Abstract
的小非编码RNA的多样性（的sRNA）正在迅速扩大以及它们在生物过程，包括基因调控作用，正在出现。最有趣的是，sRNAs也发现的细胞外，并稳定地存在于所有生物流体。因此，胞外sRNAs代表一类新的疾病的生物标志物，并有可能涉及细胞信号传导和细胞间通讯网络。以评估其作为生物标志物的潜力，sRNAs可在血浆，尿和其他流体来量化。然而，为了完全理解外sRNAs内分泌信号的影响，重要的是，以确定哪些载波被运送并保护它们在生物流体（ 例如，血浆），该细胞和组织向细胞外的sRNA池，以及细胞和能够组织接受和利用外斯尔纳。为了实现这些目标，它是分离外载体的高纯度的种群临界对的sRNA分析和定量。我们以前表明，脂蛋白，特别是高密度脂蛋白（HDL），输送单元和高密度脂蛋白的miRNA之间的功能的微RNA（miRNA）的疾病是显著改变。这里，我们详细，利用与密度梯度超速离心法（DGUC）和快速蛋白液相层析（FPLC）串联的HDL隔离一个新的协议，以获得高纯度的HDL用于下游分析和所有sRNAs，包括miRNA的量化，同时使用高-throughput测序和实时PCR的方法。该协议将是对HDL sRNAs调查的宝贵资源。
Introduction
外的非编码小RNA（sRNAs）代表一类新的疾病生物标志物和潜在的治疗靶点，并可能促进细胞-细胞通信1。的sRNA的研究最广泛的类型是微RNA（miRNA）的其中大约长22个核苷酸，并从长前体形式和初级转录2被处理。微RNA已被证实在转录后通过蛋白质翻译和mRNA降解2的诱导的抑制调节基因表达。然而，miRNA是只是许多类型sRNAs中的一个;作为sRNAs可以从父母的tRNA（tRNA的衍生sRNAs，TDR），核小分子RNA（斯尔纳衍生sRNAs，sndRNA），核仁小分子RNA（的snoRNA衍生sRNAs，小核RNA），核糖体RNA被切割（rRNA的衍生sRNAs，RDR ）中，Y的RNA（YDR）和其他杂项的RNA 1。这些新颖sRNAs的几个例子已经被报道功能类似的miRNA;然而，生物福许多这些sRNAs的nctions仍有待确定，尽管在基因调控作用可能3-6。最有趣的是，微RNA等sRNAs是在细胞外流体，包括唾液，血浆，尿和胆汁稳定地存在。胞sRNAs有可能通过其与细胞外囊泡（EV），脂蛋白，和/或细胞外核糖核蛋白复合物关联免受RNA酶。
先前，我们报道了脂蛋白，即高密度脂蛋白（HDL），在等离子体7运输的miRNA。在这项研究中，高密度脂蛋白是使用密度梯度超速离心（DGUC），快速蛋白液相色谱法（尺寸排阻色谱凝胶过滤，FPLC），顺序法和亲和层析（抗载脂蛋白AI（载脂蛋白A-I）的免疫沉淀分离）7。同时使用基于PCR的实时低密度阵列和单个miRNA的测定法，miRNA的水平对HDL定量从愈合分离你和高胆固醇血症患者7。使用这种方法，我们可以来分析miRNAs与量化高纯HDL准备具体的miRNA。自2011年以来，我们已经确定，尽管亲和层析提高HDL纯度，饱和度抗体大大限制了产量，并且可以成本过高。目前，我们的协议建议随后通过FPLC，也产生高品质的HDL样品下游RNA分离和的sRNA量化DGUC的两步骤顺序串联方式。由于sRNAs（sRNAseq）， 例如 ，miRNA的高通量测序，并增加了其他非miRNA的斯尔纳类的认识的最新进展，sRNAseq是国家的最先进的miRNA与斯尔纳分析的电流。因此，我们的协议建议量化miRNAs与使用sRNAseq HDL样品等sRNAs。尽管如此，从HDL中分离总RNA也可用于量化个体的miRNA和其他sRNAs或使用实时PCR一验证sRNAseq结果pproaches。在这里，我们详细描述的收集，纯化，量化，数据分析和高纯度的高密度脂蛋白sRNAs的验证协议。
