Abstract
A diversidade de pequenos RNAs não-codificantes (sRNA) está se expandindo rapidamente e seu papel nos processos biológicos, incluindo a regulação do gene, estão surgindo. Mais interessante, sRNAs também se encontram fora das células e são estavelmente presente em todos os fluidos biológicos. Como tal, sRNAs extracelular representam uma nova classe de biomarcadores da doença e estão provavelmente envolvidos em redes de comunicação intercelular de sinalização celular e. Para avaliar o seu potencial como biomarcadores, sRNAs podem ser quantificados no plasma, urina e outros fluidos. No entanto, para compreender totalmente o impacto de sRNAs extracelulares como sinais endócrinos, que é importante para determinar que os transportadores são transporte e protegendo-os em fluidos biológicos (por exemplo, plasma), que células e tecidos contribuem para piscinas srna extracelulares, e as células e os tecidos capazes de aceitar e utilizando extracelular sRNA. Para atingir essas metas, é fundamental para isolar populações altamente puras de portadores extracelularessRNA para perfilar e quantificação. Temos anteriormente demonstrado que as lipoproteínas, particularmente lipoproteínas de alta densidade (HDL), o transporte de microRNAs funcionais (miRNA) entre as células e HDL-miRNAs são significativamente alterados na doença. Aqui, nós detalhe um novo protocolo que utiliza conjunto de isolamento HDL com ultracentrifugação em gradiente de densidade (DGUC) and-fast-proteína cromatografia líquida (FPLC) para obter HDL elevado grau de pureza para perfilamento a jusante e quantificação de todos os sRNAs, incluindo miRNAs, usando tanto alta sequenciamento -throughput e em tempo real abordagens de PCR. Este protocolo será um recurso valioso para a investigação de sRNAs sobre HDL.
Introduction
Não codificantes pequenos RNAs extracelular (sRNAs) representam uma nova classe de marcadores de doença e potenciais alvos terapêuticos e provavelmente facilitar a comunicação uma célula-a-célula. O tipo mais amplamente estudado de sRNA são microRNAs (miRNA), que são cerca de 22 nts de comprimento e são processados de formas precursoras mais longos e transcritos primários 2. miARNs foram demonstradas para o pós-transcricionalmente regular a expressão do gene através da supressão da tradução de proteínas e a indução do ARNm da degradação 2. No entanto, os miRNAs são apenas um dos muitos tipos de sRNAs; como sRNAs pode ser clivada a partir tRNAs mãe (sRNAs derivados de tRNA, o TDR), RNAs pequenos nucleares (sRNAs sRNA derivados, sndRNA), pequenos RNAs nucleolares (sRNAs snoRNA derivados, snRNA), RNAs ribossomais (sRNAs, RDR rRNA derivado ), Y (RNAs yDR), e outros RNAs 1 variado. Alguns exemplos destes novos sRNAs têm sido relatados para funcionar semelhante ao miARNs; No entanto, o fu biológicanctions de muitos destes sRNAs permanece a ser determinada, embora papéis na regulação do gene são provavelmente 3-6. Mais interessante, miARNs e outros sRNAs são estavelmente presente nos fluidos extracelulares, incluindo a saliva, plasma, urina, e biliar. sRNAs extracelular são provavelmente protegido contra RNases através da sua associação com vesículas extracelulares (EV), lipoproteínas, e / ou complexos de ribonucleoproteína extracelulares.
Anteriormente, relatou que as lipoproteínas, ou seja, lipoproteínas de alta densidade (HDL), miRNAs de transporte no plasma 7. Neste estudo, o HDL foram isoladas utilizando um método sequencial de ultracentrifugação em gradiente de densidade (DGUC), cromatografia líquida rápida de proteínas (filtração em gel A cromatografia de exclusão de tamanho, FPLC), e imunoprecipitação de cromatografia de afinidade (anti-apolipoproteína AI (apo AI) ) 7. Utilizando ambas as matrizes de baixa densidade baseada em PCR em tempo real e ensaios de miARN individuais, níveis de miARN foram quantificados em HDL isolada a partir de curarthy e indivíduos com hipercolesterolemia 7. Usando essa abordagem, fomos capazes de perfil miRNAs e quantificar miRNAs específicos em preparações de HDL altamente puros. Desde 2011, nós determinamos que, apesar de cromatografia de afinidade melhora a pureza HDL, saturação de anticorpo limita grandemente o rendimento, e pode ser um custo proibitivo. Actualmente, o protocolo recomenda um método conjunto sequencial de dois passos de DGUC seguido por FPLC, que também produz amostras de HDL elevado de qualidade para a jusante de isolamento de ARN e sRNA quantificação. Devido aos recentes avanços no sequenciamento de alto rendimento de sRNAs (sRNAseq), por exemplo, os miRNAs, eo aumento da consciência de outras classes não-miRNA Srna, sRNAseq é o atual estado-da-arte em miRNA e sRNA profiling. Como tal, o nosso protocolo recomenda quantificar miRNAs e outros sRNAs em amostras de HDL usando sRNAseq. No entanto, o ARN total isolado a partir de HDL também pode ser utilizado para quantificar miARNs individuais e outros sRNAs ou validar os resultados sRNAseq utilizando PCR em tempo real umpproaches. Aqui nós descrevemos em detalhe um protocolo para a recolha, purificação, quantificação, análise de dados e validação de alta pureza HDL-sRNAs.
O objetivo geral deste trabalho é demonstrar a viabilidade e processo de sRNA quantificação de HDL altamente pura isolada a partir de plasma humano.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. A purificação de HDL (~ 5,5 dias)
- Gradiente de densidade de Ultracentrifugação (DGUC, ~ 5 dias)
- Adicionar 90 uL de 100x anti-oxidantes para 9 ml de plasma isolados a partir de sangue venoso fresco.
- Ajustar a densidade de plasma com KBr partir de 1,006 g / mL a 1,025 g / mL por adição de 0,251 g de KBr a 9 mL de plasma a partir do passo 1.1.1 (0,0278 g / ml de plasma de KBr). Balance o plasma até que todo o sal é dissolvido à temperatura ambiente e transferir para tubos de ultracentrífuga e assegurar que todas as bolhas subam para o topo.
- Dobre a ponta de uma agulha de 18 G a 90 ° 1 cm da ponta, o lado bisel voltado para cima. Usando uma seringa e a agulha de calibre 18, coloque cuidadosamente 3 mL de solução de sobreposição # 1 sobre o plasma (Tabela 1).
NOTA: A agulha torta garante todo o VLDL / IDL, LDL e HDL são removidos sem se misturar com a sobreposição. - Remover a maior parte das bolhas na parte superior, deixando 2 - espaço de 3 mm da menisco para a parte superior do tubo e carefully colocar os tubos em baldes SW-40Ti.
- Pesar cada balde (com as tampas) sobre o saldo, e exatamente equilibrar com o balde oposto (balde + cap): # 1 a # 4, # 2 e # 5 e # 3 a # 6.
NOTA: Estes baldes deve ser equilibrado e combinados em todos os momentos. - Coloque rotor em ultracentrífuga (Lista de Materiais). Centrifugar a 274.400 xg durante 24 h a 4 ° C com um freio intermédia # 4.
- Remova cuidadosamente baldes de rotor e os tubos de baldes.
- remover cuidadosamente 2 mL da camada de topo da sobreposição usando uma seringa e uma agulha dobrada. Esta será a fracção VLDL / IDL que pode ser armazenado a 4 ° C ou -80 ° C.
- Após a remoção da fração VLDL / IDL, recolher os restantes 7 mL de amostra (plasma) e colocá-lo em um tubo cônico de 15 mL. Perfazer o volume da amostra até a 9 ml com solução de sobreposição # 2 (Tabela 1).
- Ajustar a densidade da amostra de 1,025 g / mL a 1,080 g / ml com KBr usandocerca de 0,746 g de KBr na amostra 9 mL ou 0,0828 g / mL KBr da amostra. Agite suavemente a amostra até que todo o KBr é dissolvido (aproximadamente 20 min) e transferir para ultracentrífuga tubo, enquanto bolhas garantindo subir ao topo.
- Com seringa e agulha, coloque cuidadosamente 3 mL de solução de sobreposição # 3 sobre a amostra (Tabela 1). Deixar 2-3 mm de espaço menisco para o topo do tubo.
- Remover a maior parte de todas as bolhas restantes na parte superior do tubo e colocar os tubos de ultracentrífuga cuidadosamente cheios em baldes SW-40Ti.
- Pesar cada balde (com as tampas) sobre o saldo, e exatamente equilibrar com o balde oposto + cap, como em 1.1.5.
- Coloque rotor em ultracentrífuga (veja Lista de Materiais). Centrifugar a 274.400 xg durante 24 h a 4 ° C com um freio intermédia # 4.
- Remova cuidadosamente baldes de rotor e os tubos de baldes.
- remover cuidadosamente 2 mL da camada de topo da sobreposição usando uma seringa e seragulha nt. Esta será a fracção de LDL, que pode ser armazenado a 4 ° C ou -80 ° C.
- Após a remoção da fração LDL, recolher os restantes aproximados 7 ml de amostra (plasma) e colocá-lo em um novo tubo cônico de 15 mL. Perfazer o volume da amostra (plasma) até 9 mL com 1,080 g / mL de solução de # 4 (Tabela 1).
- Ajustar a densidade da amostra de 1,080 g / mL a 1,30 g / ml com KBr utilizando 3,33 g de KBr em 9 mL de amostra (plasma) ou 0,37 g de KBr para cada mL de amostra. Rocha ou ligeiramente agitar a amostra até que todo o KBr (sal) é dissolvida e transferir para ultracentrífuga tubo.
- Com seringa e agulha, coloque cuidadosamente 3 mL de solução de sobreposição # 5 sobre a amostra (Tabela 1).
- Remover a maior parte de todas as bolhas restantes na parte superior do tubo, deixando o ácido 2- espaço de 3 mm da menisco para a parte superior do tubo e colocar os tubos de ultracentrífuga cuidadosamente cheios em baldes SW-40Ti.
- Pesar cada balde (com as tampas) sobre o equilíbrio, e exatamente equilibrar com o balde oposto + cap, como em 1.1.5.
- Coloque rotor em ultracentrífuga (veja Lista de Materiais). Centrifugar a 274.400 xg durante 48 h a 4 ° C com um freio # 4.
- Remova cuidadosamente baldes de rotor e os tubos de baldes.
- Cuidadosamente remover cerca de 2 ml a partir da camada de topo da sobreposição usando uma seringa e uma agulha dobrada. Esta é a fracção HDL, o qual pode ser armazenado a 4 ° C ou -80 ° C.
NOTA: Seguindo DGUC HDL pode ser dialisada para remover as soluções de alto teor salino. - Para diálise, coloque a fração HDL recolhida em uma manga de diálise selado (10.000 MW de corte) e diálise durante a noite em 1 L 1x PBS. tampão mudança de diálise (1x PBS) 3 vezes ao longo de 24 h. perturbação suave do PBS com um agitar-barra magnética irá melhorar diálise.
- Determinar a concentração de proteína do DGUC-HDL usando um método BCA 8.
- Fast-Protein líquido Chrocromatografia em fase (FPLC) ou cromatografia de exclusão de tamanho (~ 6 h)
- Filtro de 1,2 mg de DGUC-HDL (proteína total) em 500 mL através de um filtro de 0,22 um micro-centrífuga (ver Lista de Materiais), imediatamente antes da injecção.
NOTA: Uma filtragem adicional da amostra DGUC-HDL através de um filtro de 0,45 um micro-centrífuga antes do filtro de 0,22? M podem ser necessários para algumas amostras. - Coletar a amostra DGUC-HDL filtrada, carregar a seringa de injeção FPLC (preenchimento), e garantir que não haja bolhas na seringa antes de injetar na FPLC.
- Definir a taxa de fluxo de FPLC de 0,3 mL / min com um limite de pressão de 2,6 MPa. Equilibrar as colunas com 0,2 volumes de coluna (aproximadamente 15 ml) de tampão, antes da amostra de injecção. Injectar a amostra com 3 ml de tampão para o (septo de injecção) instrumento FPLC e iniciar a execução. Recolha fracções de 1,5 mL para um total de 72 fracções.
- Filtro de 1,2 mg de DGUC-HDL (proteína total) em 500 mL através de um filtro de 0,22 um micro-centrífuga (ver Lista de Materiais), imediatamente antes da injecção.
2. alta taxa de transferência RNA pequenoSequenciamento (sRNAseq, ~ 9 dias)
- Isolamento de ARN (~ 1 dia)
- Identificar as correspondentes fracções de FPLC de DGUC-HDL por meio da determinação dos níveis de colesterol total utilizando um kit colorimétrico de acordo com as instruções do fabricante. Usando este FPLC set-up, espera encontrar 6 - 7 fracções de FPLC contendo DGUC-HDL.
- Recolher todo o volume (cerca de 8 -1 0 mL piscina de 1,45 fração mL volumes) a partir de fracções DGUC-HDL FPLC e concentrar usando 10 kDa mw unidades de filtragem centrífuga de corte a 4.000 xg durante 1 h a 4 ° C ou até concentrado HDL é de aproximadamente 100 mL.
- Recolhe-se o concentrado de HDL e quantificar a concentração de proteína total de HDL utilizando o método BCA 8.
- Determinar a concentração mais alta de proteína total de HDL, até 1 mg, que pode ser dividido em alíquotas de cada amostra no conjunto. Por exemplo, isolar o ARN a partir da mesma quantidade de proteína total de HDL para cada amostra.
- Isolamento de ARN utilizando executarum protocolo modificado (veja Lista de Materiais).
- Adicionar 10 x o volume de reagente fenol lise (veja Lista de Materiais) da amostra e vortex por 1 min.
- Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
- Adicionar clorofórmio (20% de volume de reagente de lise de fenol utilizado no passo 2.1.5.1) e agitar vigorosamente durante 15 segundos.
- Incubar à temperatura ambiente durante 2-3 minutos.
- Centrifugar durante 15 minutos a 12000 xg, a 4 ° C numa centrífuga refrigerada.
- Transferir a fase aquosa superior para um novo tubo, evitando a interfase.
- Adicionar volume de 1,5 x de 100% de etanol à fase aquosa e agitar com vortex durante 1 min.
- Armazenar as amostras de, pelo menos, 1 hora ou durante a noite a -80 ° C.
- Continue com o protocolo de isolamento do RNA usando o mini-colunas fornecidas.
- Eluir com 30 H mL de RNase 2 O. Em primeiro lugar, adicionar 15 mL de H2O directamente para a frita, centrifugação a baixa velocidade (2000 xg) durante 2 min, eem seguida girar a alta velocidade (max) durante 1 min. Repetir esta etapa com um adicional de 15 mL de H 2 O.
- proceder imediatamente a sRNA geração ou armazenamento de biblioteca a -80 ° C.
- Geração de biblioteca (~ 6 h)
- Preparar bibliotecas de ADNc sRNA usando o protocolo do kit sRNA biblioteca geração, conforme as instruções do fabricante, com uma modificação para a amplificação por PCR, conforme detalhado abaixo.
- Prepara-se o mastermix PCR em gelo, contendo 0,5 mL de DNase / RNase H 2 O, 15 ul mistura de PCR (LMP) e 1 uL Iniciador de PCR de ARN (RP1) por amostra (incluem um 10% adicional para a pipetagem de erro).
- Adicionar 16.5 ul de mistura de PCR a cada amostra (ADNc).
- Atribuir um número de índice / de código de barras de cada amostra para a multiplexação e adicionar 1 mL Índice de iniciador de PCR (com o número correspondente) à amostra.
- Executar uma rotação rápida usando o microcentrífuga.
NOTA: O volume total deveagora ser de 30 mL por amostra. - Efectuar as condições de ciclização para a amplificação por PCR como descrito nos quadros 2 e 3.
- Preparar bibliotecas de ADNc sRNA usando o protocolo do kit sRNA biblioteca geração, conforme as instruções do fabricante, com uma modificação para a amplificação por PCR, conforme detalhado abaixo.
- Tamanho Selecione sRNA Biblioteca remover do adaptador: Adaptadores (~ 1,5 h)
- Executar biblioteca de tamanho seleção usando seletor do tamanho do DNA automática de acordo com as instruções do fabricante com os parâmetros de tamanho seguintes: Alvo: 156 pb, de início: 135 pb, End: 177 pb, Bandeira Range: Broad.
- DNA Clean Up (~ 0,5 h)
- Limpar tamanho seleccionado de cDNA sRNA de acordo com as instruções do fabricante.
- Eluir limpo e concentrada cDNA sRNA com 2 x 7 mL DNase / RNase H 2 O.
- Quantificar e avaliar sRNA cDNA Biblioteca Rendimento e Qualidade (~ 1 h)
- Avaliar a qualidade biblioteca de cDNA sRNA e tamanho usando um chip de DNA de alta sensibilidade em um Bioanalyzer (Lista de Materiais) como por manufactinstruções do Urer.
- Quantificar as concentrações individuais biblioteca de ADNc sRNA utilizando um ensaio de ADN de alta sensibilidade (Lista de Materiais), de acordo com as instruções do fabricante.
NOTA: Recomenda-se a ter todas as amostras com índices diferentes ser executados na mesma pista da célula de fluxo, se possível. Se mais do que uma pista é necessário, misturar amostras de casos e de controlo de forma adequada.
- De alto rendimento sRNA Sequencing (~ 7 dias)
- Piscina indivíduo indexados bibliotecas Srna baseado em concentrações equimolares.
- Tela reunidas bibliotecas Srna para a qualidade usando chip de DNA de alta sensibilidade no Bioanalyzer e determinar a concentração de DNA biblioteca como em 2.5.1 - 2.5.2.
- Executar PCR quantitativo (qPCR) do conteúdo adaptador para garantir profundidade sequência apropriada usando a biblioteca de sequenciamento kit qPCR quantificação de acordo com as instruções do fabricante (Lista de Materiais).
- Execute sequenciamento usando uma única leitura, 50 bp protocolo para atingir uma profundidade de cerca de 20 - 25 M leituras / amostra, de acordo com as instruções do fabricante.
3. Análise de Dados (~ 1 dia)
- Use bcl2fastq2, conforme instruções guia do usuário, para arquivos raw fastq preprocess de amostras desmultiplexados (Lista de Materiais).
- Use Cutadapt para cortar placas de 9 e remover lê <16 nucleótidos (nts) de comprimento, conforme instruções guia do usuário (Lista de Materiais).
- Remover as sequências de contaminação presente nas bibliotecas Srna, incluindo sequência de solução de paragem (STP: CCACGTTCCCGTGG) e adaptador de carry-over (CTACAGTCCGACGATC) utilizando a função removeSequenceInFastq no quadro NGSPERL, conforme instruções guia do usuário (Lista de Materiais).
- Execute métricas de controle de qualidade por FastQC usando Centro de Ciências quantitativas (CQS) ferramentas, como por instruções guia do usuário (Lista de Materiais).
- Gerar lista não redundante de "idêntico" lê (redunda colapsont lê) e números de cópias registro usando CQSTools, conforme instruções guia do usuário (Lista de Materiais).
- Alinhar lê a genoma humano usando Bowtie1.1.2 permitindo que 1 corresponde (opções: -a -m 100 --best --strata -v 1), conforme instruções guia do usuário (Lista de Materiais).
- Execute ler alinhamento, contagem e resultar tarefas de compactação usando NGSPERL, conforme instruções Guia do Usuário.
- Converter tabela de contagem exportado para um arquivo de planilha.
- Normalize lê de uma classe específica (por exemplo, miRNAs) ao número total de leituras para essa classe (por exemplo, o número total de miRNAs lê) e sinais de relatório como Lê miRNA Per mapeada (RPMM). (Por exemplo, RPMM = (miR-X / Número total de miRNA lê) * 1.000.000).
- Entrada normalizada tabela de contagem de como a tecnologia única cor genérico para software de baixo nível e diferencial de alto nível analisa como por instruções guia do usuário (Lista de Materiais).
NOTA: Atualmente, existem genes de limpeza não bem caracterizados / SRNComo para o HDL-sRNA. Um controlo de pico-em podem ser usados, mas pode ser problemático. Normalizando para HDL entrada de proteína total ou volume é aconselhada. Mais importante ainda, é recomendado para validar os resultados de sequenciação de uma das várias estratégias para quantificar miARNs e sRNAs utilizando PCR em tempo real ou PCR quantitativo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Este protocolo é uma série de métodos estabelecidos ligados em conjunto para permitir a quantificação de HDL em sRNAs altamente pura por sequenciação de alto rendimento ou PCR em tempo real (Figura 1). Para demonstrar a viabilidade eo impacto deste protocolo, HDL foi purificada a partir de plasma humano pelo conjunto método DGUC e FPLC. As fracções recolhidas correspondentes a FPLC de HDL (colesterol) por distribuição foram concentradas e o ARN total foi isolado a partir de 1 mg de HDL (proteína total). srna bibliotecas foram gerados com HDL recolhida a partir de n = 4 indivíduos humanos saudáveis. Todas as amostras de sangue / plasma humanos foram coletados sob ativo protocolo Institutional Review Board (# 070416), e seres humanos foram recrutados com o consentimento informado aprovado pela Vanderbilt University School of Medicine. bibliotecas Srna preparados foram sequenciados na Vanderbilt Technologies para Advanced Genomics (VANTAGE) do centro de sequenciamento de DNA e de dados análises foram realizadasutilização de gasodutos internos. visualizações de dados foram criados por gráficos de software.
A necessidade crítica para executar um segundo método (FPLC) para o isolamento de HDL após DGUC é devido à possibilidade de co-purificação de EVs. EVs são uma classe generalizada de vesículas derivadas de membrana que se originam de corpos multivesiculares (exosomes), membrana plasmática de brotamento (microvesículas), e outros processos, incluindo corpos apoptóticos 10. VE, isto é, exossomas, têm sido relatados para ter uma densidade semelhante à HDL pequenas (Figura 2A), e, portanto, pode estar presente na fracção de densidade de HDL (1,063-1,21 g / ml) após DGUC 11,12. Para remover EVs e outras lipoproteínas (por exemplo, LDL), a partir DGUC-HDL, FPLC foi usada para HDL separado de outras vesículas e partículas por tamanho; HDL (7-12 nm de diâmetro) e VE (40-220 nm de diâmetro) são facilmente fraccionado devido às suas diferenças de tamanho (Figura 2A, B). fracção de HDLs foram facilmente evidente, devido à distribuição de colesterol, e as fracções de FPLC DGUC-HDL foram reunidas e concentradas utilizando filtros de centrifugação de 10 kDa de corte. Concentrado de HDL foram recolhidos e utilizados para análise do RNA a jusante (Figura 2B). Para ilustrar este ponto, plasma pré-DGUC foi fracionado utilizando FPLC e a distribuição de fosfolipídios (fosfatidilcolina, PC); colesterol total (CT), e os níveis de proteína foram quantificadas e representada graficamente através fracções. PC, TC e proteínas níveis foram quantificados utilizando três kits colorimétricos. Todos os três parâmetros definidos claramente as frações HDL (19 - 24) e frações VLDL / LDL (14 - 18). No plasma de FPLC-fraccionado, os sinais de proteínas e lípidos foram minimamente detectado ou não foi detectada em todas as fracções correspondentes a vesícula de tamanho superior a VLDL (à esquerda da caixa de laranja) (Figura 3A). Para demonstrar a separação de HDL DGUC, DGUC-HDL também foi fraccionado por FPLC e o PC, TC, e os níveis de proteínas foram quantifIED (Figura 3B). Traçando estes valores ilustra a co-fraccionamento de uma pequena quantidade de LDL usando DGUC e reforça a necessidade de utilizar a abordagem em tandem DGUC-FPLC para isolar HDL altamente pura. Embora os VE são previstos para co-fraccionar com HDL durante DGUC, houve pouca ou nenhuma encontrada no lípido e proteína em fracções correspondentes a vesícula tamanhos superiores de LDL (Figura 3B). O lípido EV e assinatura de proteína na gama de tamanho previsto também é minimamente detectável ou ausente do DGUC-VLDL e LDL-DGUC quando fraccionadas por FPLC (dados não mostrados). Para a análise de ARN, o ARN total foi isolado a partir de 1 mg de HDL em tandem purificado por sRNA geração da biblioteca. Resumidamente, os adaptadores foram ligados à extremidade 3 'e, em seguida, extremidades 5' dos terminais de sRNAs, incluindo miARNs e DDCs (Figura 4A). produtos ligados foram transcritas inversa (RT) e PCR amplificado utilizando iniciadores de PCR que albergam os índices específicos concebidos para amostras de multiplexação durante Downstream reacções de sequenciação (Figura 4A). Cada adaptador é de 61 nts de comprimento; por conseguinte, um miARN ligado (cerca de 22 nt de comprimento) que produzem um produto de 144 nt de comprimento. Muitos miRNA não-sRNAs são ligeiramente mais longo do que miRNAs (por exemplo, 30 - 35 nts de comprimento). Como tal, a nossa comprimento alvo do produto foi de 156 pb de comprimento. Os produtos amplificados foram usando um seletor de tamanho de DNA automático e todos os produtos de cDNA 135 selecionados-size - 177 bps de comprimento foram recolhidos (Figura 4A). As qualidades de bibliotecas seleccionadas de tamanho foram avaliadas por chips de DNA de alta sensibilidade, utilizando o Bioanalyzer (Figura 4B). bibliotecas de cDNA sRNA deste tamanho apareceu um pouco maior em tamanho devido à possível "borbulhando" efeitos durante a análise. Para a sequenciação multiplexado, concentrações equimolares de bibliotecas de ADNc foram reunidas, limpo, concentrada, e novamente analisadas utilizando a Bioanalyzer (Figura 4B). A amostra foi então multiplexados sequenced usando um único protocolo bp ler 50. Na casa de pipelines de análise de dados foram usadas para demultiplex amostras com base em índices, a guarnição adaptadores, as métricas de controle de qualidade executados, alinhe ao genoma humano e contar sRNAs anotados. A distribuição de normalizada lê (Lê por milhão, rpm),> 16 nts em comprimento, ilustram o enriquecimento de sRNAs 20 - 22 NTS de comprimento e 34 - 35 NTS em comprimento sobre o HDL (Figura 4C).
Alinhamento e análise de contagem das quatro bibliotecas de HDL-sRNA constatou que 38% das leituras alinhando a regiões anotados do genoma humano foram miRNAs (Figura 5A). Igualmente abundantes (37%) foram sRNAs-derivados de tRNAs (TDR). sRNAs-derivados de RNAs variado (por exemplo, RNAs Y), rRNAs, smRNAs, snoRNAs, e longos RNAs não-codificantes (lincRNAs) também estavam presentes no colesterol HDL (Figura 5A). Após a normalização para o número total de leituras para cada classe, o top 50 mais abundante miRNAS (leituras por mapeada miRNA, RPMM, Figura 5B), DDCs (leituras por mapeada DDCs, RPMT, Figura 5C), e outros não-miRNA não TDR sRNAs (leituras por mapeada sRNA, RPMs, Figura 5D) foram organizados por heatmaps . Estes dados ilustram as semelhanças (por exemplo, o HDL-miARNs) e discrepâncias (por exemplo, DDCs) das espécies mais abundantes de HDL-sRNAs entre os indivíduos saudáveis (Figura 5B-D). Estes resultados demonstram o poder desta estratégia e protocolo para fornecer insights notáveis para o transporte de sRNAs por HDL. No entanto, sRNA sequenciamento não deve ser invocado para quantificação absoluta. sRNAs de interesse devem ser validadas por PCR em tempo real. Da mesma forma, muitos pesquisadores só podem exigir a quantificação dos miRNAs individuais em HDL. Como tal, RNA total foi isolado a partir de HDL cada sujeito para a quantificação relativa de HDL-miARNs utilizando PCR em tempo real. Cinco dos miRNAs mais abundantes detectados no HDL por sRNAseq foram utilizados para a reaPCR l de tempo para determinar os seus níveis em cada amostra de HDL (Figura 5E). Os valores quantitativos relativos foram calculados usando uma arrumação arbitrária do Ct de 32 (RQV = 2 - ΔCtArb) e normalizadas para 1000 ug de proteína de entrada de HDL no isolamento de ARN 13. Os resultados do estudo de PCR em tempo real demonstrar que este protocolo é também valioso na detecção de níveis de HDL-miARNs e quantificar as diferenças entre os indivíduos. Coletivamente, os esquemas apresentados definir os detalhes críticos dos métodos, e os resultados de ambos sequenciamento de alto rendimento e em tempo real abordagens de PCR representam os resultados deste protocolo.
Figura 1. Representante Fluxograma do protocolo. HDL puro é isolado a partir de ultracentrifugação de gradiente de densidade e Chromatog líquida rápida de proteínas raphy. Total de HDL RNA pode então ser utilizada para RNA pequeno (sRNA) sequenciamento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Isolamento de HDL. (A) Gráfico da densidade e diâmetro de lipoproteínas e vesículas extracelulares (EV). (B) Esquema de sequencial isolamento conjunto HDL, incluindo a separação do plasma, ultracentrifugação em gradiente de densidade (DGUC), fast-proteína cromatografia líquida (FPLC), filtração e concentração. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
pload / 54488 / 54488fig3.jpg "/>
Figura 3. Fast-Protein Liquid Chromatography (FPLC) A separação de lipoproteínas EV, vesículas extracelulares.; VLDL, lipoproteínas de muito baixa densidade; LDL, as lipoproteínas de baixa densidade; HDL, as lipoproteínas de alta densidade; FP, proteína livre; PC, fosfatidilcolina; e TC, colesterol total. linha vermelha, TC; linha azul, proteínas e linha preta, PC. Separação de lipoproteínas de (A) plasma humano antes de ultracentrifugação em gradiente de densidade (DGUC) e (B) fração HDL após DGUC. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. geração de pequenos RNA Bibliotecas. (A) Esquema de RNA pequeno (sRNA) biblioteca de construção e tamanho-selecção. miRNA, microRNA; TDR, sRNAs tRNA derivado; sRNA, non-miRNA não TDR sRNAs; RT, a transcrição reversa; bp, par de bases; e de cDNA, DNA clonado. (B) Análise de bibliotecas de HDL-Srna antes e depois de multiplexação usando chips de DNA de alta sensibilidade e Bioanalyzer. (C) distribuição de comprimento de HDL-sRNA lê após o seqüenciamento. RPM, Lê por milhão; M, indivíduos do sexo masculino; F, indivíduos do sexo feminino; e NT, nucleótidos. N = 4. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. A diversidade de HDL-sRNAs. (A) Distribuição de HDL-sRNAs entre classes Srna. Fração de lê alinhado com sRNAs anotados no genoma humano. (BD) Heatmaps N = 4 amostras de HDL-Srna.
| 1. Agentes anti-oxidantes para a separação lipoproteína | Fazer a solução estoque em 100x |
| EDTA | ácido etilenodiaminotetracético (estoque 0,5 M) |
| AZT | 3-amino-1,2,4-triazole 42 mg / mL de H2O |
| BHT | Hidroxitolueno butilado: 25 mg / 100 mL de EtOH |
| Trolox | (+) - 6-Hidroxi-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxílico: 41,7 mg / 500 mL de EtOH |
| 2. Soluções de sobreposição | |
| Solução # 1 | 1,019 g / mL em H2O |
| Solução # 2 | 1,025 g / mL KBr / H2O |
| Solução # 3 | 1,063 g / mL KBr / H2O |
| Solução # 4 | 1,080 g / mL KBr / H2O |
| Solução # 5 | 1,255 g / mL KBr / H2O |
| 3. Tampão de FPLC | </ Tr> |
| 1 L Receita | 50 ml de NaCl 3M; 20 mL de 0,5 Tris-HCl, pH 7,6; 2 ml de 10% de azida de sódio; 930 mL de H2O |
Tabela 1. reagentes especiais.
| Etapa | Temp (° C) | Tempo | Cycles |
| UMA | 98 | 30 s | 1 |
| B | 98 | 10 s | 25 |
| 60 | 30 s | ||
| 72 | 15 s | ||
| C | 72 | 10 min | 1 |
Mesa 2.Biblioteca Geração de amplificação etapas.
| cartilha | Seqüência |
| Primer 1.1 | AATGATACGGCGACCACCGAGAT |
| Primer 2.1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGA |
Tabela 3. Os iniciadores de PCR.
| Etapa | Temp (° C) | Tempo | Cycles |
| UMA | 95 | 10 min | 1 |
| B | 95 | 10 s | 40 |
| 60 |
Tabela 4. Biblioteca Quantificação de amplificação Passos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo é concebido para quantificar miARNs e outros sRNAs por sequenciação de alto rendimento ou PCR em tempo real sobre o HDL altamente pura. Tal como acontece com qualquer abordagem, considerações especiais deve ser dada para cada passo no processo de purificação de HDL e de ARN e, em seguida quantificando sRNAs. Este protocolo é projetado para projetos começando com ≥ 2 mL de plasma. No entanto, análises de ARN de elevada qualidade pode com sucesso ser completado com HDL purificada a partir de tão pouco quanto 80 ul de plasma humano ou de rato utilizando cromatografia de afinidade; no entanto, maiores volumes de plasma de partida produzir melhores dados usando os métodos apresentados aqui. métodos de processamento e extração de amostra podem alterar drasticamente a qualidade miRNA / sRNA e rendimento. O uso de anticoagulantes, embora essencial para a coleta de plasma, provavelmente afeta extracção a jusante. Por exemplo, a heparina não pode ser facilmente removido durante a extracção de ARN 14,15, e pode inibir a jusante enzimas utilizadas em PCR 16-18. Além disso, There são os relatórios que o citrato de sódio pode também interferir com as medições qPCR onde miRNAs a partir de amostras de EDTA são mostrados ter melhorado o perfil de expressão em comparação com amostras de citrato de sódio 16,19,20. Estes estudos demonstram a necessidade de uma análise cuidadosa na escolha de um anticoagulante. Além disso, devido ao aumento do potencial para a lise celular durante a coagulação, as amostras de soro não são recomendados como miARNs celulares lisadas artificialmente podem associar com lipoproteínas. Da mesma forma, o plasma é imediatamente idealmente isolado a partir de sangue total para evitar a contaminação a partir de outras células do sangue periférico, incluindo leucócitos lisados. Como temperatura fria é amplamente conhecido para afectar a activação das plaquetas, as amostras de sangue total são fiadas longe de eritrócitos, leucócitos e plaquetas a 3000 xg durante 15 min à temperatura ambiente. A hemólise é também mal recomendado como eritrócitos rompidas foram relatados para influenciar também miARN 21,22 resultado, uma vez que contêm miARNs que pode ser derramado durante hemolysis 23,24. O plasma pode ser então armazenada a 4 ° C durante 2 - 4 semanas, ou, alternativamente, o plasma pode ser congelado a -80 ° C, em que o conteúdo de miARN é estável e viável tanto a curto prazo e armazenamento a longo prazo (máximo 4 anos) 25. Para nosso conhecimento actual, congelando as amostras de plasma não está previsto para prejudicar HDL-miARNs e as amostras de plasma congeladas são adequados para analisar. Como lipoproteínas e outros componentes de sangue total pode ser afectada pela ingestão de alimentos, prefere-se a colheita de sangue em jejum.
Como mencionado acima, o HDL no plasma pode ser isolado através de uma série de métodos padrão, incluindo DGUC, FPLC e cromatografia de afinidade contra a apoA-I. . Isolamento de lipoproteínas do plasma por DGUC usando KBr, tal como descrito por Redgraves et al 26, separa VLDL (d = 0,94-1,006 g / ml), colesterol LDL (d = 1,006-1,063 g / mL) e HDL (d = 1,063-1,21 g / ml) e é um método ideal para grandes volumes de plasma (2 - 60 ml por amostra). a limitaçãoa utilização desta abordagem é que por si só exossomas e outros miARN contendo VE são relatados para ter uma densidade semelhante à HDL e pode estar presente em HDL DGUC (Figura 2A). Outras desvantagens incluem a possibilidade de danos estruturais em proteínas de exposição de sal elevado em tampões e forças de ultracentrifugação forte, bem como as estabilidades diferenciais de HDL sub-classes 27,28. Apesar disso, DGUC é comumente utilizado, uma vez que resulta em um rendimento elevado de proteína de HDL, produzindo cerca de 1 mg de proteína de HDL por 1 mL de plasma 29. A abordagem de FPLC, que envolve a filtração em gel por exclusão de tamanho, requer menos tempo, dependendo da taxa de fluxo (aproximadamente 6 horas), e tem uma maior precisão de separação HDL de apoB-contendo lipoproteínas (por tamanho) e os seus sub-classes, incluindo os VE que são muito maiores do que a HDL, mas tem densidades semelhantes. Deve notar-se que utilizando os métodos descritos no presente protocolo, vesículas plasma entre cerca de 220-75 nm de diâmetro não fazereliciar uma assinatura lípido ou proteína detectável quando separada por FPLC. Dependendo do set-up, FPLC requer entrada relativamente pequena, 0,3-1 mL, o que é útil para o plasma de roedores e pequenas alíquotas congeladas. ensaios de colesterol colorimétricos rápidas também são importantes seguinte FPLC para confirmar a distribuição de HDL ou outras fracções de lipoproteínas. Fraccionamento dilui amostras e lipoproteínas; No entanto, as amostras podem ser, em seguida, concentrou-se utilizando filtros centrífugos size-padrão (por exemplo, de 10 kDa de PM de filtro). isolamento HDL por apoA I-IP utilizando colunas de spin micro são a mais rápida das três abordagens, mas são limitados pela baixa entrada (0,08-1 mL) de volume e baixo rendimento (aproximadamente 0,1 mg). Enquanto apoA-I IP pode ser trabalhoso, este método é ideal para sobrenadantes de cultura de células de baixo volume. Embora cada um desses métodos tem pontos fortes e fracos, estes podem ser reduzidos se forem utilizados em conjunto (por exemplo, DGUC seguido FPLC). Usando duas abordagens em conjunto, resulta em uma maior pureza deHDL para análise miRNA e sRNA.
Aqui, nós detalhado dos passos necessários para isolar HDL altamente puro, utilizando o método em tandem de DGUC seguido por FPLC e descrito os passos usados para quantificar o HDL-miARNs e sRNAs utilizando quer sequenciação de alto rendimento ou PCR em tempo real. Embora este protocolo foi projetado para HDL, tem grande aplicabilidade na quantificação sRNAs em outras lipoproteínas, incluindo LDL e VLDL, com base em suas densidades e tamanhos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3x FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45 µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
References
- Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Haussecker, D., et al. Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing. RNA. 16, 673-695 (2010).
- Li, Z., et al. Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs. Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).
- Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).
- Maute, R. L., et al. tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).
- Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).
- Smith, P. K., et al.
- Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences. Source Code Biol Med. 9, 8 (2014).
- Vickers, K. C., Remaley, A. T. Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication. Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).
- Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods. