहले से कॉलम संतुलित करना। FPLC (इंजेक्शन लूप) साधन में बफर के 3 मिलीलीटर के साथ नमूना इंजेक्षन और रन शुरू करते हैं। 72 अंशों की कुल के लिए 1.5 एमएल अंशों लीजिए।

2. उच्च throughput लघु शाही सेनाअनुक्रमण (sRNAseq, ~ 9 दिन)

  1. आरएनए अलगाव (~ 1 दिन)
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वर्णमिति किट का उपयोग कर कुल कोलेस्ट्रॉल के स्तर को निर्धारित करने से DGUC-एचडीएल के लिए इसी FPLC अंशों को पहचानें। 7 FPLC DGUC-एचडीएल युक्त भिन्न - इस FPLC सेट-अप का उपयोग करना, 6 पाने की उम्मीद।
    2. DGUC-एचडीएल FPLC अंशों से सभी की मात्रा (लगभग 8 -1 0 एमएल 1.45 एमएल अंश के पूल मात्रा) लीजिए और ध्यान केंद्रित का उपयोग कर 10 केडीए मेगावाट 4 डिग्री सेल्सियस पर या एचडीएल ध्यान केंद्रित जब तक कट ऑफ केन्द्रापसारक फिल्टर इकाइयों 1 घंटे के लिए 4000 XG पर लगभग 100 μL है।
    3. एचडीएल ध्यान केंद्रित लीजिए और बीसीए विधि 8 का उपयोग एचडीएल कुल प्रोटीन एकाग्रता यों।
    4. एचडीएल कुल प्रोटीन के सर्वोच्च एकाग्रता, ऊपर 1 मिलीग्राम, उस सेट में प्रत्येक नमूने से aliquoted जा सकती है निर्धारित करते हैं। उदाहरण के लिए, प्रत्येक नमूना के लिए एचडीएल कुल प्रोटीन का एक ही राशि से शाही सेना को अलग।
    5. का उपयोग कर आरएनए अलगाव को पूरा करेंएक संशोधित प्रोटोकॉल (सामग्री की सूची देखें)।
      1. 1 मिनट के लिए फिनोल सेल अभिकर्मक (देखें सामग्री की सूची) नमूना और भंवर के 10x मात्रा में जोड़ें।
      2. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
      3. क्लोरोफॉर्म (फिनोल सेल अभिकर्मक कदम 2.1.5.1 में इस्तेमाल की मात्रा का 20%) जोड़ें और 15 एस के लिए सख्ती से हिला।
      4. 3 मिनट - 2 के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
      5. एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र में 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 XG पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
      6. एक नया ट्यूब ऊपरी जलीय चरण स्थानांतरण, अंतरावस्था से परहेज।
      7. 1 मिनट के लिए जलीय चरण और भंवर के लिए 100% इथेनॉल के 1.5x मात्रा में जोड़ें।
      8. कम से कम 1 घंटे के लिए या रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर नमूने हैं।
      9. प्रदान की मिनी स्तंभों का उपयोग शाही सेना अलगाव प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें।
      10. के साथ 30 की μL RNase मुक्त एच 2 ओ Elute सबसे पहले 2 मिनट के लिए मिलाना, कम गति (2,000 XG) पर स्पिन करने के लिए सीधे 15 एच 2 ओ की μL जोड़ने के लिए, औरउसके बाद 1 मिनट के लिए उच्च गति (अधिकतम) पर स्पिन। एच 2 ओ की एक अतिरिक्त 15 μL के साथ इस चरण को दोहराएँ
    6. इसके तत्काल बाद -80 डिग्री सेल्सियस पर sRNA पुस्तकालय पीढ़ी या स्टोर करने के लिए आगे बढ़ें।
  2. लाइब्रेरी जनरेशन (~ 6 घंटे)
    1. sRNA पुस्तकालय पीढ़ी किट प्रोटोकॉल का उपयोग sRNA सीडीएनए पुस्तकालयों, के रूप में नीचे विस्तृत पीसीआर प्रवर्धन के लिए एक संशोधन के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार करें।
      1. 0.5 μL DNase / RNase मुक्त एच 2 ओ युक्त बर्फ पर पीसीआर mastermix तैयार, 15 μL पीसीआर मिश्रण (पीएमएल) और 1 μL आरएनए पीसीआर प्राइमर (RP1) नमूना प्रति (शामिल त्रुटि pipetting के लिए एक अतिरिक्त 10%)।
      2. पीसीआर की 16.5 μL प्रत्येक (सीडीएनए) नमूना करने के लिए मिश्रण जोड़ें।
      3. बहुसंकेतन के लिए प्रत्येक नमूने के लिए एक सूचकांक / बारकोड नंबर आवंटित करने और नमूना करने के लिए (इसी संख्या के लिए) 1 μL पीसीआर प्राइमर सूचकांक जोड़ें।
      4. microfuge का उपयोग करते हुए एक त्वरित स्पिन प्रदर्शन करना।
        नोट: कुल मात्रा चाहिएअब नमूना प्रति 30 μL हो।
      5. के रूप में टेबल्स 2 और 3 में विस्तृत पीसीआर प्रवर्धन के लिए साइकिल चालन की स्थिति प्रदर्शन करना।
  3. आकार का चयन sRNA लाइब्रेरी एडाप्टर को हटाने के लिए: एडेप्टर (~ 1.5 घंटे)
    1. लक्ष्य: के रूप में निर्माता के निर्देशों के अनुसार निम्नलिखित आकार मानकों के साथ स्वत: डीएनए आकार चयनकर्ता का उपयोग पुस्तकालय आकार-चयन प्रदर्शन करना 156 बीपी, शुरू: 135 बीपी, अंत: 177 बीपी, रेंज फ्लैग ब्रॉड।
  4. डीएनए क्लीन अप (~ 0.5 घंटे)
    1. साफ आकार चयनित निर्माता के निर्देशों के अनुसार sRNA सीडीएनए।
    2. स्वच्छ Elute और 2 x 7 μL DNase / RNase मुक्त एच 2 ओ के साथ sRNA सीडीएनए केंद्रित
  5. यों और आकलन sRNA सीडीएनए लाइब्रेरी उपज और गुणवत्ता (~ 1 ज)
    1. (सामग्री की सूची) प्रति manufact के रूप में आकलन sRNA सीडीएनए पुस्तकालय की गुणवत्ता और आकार एक bioanalyzer पर एक उच्च संवेदनशीलता डीएनए चिप का उपयोगurer के निर्देशों।
    2. एक उच्च संवेदनशीलता डीएनए परख (सामग्री की सूची) का उपयोग निर्माता के निर्देशों के अनुसार अलग-अलग sRNA सीडीएनए पुस्तकालय सांद्रता यों।
      नोट: यह अलग सूचकांक के साथ सभी नमूनों प्रवाह सेल यदि संभव हो तो की ही लेन पर चलाने के लिए किया है करने के लिए सिफारिश की है। एक से अधिक लेन की आवश्यकता होती है, तो मामला और नियंत्रण के नमूने को उचित मिश्रण।
  6. उच्च throughput sRNA अनुक्रमण (~ 7 दिन)
    1. पूल व्यक्ति equimolar सांद्रता पर आधारित sRNA पुस्तकालयों अनुक्रमित।
    2. 2.5.2 - स्क्रीन bioanalyzer पर उच्च संवेदनशीलता डीएनए चिप का उपयोग और 2.5.1 के रूप में पुस्तकालय डीएनए एकाग्रता का निर्धारण गुणवत्ता के लिए sRNA पुस्तकालयों जमा।
    3. निर्माता के निर्देशों (सामग्री की सूची) के अनुसार अनुक्रमण पुस्तकालय qPCR मात्रा का ठहराव किट का उपयोग कर उचित अनुक्रमण गहराई सुनिश्चित करने के लिए एडाप्टर सामग्री की मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) का प्रदर्शन।
    4. एक भी पढ़ने का उपयोग कर अनुक्रमण प्रदर्शन, 50 बी25 एम / नमूना पढ़ता है, निर्माता के निर्देशों के अनुसार - पी प्रोटोकॉल लगभग 20 की गहराई तक पहुंचने के लिए।