本文的总体目标是展示从人血浆中分离的高纯度的HDL的sRNA量化的可行性和工艺。
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Protocol
1. HDL净化（〜5.5天）
- 密度梯度离心（DGUC，〜5天）
- 添加90微升的100倍的抗氧化剂，以9毫升血浆从新鲜静脉血分离。
- 通过从步骤1.1.1（0.0278克/毫升溴化钾血浆）中加入0.251克溴化钾9mL的血浆从1.006克/ mL的调整加KBr等离子体密度1.025克/毫升。岩石等离子体直到所有的盐溶解在室温和转移到超速离心管，并确保所有的气泡上升到顶部。
- 弯曲18-G针的针尖从前端90°1厘米，斜面朝上。用注射器和18号针头，小心地将3毫升的覆盖溶液＃1中的等离子体（ 表1）以上。
注：弯曲针可确保所有的VLDL / IDL，LDL和HDL是不与覆盖混合除去。 - 去除大部分在顶部的气泡，留下2 - 从液面3毫米的空间，以在管和carefu的顶LLY置于SW-40Ti桶管。
- 称重天平上每个桶（与帽），并与相对的桶（桶+帽）恰好平衡：＃1至＃4，＃2〜＃5，＃3至＃6。
注意：这些桶必须是平衡的，在任何时候都匹配。 - 将转子超速（材料清单）。离心274,400 XG 24小时在4℃有4号中间制动。
- 小心地从桶去除转子桶和管道。
- 小心地从使用注射器和弯针的覆盖层的顶层除去2毫升。这将是可以储存于4的VLDL / IDL分数 °C或-80 C。
- 去除VLDL / IDL分数后，收集剩余的7毫升样本（血浆），并把它放到一个15 mL锥形管。把样品的体积可达9毫升叠加解决方案＃2（ 表1）。
- 调整从1.025克/ mL的样品密度1.080克/毫升溴化钾使用约0.746克溴化钾9毫升样品或0.0828克在/样品毫升溴化钾。直到所有的溴化钾溶解（约20分钟），并转移到超速离心管，同时确保气泡上升到顶部轻轻摇动样品。
- 随着注射器和针头，小心地将3毫升的叠加解决方案＃3比样品（ 表1）。离开2 - 从液面3毫米的空间，以该管的顶部。
- 在管的顶部除去大部分任何残留的气泡，并小心地在SW-40Ti桶填充超离心管中。
- 称重天平上每个桶（与帽），并与相对的桶+帽恰好平衡，如在1.1.5。
- 放入超速离心机转子（见材料清单）。离心274,400 XG 24小时在4℃有4号中间制动。
- 小心地从桶去除转子桶和管道。
- 用注射器从覆盖的顶层小心地取出2毫升，并NT针。这将是可以储存于4 LDL部分 °C或-80 C。
- 去除LDL部分后，收集剩余的大约7毫升样本（血浆），并放置到一个新的15 mL锥形管。使样品（血浆）的多达9毫升的体积与1.080克/ mL溶液＃4（ 表1）。
- 从1.080克/毫升调整采样密度1.30克/毫升的9毫升样本（血浆）KBr压3.33克KBr压或0.37克溴化钾样品的每毫升。岩石或稍微搅动样品，直到所有的溴化钾（盐）溶解并转移到超速离心管。
- 用注射器和针头，小心地将3毫升的覆盖溶液＃5在样品（ 见表1）。
- 在管的顶部除去大部分任何残留的气泡，而使从弯月2-3毫米的空间，以该管的顶部并小心地将在SW-40Ti桶填充超离心管中。
- 称量每个桶（与天平上的帽），并准确平衡与对方斗+帽，如1.1.5。
- 放入超速离心机转子（见材料清单）。离心274,400 XG 48小时在4℃有4号制动器。
- 小心地从桶去除转子桶和管道。
- 小心地从使用注射器和弯针的覆盖层的顶层除去约2mL。这是高密度脂蛋白馏分，它可以储存在4℃或-80℃。
注：按照DGUC的HDL可透析以除去高盐溶液。 - 至透析，将所收集的HDL馏分在密封透析套筒（10,000 MW截止），并在1升1×PBS中透析过夜。变更透析缓冲液（1×PBS）中超过24小时的3倍。用磁力搅拌棒的PBS温柔扰动将提高透析。
- 确定使用BCA方法8 DGUC-HDL的蛋白质浓度。
- 快速蛋白质液相CHROmatography（FPLC）或尺寸排阻色谱（〜6小时）
- 过滤1.2毫克在500微升DGUC-HDL（总蛋白）的通过0.22μm微离心过滤器（见材料清单），紧接在注射之前。
注：通过之前的0.22微米过滤器0.45μm的微离心过滤的DGUC-HDL样品的附加滤波可能需要一些样品。 - 收集过滤DGUC-HDL样品，加载FPLC（填充）注射器，并确保有在注射器无气泡注入FPLC之前。
- 用在2.6兆帕的压力下限值设定FPLC流速0.3毫升/分钟。平衡柱用缓冲液的0.2倍柱体积（大约15毫升），向样品注射之前。注射用3毫升缓冲到FPLC（注射循环）仪器样品并开始运行。收集1.5毫升的级分，共72级分。
- 过滤1.2毫克在500微升DGUC-HDL（总蛋白）的通过0.22μm微离心过滤器（见材料清单），紧接在注射之前。
2.高通量小分子RNA测序（sRNAseq，〜9日）
- RNA分离（约1天）
- 通过使用根据制造商的说明比色试剂盒测定总胆固醇水平识别对应于DGUC-HDL的FPLC级分。使用这种FPLC设置，期望找到6 - 含DGUC-HDL 7 FPLC级分。
- 收集所有从DGUC-HDL FPLC级分的体积（大约8 -1 0毫升1.45毫升馏分池卷），用浓缩10kDa的截留分子量离心过滤装置在4000 xg离心1小时，在4℃或直至HDL浓缩物大约为100微升。
- 收集的HDL浓缩物，并使用BCA法8量化HDL总蛋白质浓度。
- 确定HDL总蛋白的浓度最高，达到1毫克，可以从组中的每个样本被等分。例如，从每个样品的相同量的高密度脂蛋白总蛋白的分离RNA。
- 使用执行RNA分离修改后的协议 （见材料清单）。
- 加10倍体积的苯酚的裂解试剂（参见材料的列表）样品和涡旋的1分钟。
- 在室温下孵育5分钟。
- 加氯仿（步骤2.1.5.1用酚裂解液体积的20％），剧烈摇晃15秒。
- 在室温下孵育2 - 3分钟。
- 离心机以12,000 xg离心在冷冻离心机15分钟，4℃。
- 上层水相转移到新的管中，避免了相间。
- 100％的乙醇的1.5倍体积添加到水相，涡旋1分钟。
- 商店样品至少1小时，或在-80℃过夜。
- 与使用提供迷你列的RNA分离协议继续。
- 用30μL的无RNase H 2 O洗脱第一直接添加的 H 2 O 15的μL到玻璃料，旋以低速（2,000 XG）处理2分钟，并然后旋转以高速（最大值）为1分钟。重复此步骤与H 2 O.另外15微升
- 立即着手斯尔纳生成库或储存在-80℃。
- 库生成（〜6小时）
- 准备使用的sRNA文库生成试剂盒协议的sRNA cDNA文库，按照制造商的说明用一个修改的PCR扩增，详述如下。
- 准备在包含0.5μLDNA酶/ RNA酶的游离H 2 O冰PCR mastermix，15μLPCR混合物（PML）和1微升RNA PCR引物（RP1）每个样品（包括取样误差额外的10％）。
- 添加PCR的16.5微升混合到每个（基因）样本。
- 分配一个索引/条码号每个样品进行多路复用，并添加1微升的PCR引物指数（以相应的数字）到样品中。
- 执行使用离心一个快速旋转。
注：总成交量应该现在是每个样品30μL。 - 如于表2和3中详细进行PCR扩增的循环条件。
- 准备使用的sRNA文库生成试剂盒协议的sRNA cDNA文库，按照制造商的说明用一个修改的PCR扩增，详述如下。
- 大小选择斯尔纳库删除适配器：适配器（〜1.5小时）
- 目标：采用全自动DNA大小选择按照制造商的说明以下尺寸的参数执行库的大小选择156 bp的开始：135基点，结束：177基点，范围标志：广阔。
- DNA清理（〜0.5小时）
- 清理大小选择根据制造商的说明的sRNA的cDNA。
- 洗脱干净，集中斯尔纳基因与2×7μLDNA酶/无RNase H 2 O.
- 量化和评估斯尔纳cDNA文库的产量和品质（〜1小时）
- 使用高灵敏度的DNA芯片上的生物分析仪评估的sRNA cDNA文库的质量和尺寸（材料清单），为每厂家专业urer的说明。
- 使用高灵敏度的DNA测定（材料清单），按照制造商的说明定量个体的sRNA cDNA文库的浓度。
注：建议有一个与不同的索引的所有样本进行上，如果可能的流动池的同一车道中运行。如果需要多于一个车道，适当地混合的情况下和对照样品。
- 高通量的sRNA测序（〜7天）
- 池个别指数基于等摩尔浓度斯尔纳库。
- 2.5.2 - 屏幕上使用生物分析仪高灵敏度的DNA芯片，并确定文库DNA浓度2.5.1合并斯尔纳库质量。
- 的适配器含量进行定量PCR（定量PCR），以确保适当的深度测序使用测序文库定量PCR定量试剂盒按照制造商的说明（材料清单）。
- 使用单一的读取进行测序，50 BP协议达到约20的深度 - 25男读取/样品，按照制造商的说明。
3.数据分析（约1天）
- 使用bcl2fastq2，按照用户手册的说明，以解复用的样品预处理的原料FASTQ文件（材料清单）。
- 使用Cutadapt修剪适配器9，并删除读<16个核苷酸（NTS）长，按照用户手册的说明（材料清单）。
- 除去目前在斯尔纳库，包括一站式的解决方案序列污染序列（STP：CCACGTTCCCGTGG）使用removeSequenceInFastq功能NGSPERL框架和适配器结转（CTACAGTCCGACGATC），按照用户手册的说明（材料清单）。
- 通过中心的定量科学（CQS）工具FastQC执行质量控制指标，按用户手册的说明（材料清单）。
- 生成的“同一”非冗余名单读起来（崩溃redundaNT读取），并使用CQSTools记录的拷贝数，按照用户手册的说明材料（列表）。
- 对齐读取使用Bowtie1.1.2允许1错配的人类基因组（选项：-a -m 100 --best --strata -v 1），按照用户手册的说明（材料清单）。
- 执行读取校准，计数，并使用NGSPERL，按照用户手册的说明导致摘要任务。
- 转换出口计数表到电子表格文件。
- 一个特定的类（ 如中，miRNA）的正常化读取到总数为类（ 例如，miRNA的总数读取）和报表信号，读取数映射的miRNA（RPMM）读取。 （ 例如 ，RPMM =（MIR-X / miRNA的总＃读取）* 1,000,000）。
- 输入归伯爵表作为一般单色技术到软件的低层次和高层次的差异分析按照用户手册的说明（材料清单）。
注意：目前，没有良好的特点看家基因/ SRN至于HDL-斯尔纳。尖峰在控制都可以使用，但也可以是有问题的。正火高密度脂蛋白总蛋白输入或体积建议。最重要的是，它是推荐的各种策略之一来验证测序结果以量化使用实时PCR或定量PCR的miRNA和sRNAs。
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Representative Results
这个协议是一系列连接在一起，以允许sRNAs对高纯度的HDL通过高通量测序或实时PCR（ 图1）的定量确定的方法。为了演示的可行性和这个协议的影响，高密度脂蛋白是从人血浆中由串联DGUC和FPLC方法纯化。对应于高密度脂蛋白（由胆固醇分布）收集FPLC级分浓缩和总RNA，1毫克的HDL（总蛋白）的分离。从N = 4的健康人体内高密度脂蛋白收集生成斯尔纳库。人类所有的血液/血浆样品正在积极的机构审查委员会的协议（＃070416）收集和人类受试者入组知情同意批准的医学范德比尔特大学医学院。准备斯尔纳库范德比尔特技术用于进行DNA测序中心和数据分析的高级基因组学（VANTAGE）进行测序使用内部管道。数据可视化是由作图软件创建的。
DGUC后执行的HDL隔离第二种方法（FPLC）的迫切需要是由于电动车的可能共纯化。电动车是一个广义类，从多泡体（外来）起源膜衍生的囊泡，质膜出芽（微泡），和其它工艺，包括凋亡小体10。电动汽车，即外来体，已报道具有类似的密度小的HDL（ 图2A），并且因此，可以存在于所述的HDL浓度分数- DGUC 11,12后（1.0631.21克/毫升）。要除去电动汽车和其他脂蛋白（ 如 LDL），从DGUC-HDL，FPLC用于从其他大小囊泡和颗粒分离的高密度脂蛋白;高密度脂蛋白（7 -直径为12纳米）和电动车（40 -直径220纳米）很容易由于其尺寸上的差异（ 图2A，B）的分级分离。 HDL分数小号是显而易见的，由于胆固醇的分布和DGUC-HDL的FPLC级分合并并用10 kDa截止的离心过滤器浓缩。浓缩的HDL收集并用于下游RNA分析（ 图2B）。为了说明这一点，等离子体预DGUC用FPLC和磷脂的分布（磷脂酰胆碱，PC）的分级分离;总胆固醇（TC），和蛋白水平进行定量，并横跨馏分作图。使用三个比色试剂盒的PC，TC和蛋白水平进行定量。所有这三个参数明确规定HDL分数（19 - 24）和VLDL / LDL分数（14 - 18）。在FPLC分级分离血浆，蛋白质和脂质信号进行微创检测或不检测所有的级分对应于囊泡尺寸大于VLDL（左橙色框的）（ 图3A）更大。为了证明HDL的DGUC分离，DGUC-HDL也被FPLC和PC，TC分级和蛋白质水平quantifIED（ 图3B）。绘制这些值示出了使用DGUC LDL少量的共分离和强化了需要使用串联DGUC-FPLC的方法来高纯度的高密度脂蛋白分离。虽然电动汽车被预测为DGUC期间与HDL共同分馏，几乎没有到没有在脂质和蛋白质中找到对应于囊泡尺寸除LDL（ 图3B）更大的级分。在预测大小范围在EV脂类和蛋白质签名也是最小可检测的或从DGUC-VLDL和DGUC-LDL缺席时通过FPLC分馏（未示出数据）。用于RNA分析，总RNA从1毫克串联纯化的HDL中分离得到的sRNA文库生成。简言之，适配器被连接到3'，然后5'sRNAs的末端，包括miRNAs与中继卫星（ 图4A）。连接产物逆转录（RT）和使用PCR引物携带在DOW期间设计用于复用样品特定索引PCR扩增nstream测序反应（ 图4A）。每个适配器的长度为61个核苷酸;因此，一个结扎的miRNA（在长度约22个核苷酸）将产生的在长144个核苷酸的产物。许多非miRNA的sRNAs比的miRNA略长（ 例如 ，30 -长度为35 NTS）。因此，我们的目标产品的长度是长度156个基点。扩增产物大小选择使用DNA自动尺寸选择器和所有cDNA产物135 - 177基点的长度收集（ 图4A）。大小选择的库的质量通过使用生物分析仪（ 图4B）的高灵敏度的DNA芯片进行评估。这种规模的斯尔纳cDNA文库中出现大小由于可能稍大分析过程中“沸腾”的效果。对于复用的测序，cDNA文库等摩尔浓度合并，清洗，浓缩，并用生物分析仪（ 图4B）重新分析。然后多路复用的样品sequen使用单个读取50个基点协议土木工程署。内部数据分析管道被用来解复用基于指数样本，修剪适配器，运行质量控制指标，对齐到人类基因组和计数注明sRNAs。的归一化分布读取（读取每百万，RPM），> 16个核苷酸长，说明sRNAs 20的富集- 22 NTS的长度和34 - 35个核苷酸的长度上的HDL（ 图4C）。
对准和四个高密度脂蛋白的sRNA库计数分析发现，38％的读取对准人类基因组是微RNA（ 图5A）的注释的区域。同样丰富（37％）为sRNAs衍生自的tRNA（TDRS）。 sRNAs衍生自杂的RNA（ 例如 ，Y的RNA），个rRNA，smRNAs，52]形成，和长的非编码RNA（lincRNAs）也存在于高密度脂蛋白（ 图5A）。正常化的总数后读取每个类，排名前50位最丰富的miR来港（读取数映射的miRNA，RPMM， 图5B），存托凭证（读取数映射TDRS，rPMT的， 图5C），以及其他非miRNA的非TDR sRNAs（读取数映射斯尔纳，RPMS， 图5D）通过热图举办。这些数据说明了相似性（ 例如，高密度脂蛋白的miRNA）和差异跨健康受试者（ 图5B-D）最丰富的HDL-sRNAs（ 如 TDRS）。这些结果表明这种策略和协议的权力，以提供卓越的见解sRNAs由高密度脂蛋白的转运。尽管如此，斯尔纳测序不应该被绝对定量依赖。感兴趣sRNAs应由实时PCR进行验证。同样地，许多调查人员可能只需要对HDL个人miRNA的定量。这样，总HDL RNA从各受试者使用实时PCR HDL-miRNA的相对定量隔离。由sRNAseq HDL检测到更丰富的miRNA五个被用于REAL-时间PCR测定以确定其对每个HDL样品（ 图5E）的水平。 （ - ΔCtArbRQV = 2）和归一化到HDL蛋白质输入的1000微克到RNA分离13的相对定量值使用任意的内务32的Ct计算。从实时PCR的研究结果表明，该协议也是在检测HDL-miRNAs与量化不同个体的不同价值。统称为呈现图表定义的方法中的关键细节，并且从两个高通量测序和实时PCR方法的结果代表本协议的成果。
图 议定书 1. 代表流程图 。纯HDL是由密度梯度离心和快速蛋白液体chromatog隔离造影。那么总HDL RNA可以用于小RNA（斯尔纳）测序。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2 的HDL的分离。（A） 的脂蛋白和细胞外囊泡（EV）的密度和直径的图表。（B）的顺序串联的HDL隔离的示意图，包括等离子分离，密度梯度超速离心法（DGUC），快速蛋白液相色谱法（FPLC），过滤，浓缩。 请点击此处查看该图的放大版本。
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。脂蛋白 EV，胞外囊泡 图3. 快速蛋白质液相色谱（FPLC）分离 ; VLDL，极低密度脂蛋白;低密度脂蛋白，低密度脂蛋白;高密度脂蛋白，高密度脂蛋白; FP，无蛋白; PC，磷脂酰胆碱;和TC，总胆固醇。红线，TC;蓝线，蛋白质和黑线，PC。从之前的密度梯度离心（DGUC）和DGUC后（B）HDL分数（A）人血浆脂蛋白的分离。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4. 代小RNA图书馆。（A）小RNA（斯尔纳）库c示意图。施工和大小选择。的miRNA，小RNA; TDR，tRNA的衍生sRNAs;斯尔纳，非miRNA的非TDR sRNAs; RT，逆转录; BP，碱基对;和cDNA克隆的DNA。（B）前，并使用高灵敏度的DNA芯片和生物分析仪复用后HDL-斯尔纳库的分析。HDL-斯尔纳（三）长度分布测序后读取。 RPM，读取数万元;男，男科;男，女性受试者;和NT，核苷酸。 N = 4。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5. 多样性HDL-sRNAs的。（A）横跨斯尔纳类HDL-sRNAs的分布。的分数读取在人类基因组对准注释sRNAs。 （BD）比赛地图N = 4 HDL-斯尔纳样本。
| 1.抗氧化剂为脂蛋白分离 | 请在100X原液 |
| EDTA | 乙二胺四乙酸（0.5M的股票） |
| AZT | 3-氨基-1,2,4-三唑：42毫克/毫升的 H 2ö |
| BHT | 丁基化的羟基：25毫克/ 100微升乙醇 |
| 水溶性维生素E | （+） - 6-羟基-2,5,7,8- tetramethylchromane -2-羧酸：41.7毫克/ 500微升乙醇 |
| 2.覆盖解决方案 | |
| 解决方案＃1 | 1.019克/毫升H中2 O |
| 解决方案＃2 | 1.025克/毫升溴化钾/ H 2 O |
| 解决方案＃3 | 1.063克/毫升溴化钾/ H 2 O |
| 解决方案＃4 | 1.080克/毫升溴化钾/ H 2 O |
| 解决方案＃5 | 1.255克/毫升溴化钾/ H 2 O |
| 3. FPLC缓冲 | </ TR> |
| 1升食谱 | 50毫升氯化钠3M; 20毫升0.5的Tris-HCl，pH值7.6; 2毫升10％的叠氮化钠; 930毫升水2 O |
表1.特殊试剂。
| 阶段 | 温度（℃） | 时间 | 周期 |
| 一个 | 98 | 30秒 | 1 |
| 乙 | 98 | 10秒 | 25 |
| 60 | 30秒 | ||
| 72 | 15秒 | ||
| C | 72 | 10分钟 | 1 |
表2中。库代扩增步骤。
| 底漆 | 序列 |
| 底漆1.1 | AATGATACGGCGACCACCGAGAT |
| 2.1底漆 | CAAGCAGAAGACGGCATACGA |
表3的PCR引物。
| 阶段 | 温度（℃） | 时间 | 周期 |
| 一个 | 95 | 10分钟 | 1 |
| 乙 | 95 | 10秒 | 40 |
| 60 |
表4.图书馆定量扩增步骤。
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Discussion
该协议被设计为通过高通量测序或实时PCR的高纯度的HDL量化的miRNA和其他sRNAs。与任何的办法，特别考虑应给予在净化HDL和RNA的过程中的每个步骤，然后量化sRNAs。这个协议设计用于开始≥2毫升血浆的项目。然而，高质量的RNA分析可以成功地与HDL使用亲和层析从人或小鼠血浆只需80μL的纯化完成;然而，更大的起点血浆容量产生使用这里介绍的方法，更好的数据。样品处理和提取方法可以大大改变的miRNA /的sRNA质量和产量。使用抗凝血剂，而血浆采集必不可少的，可能会影响下游的提取。例如，肝素是不容易的RNA提取14,15过程中被除去，并能抑制PCR中16-18利用下游酶。此外，第ERE报道说柠檬酸钠也可以与定量PCR测量其中来自EDTA样品的miRNA示相比柠檬酸钠样品16,19,20具有改善的表达谱干扰。在选择一种抗凝血剂时，这些研究表明，仔细考虑的需要。此外，由于凝固过程中的细胞裂解可能性增加，血清样品不建议作为裂解细胞的miRNA可以人为地脂蛋白相关联。同样，等离子体理想地立即从全血中分离，以避免来自其它外周血细胞，包括裂解白细胞污染。冷温度被广泛已知影响血小板活化，全血样品以3000 xg离心从红细胞，白细胞和血小板纺程在室温下15分钟。作为破裂的红细胞已报道也影响miRNA的结果21,22也不明智溶血，因为它们包含可hemol期间脱落的miRNAysis 23,24。然后等离子体可以储存在4℃下2 - 4周或替代地等离子体可在-80℃，其中miRNA的含量是在短期和长期存储（最多4年）25稳定且可行的冻结。就我们目前所知，冷冻血浆样品不预测伤害HDL-miRNAs与冰冻血浆样品适用于分析。作为脂蛋白和其它全血的成分可以通过食物摄取的影响，空腹采血是优选的。
如上所述，血浆HDL可以通过一些标准方法，包括DGUC，FPLC，以及对载脂蛋白A-I的亲和层析来分离。 。使用溴化钾由DGUC血浆脂蛋白的分离，如通过Redgraves 等人 26，分离的VLDL（D = 0.94 - 1.006克/毫升），低密度脂蛋白（D = 1.006 - 1.063克/ mL）和高密度脂蛋白（D = 1.063-1.21克/毫升）和为大体积的血浆（2的理想方法 - 每个样品60mL）中。限制以单独使用这个方法的缺点是外来体和含有电动汽车等的miRNA被报道具有相似的密度HDL和可存在于DGUC HDL（ 图2A）。其他缺点包括在缓冲区和强大的力量超速高盐暴露于可能的蛋白质结构的破坏以及HDL子类27,28的差稳定性。尽管如此，DGUC通常用作其导致高密度脂蛋白蛋白的高产率，每1毫升制造等离子体29的接近1毫克的HDL蛋白质。在FPLC方法，其中涉及大小排阻凝胶过滤，需要更少的时间，这取决于流速（约6小时），并具有更高的精度从含apoB脂蛋白中分离的HDL（由大小）和它们的子类，包括电动车那些比HDL大得多，但具有相似的密度。应当注意的是，使用约220之间在这个协议中详细描述的方法，等离子体囊泡 - 直径75纳米的不当FPLC分离引发血脂检测或蛋白质签名。根据不同的设置，FPLC需要相对较小的输入，0.3 - 1毫升，这是啮齿动物等离子和小分装冷冻有用。快速比色胆固醇检测也很重要以下FPLC确认HDL或其它脂蛋白馏分的分布。分级稀释样品和脂蛋白;然而，样品然后可以使用标准的离心尺寸的过滤器浓缩（ 例如，10 kDa的MW截止滤波器）。采用微型离心柱通过载脂蛋白A-I IP HDL隔离是最快的三种方法，而是通过低投入是有限的（0.08 - 1微升）量和产量低（大约为0.1毫克）。而载脂蛋白A-I的IP可以是费力的，这种方法是理想的低体积细胞培养物上清液。虽然这些方法都有长处和短处，如果串联使用这些可以减少（ 例如 ，DGUC其次FPLC）。在更高的纯度使用两个串联的方法，结果HDL的miRNA与斯尔纳分析。
这里，我们详细使用，随后通过FPLC DGUC的串联方式，以高纯度的高密度脂蛋白分离所需的步骤，并概述用于使用任一高通量测序或实时PCR定量HDL-miRNAs与sRNAs的步骤。虽然该协议被设计用于高密度脂蛋白，它具有在量化上以外的脂蛋白，包括LDL和VLDL，根据它们的密度和尺寸sRNAs适用性强。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3x FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45 µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
References
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