3. डेटा विश्लेषण (~ 1 दिन)

  1. bcl2fastq2 का प्रयोग करें, उपयोगकर्ता गाइड के निर्देशों के अनुसार, demultiplexed नमूनों की preprocess कच्चे fastq फ़ाइलें (सामग्री की सूची) के लिए।
  2. एडेप्टर 9 ट्रिम और दूर करने के लिए प्रयोग करें Cutadapt पढ़ता <16 न्यूक्लियोटाइड (एनटीएस) लंबाई में उपयोगकर्ता गाइड के निर्देश (सामग्री की सूची) के अनुसार,।
  3. स्थान पर समाधान के अनुक्रम सहित sRNA पुस्तकालयों में मौजूद संदूषण दृश्यों (एसटीपी: CCACGTTCCCGTGG) निकालें और एडाप्टर कैरी ओवर (CTACAGTCCGACGATC) NGSPERL ढांचे में removeSequenceInFastq समारोह का उपयोग, उपयोगकर्ता का मार्गदर्शन निर्देश (सामग्री की सूची) के अनुसार।
  4. उपयोगकर्ता गाइड के निर्देश (सामग्री की सूची) के अनुसार, FastQC मात्रात्मक विज्ञान के लिए केंद्र (CQS) उपकरणों का उपयोग करके गुणवत्ता नियंत्रण मैट्रिक्स प्रदर्शन करना।
  5. "समान" की गैर बेमानी सूची उत्पन्न पढ़ता (पतन redundaNT पढ़ता है) और रिकार्ड की नकल संख्या CQSTools का उपयोग कर, उपयोगकर्ता गाइड के निर्देश (सामग्री की सूची) के अनुसार।
  6. , उपयोगकर्ता का मार्गदर्शन निर्देश (सामग्री की सूची) के अनुसार: (ए -m 100 --best --strata -v 1 विकल्प) संरेखित मानव जीनोम Bowtie1.1.2 की इजाजत दी 1 बेमेल उपयोग करने के लिए पढ़ता है।
  7. संरेखण, गिनती पढ़ा करते हैं, और, NGSPERL का उपयोग कर उपयोगकर्ता गाइड के निर्देशों के अनुसार संक्षिप्तीकरण कार्यों परिणाम है।
  8. एक स्प्रेडशीट फ़ाइल कन्वर्ट करने के लिए निर्यात गिनती मेज।
  9. मानक के अनुसार कुल संख्या के एक विशिष्ट वर्ग (जैसे, miRNAs) की पढ़ता है कि वर्ग (जैसे, miRNAs की कुल संख्या पढ़ता है) और रिपोर्ट संकेतों पढ़ता प्रति मैप miRNA (RPMM) के रूप में पढ़ता के लिए की। (जैसे, RPMM = (मीर एक्स / miRNA की कुल # पढ़ता) * 1000000)।
  10. निम्न स्तर और उच्च स्तर के अंतर के लिए सॉफ्टवेयर में सामान्य एकल रंग प्रौद्योगिकी के रूप में इनपुट सामान्यीकृत गिनती तालिका उपयोगकर्ता गाइड के निर्देश (सामग्री की सूची) के अनुसार विश्लेषण करती है।
    नोट: वर्तमान में, कोई अच्छी तरह से विशेषता गृह व्यवस्था जीन हैं / SRNएचडीएल sRNA लिए के रूप में। एक कील-नियंत्रण में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन समस्याग्रस्त किया जा सकता है। कुल प्रोटीन इनपुट या मात्रा एचडीएल को सामान्य बनाने की सलाह दी है। सबसे महत्वपूर्ण बात यह विभिन्न रणनीतियों में से एक ने अनुक्रमण परिणाम मान्य करने के लिए miRNAs और sRNAs का उपयोग वास्तविक समय पीसीआर या मात्रात्मक पीसीआर यों की सिफारिश की है।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल एक साथ जुड़े हुए उच्च throughput अनुक्रमण या वास्तविक समय पीसीआर (चित्रा 1) द्वारा अत्यधिक शुद्ध एचडीएल पर sRNAs की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देने के लिए स्थापित तरीकों की एक श्रृंखला है। व्यवहार्यता और इस प्रोटोकॉल के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए, एचडीएल मिलकर DGUC और FPLC विधि द्वारा मानव प्लाज्मा से शुद्ध किया गया था। इसी एचडीएल के लिए (कोलेस्ट्रॉल वितरण से) एकत्र FPLC अंशों केंद्रित थे और कुल शाही सेना एचडीएल (कुल प्रोटीन) के 1 मिलीग्राम से पृथक किया गया। sRNA पुस्तकालयों एन = 4 स्वस्थ मानव विषयों से एकत्र एचडीएल के साथ उत्पन्न किया गया। सभी मानव रक्त / प्लाज्मा नमूनों सक्रिय संस्थागत समीक्षा बोर्ड प्रोटोकॉल (# 070416) के तहत एकत्र किए गए थे, और के रूप में वेंडरबिल्ट विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन के द्वारा अनुमोदित मानव विषयों सूचित सहमति के साथ नामांकित किया गया। तैयार sRNA पुस्तकालयों उन्नत जीनोमिक्स (सहूलियत) डीएनए अनुक्रमण केंद्र और डेटा का विश्लेषण करने के लिए प्रदर्शन किया गया वेंडरबिल्ट टेक्नोलॉजीज में अनुक्रम थेघर में पाइप लाइनों का उपयोग कर। डेटा visualizations सॉफ्टवेयर रेखांकन द्वारा बनाया गया था।

DGUC के बाद एचडीएल अलगाव के लिए एक दूसरी विधि (FPLC) प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण जरूरत ईवीएस के संभावित सह-शुद्धि के कारण है। ईवीएस झिल्ली व्युत्पन्न पुटिकाओं कि Multivesicular निकायों (exosomes) से उत्पन्न, प्लाज्मा झिल्ली (microvesicles) नवोदित, और अन्य प्रक्रियाओं, apoptotic निकायों में 10 सहित, की एक सामान्यीकृत वर्ग के हैं। ईवीएस, अर्थात् exosomes, छोटे एचडीएल (2A चित्रा) के रूप में एक समान घनत्व है सूचित किया गया है, और इस तरह, एचडीएल घनत्व अंश में मौजूद हो सकता है (1.063-1.21 जी / एमएल) DGUC 11,12 के बाद। ईवीएस और अन्य लिपो प्रोटीन (जैसे, एलडीएल) को निकालने के लिए DGUC-एचडीएल से, FPLC अन्य पुटिकाओं और आकार से कणों से अलग एचडीएल के लिए इस्तेमाल किया गया था; एचडीएल (7 - व्यास में 12 एनएम) और ईवीएस (40 - व्यास में 220 एनएम) को आसानी से अपने आकार मतभेद (चित्रा 2A, बी) की वजह से fractionated रहे हैं। एचडीएल अंशकोलेस्ट्रॉल के वितरण के कारण आसानी से स्पष्ट थे, और DGUC-एचडीएल FPLC अंशों जमा थे और 10 केडीए कट-ऑफ centrifugation फिल्टर का उपयोग ध्यान केंद्रित किया। केंद्रित एचडीएल एकत्र और नीचे की ओर शाही सेना के विश्लेषण (चित्रा 2 बी) के लिए इस्तेमाल किया गया। इस बिंदु को वर्णन करने के लिए, प्लाज्मा पूर्व DGUC FPLC और फॉस्फोलिपिड का वितरण (phosphatidylcholine, पीसी) का उपयोग fractionated किया गया था; कुल कोलेस्ट्रॉल (टीसी), और प्रोटीन के स्तर मात्रा निर्धारित और भिन्न भर में प्लॉट किए जाते थे। पीसी, टीसी, और प्रोटीन का स्तर तीन वर्णमिति किट का उपयोग मात्रा गया। और वीएलडीएल / एलडीएल भिन्न (14 - 18) - सभी तीन मानकों को स्पष्ट रूप से एचडीएल भिन्न (24 से 19) में परिभाषित किया। FPLC-fractionated प्लाज्मा में, प्रोटीन और लिपिड संकेतों न्यूनतम पता चला रहे थे या नहीं पुटिका के लिए इसी वीएलडीएल (नारंगी बॉक्स के बाएं) (चित्रा 3 ए) से अधिक आकार भागों में से सभी का पता चला। एचडीएल की DGUC जुदाई का प्रदर्शन करने के लिए, DGUC-एचडीएल भी FPLC और पीसी, टीसी द्वारा fractionated किया गया था, और प्रोटीन का स्तर quantif थेआईईडी (चित्रा 3 बी)। इन मूल्यों की साजिश रचने का उपयोग कर DGUC एलडीएल की एक छोटी राशि के सह-विभाजन को दिखाता है और अत्यधिक शुद्ध एचडीएल को अलग-थलग करने के लिए मिलकर DGUC-FPLC दृष्टिकोण का उपयोग करने की आवश्यकता को पुष्ट। हालांकि ईवीएस DGUC दौरान एचडीएल के साथ सह-fractionate की भविष्यवाणी कर रहे हैं, वहाँ एलडीएल (चित्रा 3 बी) की तुलना में अधिक से अधिक आकार पुटिका के लिए इसी भागों में लिपिड और प्रोटीन काफी मात्रा में पाया किसी से कम नहीं था। (डेटा) नहीं दिखाया ईवी लिपिड और भविष्यवाणी आकार रेंज में प्रोटीन हस्ताक्षर जब FPLC द्वारा fractionated भी न्यूनतम detectable या DGUC-वीएलडीएल और DGUC-एलडीएल से अनुपस्थित है। शाही सेना के विश्लेषण के लिए, कुल शाही सेना sRNA पुस्तकालय पीढ़ी के लिए मिलकर शुद्ध एचडीएल के 1 मिलीग्राम से पृथक किया गया। संक्षेप में, एडेप्टर 3 'और फिर 5' sRNAs के टर्मिनल समाप्त होता है, miRNAs और टीडीआर (चित्रा 4 ए) सहित ligated थे। Ligated उत्पादों रिवर्स लिखित थे (आरटी) और पीसीआर डॉव दौरान बहुसंकेतन नमूने के लिए बनाया गया विशेष अनुक्रमित शरण पीसीआर प्राइमरों का उपयोग परिलक्षितnstream अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं (चित्रा -4 ए)। प्रत्येक एडाप्टर लंबाई में 61 एनटीएस है; इसलिए, एक ligated miRNA (लंबाई में लगभग 22 एनटीएस) लंबाई में 144 एनटीएस का एक उत्पाद का उत्पादन होगा। कई गैर miRNA sRNAs अब थोड़ा miRNAs की तुलना में कर रहे हैं (उदाहरण के लिए, 30 - लंबाई में 35 एनटीएस)। जैसे, उत्पाद की हमारी लक्षित लंबाई लंबाई में 156 बीपीएस था। लंबाई में 177 बीपीएस एकत्र किए गए थे (चित्रा -4 ए) - परिलक्षित उत्पादों आकार से चयनित एक स्वत: डीएनए आकार चयनकर्ता और सभी सीडीएनए उत्पादों 135 का उपयोग कर रहे थे। आकार चयनित पुस्तकालयों के गुणों उच्च संवेदनशीलता डीएनए bioanalyzer (चित्रा 4 बी) का उपयोग चिप्स द्वारा मूल्यांकन किया गया। इस आकार के sRNA सीडीएनए पुस्तकालयों संभव के कारण आकार में थोड़ा बड़ा दिखाई दिया विश्लेषण के दौरान प्रभाव "बुदबुदाती"। मल्टिप्लेक्स अनुक्रमण के लिए, सीडीएनए पुस्तकालयों की equimolar सांद्रता, जमा थे साफ किया, ध्यान केंद्रित किया, और bioanalyzer (चित्रा 4 बी) का उपयोग reanalyzed। मल्टिप्लेक्स नमूना तो sequen थाएक भी पढ़ 50 बीपी प्रोटोकॉल का उपयोग ced। घर में डेटा विश्लेषण पाइपलाइनों अनुक्रमित पर आधारित नमूने demultiplex करने के लिए इस्तेमाल किया गया, एडेप्टर ट्रिम, चलाने के गुणवत्ता नियंत्रण मेट्रिक्स, मानव जीनोम के लिए पंक्ति में और एनोटेट sRNAs गिनती। सामान्यीकृत का वितरण पढ़ता लंबाई में,> 16 एनटीएस (प्रति लाख, आरपीएम पढ़ता है), sRNAs 20 के संवर्धन को समझाना - लंबाई में 22 एनटीएस और 34 - एचडीएल (चित्रा 4C) पर लंबाई में 35 एनटीएस।

संरेखण और चार एचडीएल sRNA पुस्तकालयों की गिनती विश्लेषण में पाया गया कि 38% मानव जीनोम थे miRNAs (चित्रा 5 ए) के एनोटेट क्षेत्रों के लिए संरेखित पढ़ता है। समान रूप से प्रचुर मात्रा में (37%) sRNAs व्युत्पन्न tRNAs (टीडीआर) से थे। sRNAs व्युत्पन्न विविध आरएनए (जैसे, वाई आरएनए), rRNAs, smRNAs, snoRNAs, और लंबे समय से गैर-कोडिंग आरएनए (lincRNAs) से एचडीएल (चित्रा 5 ए) पर भी मौजूद थे। की कुल संख्या के सामान्य होने के बाद, प्रत्येक वर्ग के लिए पढ़ता शीर्ष 50 सबसे प्रचुर मात्रा में मीरNAS (पुस्तकें प्रति मैप miRNA, RPMM, चित्रा 5 ब), टीडीआर (प्रति टीडीआर, आरपीएमटी, चित्रा 5C मैप पढ़ता है), और अन्य गैर-miRNA गैर टीडीआर sRNAs (प्रति मैप sRNA, RPM, चित्रा 5 डी पढ़ता है) हीटमैप द्वारा आयोजित किए गए । इन आंकड़ों समानताएं उदाहरण देकर स्पष्ट करना (जैसे, एचडीएल miRNAs) और विसंगतियों स्वस्थ विषयों (चित्रा 5 ब-डी) भर में सबसे प्रचुर मात्रा में एचडीएल sRNAs की (जैसे, टीडीआर)। इन परिणामों के इस रणनीति और प्रोटोकॉल की शक्ति एचडीएल द्वारा sRNAs के परिवहन में उल्लेखनीय अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए प्रदर्शित करता है। फिर भी, sRNA अनुक्रमण पूर्ण quantitation के लिए पर भरोसा नहीं किया जाना चाहिए। ब्याज की sRNAs वास्तविक समय पीसीआर द्वारा मान्य किया जाना चाहिए। इसी तरह, कई जांचकर्ताओं केवल एचडीएल पर व्यक्तिगत miRNAs की मात्रा का ठहराव आवश्यकता हो सकती है। जैसे, कुल एचडीएल आरएनए वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग एचडीएल miRNAs के रिश्तेदार मात्रा का ठहराव के लिए प्रत्येक विषय से अलग किया गया था। अधिक प्रचुर मात्रा में sRNAseq द्वारा एचडीएल पर पता चला miRNAs की पांच वजह लिए इस्तेमाल किया गयाएल समय पीसीआर assays के प्रत्येक एचडीएल नमूना (चित्रा 5E) पर अपने स्तर निर्धारित करने के लिए। शाही सेना अलगाव 13 में एचडीएल प्रोटीन इनपुट के 1000 माइक्रोग्राम के लिए - (ΔCtArb RQV = 2) और सामान्यीकृत रिश्तेदार मात्रात्मक मूल्यों एक मनमाना गृह व्यवस्था के 32 सीटी का उपयोग कर की गणना की गई। वास्तविक समय पीसीआर अध्ययन के परिणाम दर्शाते हैं कि इस प्रोटोकॉल भी एचडीएल miRNAs का पता लगाने और व्यक्तियों भर में मतभेद बढ़ाता में मूल्यवान है। सामूहिक रूप से, प्रस्तुत schematics तरीकों की महत्वपूर्ण जानकारी को परिभाषित है, और दोनों उच्च throughput अनुक्रमण और वास्तविक समय पीसीआर दृष्टिकोण से परिणाम इस प्रोटोकॉल के डिलिवरेबल्स प्रतिनिधित्व करते हैं।

आकृति 1
चित्रा प्रोटोकॉल का 1. प्रतिनिधि प्रवाह चार्ट। शुद्ध एचडीएल घनत्व ढाल ultracentrifugation और तेजी से प्रोटीन तरल chromatog से अलग है Raphy। कुल एचडीएल आरएनए तो छोटे आरएनए (sRNA) अनुक्रमण के लिए उपयोग किया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. एचडीएल के अलगाव। (ए) घनत्व और लिपो प्रोटीन और बाह्य पुटिकाओं (ईवी) के व्यास का चार्ट। (बी) अनुक्रमिक मिलकर एचडीएल अलगाव के योजनाबद्ध, प्लाज्मा जुदाई, घनत्व ढाल ultracentrifugation (DGUC), तेजी से प्रोटीन सहित तरल क्रोमैटोग्राफी (FPLC), निस्पंदन, और एकाग्रता। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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। चित्रा 3. फास्ट-प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (FPLC) लिपो प्रोटीन ईवी, बाह्य पुटिकाओं की जुदाई; VLDL, बहुत कम घनत्व लिपो प्रोटीन; एलडीएल, कम घनत्व लिपो प्रोटीन; एचडीएल, उच्च घनत्व लिपो प्रोटीन; एफपी, नि: शुल्क प्रोटीन; पीसी, phosphatidylcholine; और टीसी, कुल कोलेस्ट्रॉल। रेड लाइन, टीसी; ब्लू लाइन, प्रोटीन, और काला लाइन, पीसी। घनत्व ढाल ultracentrifugation (DGUC) और (बी) DGUC के बाद एचडीएल अंश से पहले (ए) मानव प्लाज्मा से लिपो प्रोटीन के पृथक्करण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. लघु शाही सेना पुस्तकालय की पीढ़ी। (ए) छोटे आरएनए (sRNA) पुस्तकालय सी के योजनाबद्धonstruction और आकार-चयन। miRNA, microRNA; टीडीआर, tRNA व्युत्पन्न sRNAs; sRNA, गैर miRNA गैर टीडीआर sRNAs; आरटी, रिवर्स प्रतिलेखन; बीपी, आधार जोड़ी; और सीडीएनए, क्लोन डीएनए। (बी) के पहले और उच्च संवेदनशीलता डीएनए चिप्स और bioanalyzer का उपयोग कर बहुसंकेतन के बाद एचडीएल sRNA पुस्तकालयों का विश्लेषण। एचडीएल sRNA (सी) लंबाई वितरण अनुक्रमण के बाद पढ़ता है। आरपीएम, प्रति लाख पढ़ता है, एम, पुरुष विषयों; एफ, महिला विषयों; और NT, न्यूक्लियोटाइड। एन = 4। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. एचडीएल sRNAs की विविधता। (ए) sRNA वर्गों में एचडीएल sRNAs का वितरण। के अंश मानव जीनोम में एनोटेट sRNAs के लिए गठबंधन पढ़ता है। (बी) heatmaps एन = 4 एचडीएल sRNA नमूने हैं। 2 पढ़ता प्रति मैप miRNA, RPMM। (सी) टॉप 50 सबसे प्रचुर मात्रा में एचडीएल tRNA व्युत्पन्न sRNAs (टीडीआर)। लॉग-इन 2 पढ़ता प्रति मैप टीडीआर, आरपीएमटी। (डी) टॉप 50 सबसे प्रचुर मात्रा में एचडीएल अन्य गैर miRNA और गैर-टीडीआर sRNAs (sRNA)। लॉग-इन 2 पढ़ता प्रति मैप sRNA, RPMS। (ई) एचडीएल miRNAs की वास्तविक समय पीसीआर मात्रा का ठहराव। एम, पुरुष विषयों; एफ, महिला विषयों। सापेक्ष मात्रात्मक मनमाना हाउसकीपिंग सीटी द्वारा निर्धारित मूल्य = 32, एचडीएल प्रोटीन इनपुट 13 के 1000 माइक्रोग्राम के लिए सामान्यीकृत। एन = 4. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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लिपोप्रोटीन अलग होने के लिए 1. विरोधी oxidants 100x पर शेयर समाधान करें
EDTA Ethylenediaminetetraacetic एसिड (0.5 एम स्टॉक)
एजेडटी 3-एमिनो-1,2,4-triazole: 42 मिलीग्राम / एमएल एच 2 ओ
BHT Butylated HYDROXYTOLUENE: 25 मिलीग्राम / 100 μL EtOH
TROLOX (+) - 6 हाइड्रोक्सी 2,5,7,8-tetramethylchromane-2-एसिड: 41.7 मिलीग्राम / 500 μL EtOH
2. ओवरले समाधान
समाधान # 1 1.019 जी / एच 2 ओ में एमएल
समाधान # 2 1.025 ग्राम / मिलीलीटर KBR / एच 2 ओ
समाधान # 3 1.063 ग्राम / मिलीलीटर KBR / एच 2 ओ
समाधान # 4 1.080 ग्राम / मिलीलीटर KBR / एच 2 ओ
समाधान # 5 1.255 ग्राम / मिलीलीटर KBR / एच 2 ओ
3. FPLC बफर
1 एल पकाने की विधि 50 एमएल 3M सोडियम क्लोराइड; 20 एमएल 0.5 Tris एचसीएल, पीएच 7.6; 10% सोडियम azide के 2 एमएल; 930 एमएल एच 2 ओ


तालिका 1. विशेष अभिकर्मकों।

मंच अस्थायी (डिग्री सेल्सियस) पहर साइकिल
ए 98 30 एस 1
बी 98 10 s 25
60 30 एस
72 15 एस
सी 72 दस मिनट 1

सारणी 2।लाइब्रेरी पीढ़ी प्रवर्धन कदम।

भजन की पुस्तक अनुक्रम
प्राइमर 1.1 AATGATACGGCGACCACCGAGAT
प्राइमर 2.1 CAAGCAGAAGACGGCATACGA

तालिका 3. पीसीआर प्राइमरों।

मंच अस्थायी (डिग्री सेल्सियस) पहर साइकिल
ए 95 दस मिनट 1
बी 95 10 s 40
60

तालिका 4 लाइब्रेरी मात्रा प्रवर्धन कदम।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल अत्यधिक शुद्ध एचडीएल पर उच्च throughput अनुक्रमण या वास्तविक समय पीसीआर द्वारा miRNAs और अन्य sRNAs यों बनाया गया है। किसी भी दृष्टिकोण के साथ के रूप में, विशेष कारणों से सफ़ाई एचडीएल और शाही सेना की प्रक्रिया में हर कदम को दी जानी चाहिए और उसके बाद sRNAs बढ़ाता। इस प्रोटोकॉल प्लाज्मा के ≥ 2 एमएल के साथ शुरू की परियोजनाओं के लिए बनाया गया है। फिर भी, उच्च गुणवत्ता शाही सेना विश्लेषण सफलतापूर्वक आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग मानव या माउस प्लाज्मा के μL के रूप में छोटा रूप में 80 से शुद्ध एचडीएल के साथ पूरा किया जा सकता है; हालांकि, बड़े शुरुआती प्लाज्मा मात्रा में यहाँ प्रस्तुत तरीकों का उपयोग कर बेहतर डेटा का उत्पादन। नमूना प्रसंस्करण और निकासी तरीकों में तेजी से बदल सकते हैं miRNA / sRNA गुणवत्ता और उपज। anticoagulants का उपयोग करते हैं, जबकि प्लाज्मा संग्रह के लिए आवश्यक हैं, आमतौर पर नीचे की ओर निकासी प्रभावित करता है। उदाहरण के लिए, हेपरिन आसानी से शाही सेना निष्कर्षण 14,15 के दौरान हटा नहीं है, और पीसीआर 16-18 में उपयोग बहाव के एंजाइमों को बाधित कर सकते हैं। इसके अलावा, धअरे रिपोर्ट है कि सोडियम साइट्रेट भी qPCR माप जहां EDTA के नमूनों से miRNAs सोडियम साइट्रेट नमूने 16,19,20 की तुलना में अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल में सुधार हुआ है करने के लिए दिखाया जाता है के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। जब एक anticoagulant चुनने इन अध्ययनों से सावधानी से विचार करने के लिए की जरूरत का प्रदर्शन। इसके अलावा, जमावट के दौरान सेल के लिए वृद्धि की क्षमता के कारण, सीरम नमूनों lysed सेलुलर miRNAs कृत्रिम रूप से लिपो प्रोटीन के साथ संबद्ध कर सकते हैं के रूप में सिफारिश नहीं कर रहे हैं। इसी तरह, प्लाज्मा आदर्श पूरे रक्त से तुरंत अलग है lysed ल्यूकोसाइट्स सहित अन्य परिधीय रक्त कोशिकाओं, के संक्रमण से बचने के लिए। ठंड तापमान व्यापक रूप से प्लेटलेट सक्रियण को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है, पूरे रक्त के नमूने दूर एरिथ्रोसाइट्स, leukocytes और प्लेटलेट्स से 3,000 XG पर कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए घूमती हैं। Hemolysis भी बीमार की सलाह दी है के रूप में उठी एरिथ्रोसाइट्स भी miRNA परिणाम 21,22 प्रभावित करने के लिए सूचित किया गया है, के रूप में वे miRNAs कि hemol दौरान बहाया जा सकता है शामिलविश्लेषण 23,24। प्लाज्मा तो 2 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता - 4 सप्ताह या वैकल्पिक रूप से प्लाज्मा -80 डिग्री सेल्सियस जहां miRNA सामग्री स्थिर और दोनों अल्पकालिक और दीर्घकालिक भंडारण (अधिकतम 4 वर्ष) 25 में सक्षम है पर जमे हुए किया जा सकता है। हमारे वर्तमान ज्ञान के लिए, प्लाज्मा नमूनों ठंड एचडीएल miRNAs और जमे हुए प्लाज्मा नमूनों का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त हैं नुकसान पहुँचाने की भविष्यवाणी नहीं की है। लिपो प्रोटीन और अन्य घटकों पूरे रक्त भोजन का सेवन से प्रभावित हो सकते हैं, उपवास रक्त संग्रह पसंद किया जाता है।

जैसा कि ऊपर कहा, प्लाज्मा एचडीएल DGUC, FPLC, और apoA-मैं के खिलाफ आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी सहित मानक तरीकों, के एक नंबर के माध्यम से अलग किया जा सकता है। । DGUC द्वारा प्लाज्मा लिपो प्रोटीन के अलगाव KBR का उपयोग करते हुए, के रूप में Redgraves द्वारा वर्णित एट अल 26, अलग करती वीएलडीएल (घ = 0.94 - 1.006 g / एमएल), एलडीएल (डी = 1.006 - 1,063 g / एमएल) और एचडीएल (डी = 1.063-1.21 नमूना प्रति 60 मिलीग्राम) - जी / एमएल) और प्लाज्मा (2 की बड़ी मात्रा के लिए एक आदर्श तरीका है। सीमाइस दृष्टिकोण का उपयोग कर अकेले है कि exosomes और अन्य miRNA ईवीएस युक्त एचडीएल को एक समान घनत्व रिपोर्ट कर रहे हैं और DGUC एचडीएल (2A चित्रा) में मौजूद हो सकता है। अन्य नुकसान buffers और मजबूत ultracentrifugation बलों में उच्च नमक जोखिम से प्रोटीन के लिए संभव संरचनात्मक क्षति के रूप में अच्छी तरह से एचडीएल उप-वर्गों 27,28 के अंतर stabilities शामिल हैं। इस के बावजूद, DGUC सामान्यतः के रूप में यह एचडीएल प्रोटीन का एक उच्च उपज में परिणाम है, प्लाज्मा 29 के 1 एमएल प्रति एचडीएल प्रोटीन के लिए करीब 1 मिलीग्राम उत्पादन किया जाता है। FPLC दृष्टिकोण है, जो आकार अपवर्जन जेल निस्पंदन शामिल है, कम समय की आवश्यकता प्रवाह की दर (लगभग 6 घंटे) पर निर्भर करता है, और ईवीएस सहित लिपो प्रोटीन युक्त ApoB से एचडीएल को अलग (आकार) के द्वारा अधिक से अधिक सटीक और उनके उप-वर्गों है एचडीएल की तुलना में काफी बड़े होते हैं लेकिन इसी तरह के घनत्व है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि लगभग 220 के बीच तरीकों इस प्रोटोकॉल में विस्तृत जानकारी दी, प्लाज्मा पुटिकाओं का उपयोग कर - व्यास में 75 एनएम भी नहींजब FPLC द्वारा अलग एक detectable लिपिड या प्रोटीन हस्ताक्षर प्रकाश में लाना। सेट-अप पर निर्भर करता है, FPLC अपेक्षाकृत छोटे इनपुट की आवश्यकता है, 0.3 - 1 एमएल, जो कृंतक प्लाज्मा और छोटे जमे हुए aliquots के लिए उपयोगी है। त्वरित वर्णमिति कोलेस्ट्रॉल assays FPLC निम्न एचडीएल या अन्य लिपोप्रोटीन अंशों का वितरण पुष्टि करने के लिए भी महत्वपूर्ण हैं। विभाजन के नमूने और लिपो प्रोटीन dilutes; हालांकि, नमूने तो मानक केन्द्रापसारक आकार-फिल्टर का उपयोग केंद्रित किया जा सकता है (जैसे, 10 केडीए कट ऑफ मेगावाट फिल्टर)। apoA-मैं आईपी द्वारा एचडीएल अलगाव सूक्ष्म स्पिन स्तंभों का उपयोग कर तीन दृष्टिकोण के तेज कर रहे हैं, लेकिन कम इनपुट द्वारा सीमित हैं (0.08 - 1 μL) की मात्रा और कम उपज (लगभग 0.1 मिलीग्राम)। apoA-मैं आईपी श्रमसाध्य हो सकता है, इस विधि कम मात्रा सेल संस्कृति supernatants के लिए आदर्श है। जबकि इन तरीकों में से प्रत्येक शक्तियों और कमजोरियों है, इन यदि मिलकर में इस्तेमाल कम किया जा सकता है (जैसे, DGUC पीछा किया FPLC)। का अधिक से अधिक शुद्धता में मिलकर में दो दृष्टिकोण, परिणामों का उपयोग करनाmiRNA और sRNA विश्लेषण के लिए एचडीएल।

यहाँ, हम अत्यधिक शुद्ध एचडीएल को अलग करने के लिए आवश्यक कदम DGUC का मिलकर विधि FPLC के द्वारा पीछा का उपयोग कर सकते हैं या तो विस्तृत और उच्च throughput अनुक्रमण या वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग एचडीएल miRNAs और sRNAs यों इस्तेमाल कदम बताया। हालांकि इस प्रोटोकॉल एचडीएल के लिए डिजाइन किया गया था, यह एलडीएल और VLDL, उनके घनत्व और आकार के आधार पर सहित अन्य लिपो प्रोटीन, पर sRNAs बढ़ाता में महान प्रयोज्यता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultracentrifuge  Beckman Coulter A99839 Optima XPN-80
Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter 331362 SW-41Ti
AKTA Pure FPLC System GE Healthcare 29018224
3x FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line GE Healthcare 28990944 10/300 gl
SynergyMx BioTek Instruments 7191000
Tabletop centrifuge Thermo Scientific 75004525 Sorvall ST40R
Refrigerated centrifuge Eppendorf 22629867 5417R (purchased through USA Scientific)
Microfuge  USA Scientific 2631-0006
PippenPrep Sage Science PIP0001
2100 Bioanalyzer  Agilent G2938B
High Sensitivity DNA Assay Agilent 5067-4626
Sequencing Library qPCR Quantification Kit Illumina SY-930-1010
ProFlex Thermal Cycler Applied Biosystems 4484073
QuantStudio 12k Flex Applied Biosystems 4471134
EpMotion Robot Eppendorf 960000111 5070
Ultra-clear centrifuge tubes Beckman Coulter 344059
Potassium Bromide Fisher Chemicals P205-500
15 mL conical tube Thermo Scientific 339650
Micro-centrifugal filters 0.45 µm Millipore UFC30HV00
Micro-centrifugal filters 0.22 µm Millipore UFC30GV00
miRNAEasy Total RNA Isolation Kits Qiagen 217004
Total Cholesterol colormetric kit Cliniqa (Raichem) R80035
10,000 m.w. cut-off centrifugation filter Amicon UFC801024 purchased through Millipore
PCR strip tubes Axygen PCR-0208-C purchased through Fisher
microRNA RT kit Life Technologies 4366597 For 1000 reactions
PCR master mix Life Technologies 4440041 50 mL bottle
Pierce BCA kit Thermo Scientific 23225
Clean and Concentrator Kit Zymo D4014
Dialysis tubing Spectrum Labs 132118 purchased through Fisher
bcl2fastq2 Illumina n/a Software
Cutadapt https://github.com/marcelm/cutadapt n/a Software
NGSPERL github.com/shengqh/ngsperl n/a Software
CQSTools github.com/shengqh/CQS.Tools n/a Software
Bowtie 1.1.2  http://bowtie-bio.sourceforge.net n/a Software
GeneSpringGX13.1.1 Agilent n/a Software

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References

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जैव रसायन अंक 117 एचडीएल छोटे गैर-कोडिंग RNAs microRNAs उच्च throughput अनुक्रमण घनत्व ढाल ultracentrifugation तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी।
गैर-कोडिंग लघु शाही सेना मात्रा के लिए उच्च घनत्व लिपो प्रोटीन का अलगाव
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Michell, D. L., Allen, R. M., Landstreet, S. R., Zhao, S., Toth, C. L., Sheng, Q., Vickers, K. C. Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification. J. Vis. Exp. (117), e54488, doi:10.3791/54488 (2016).

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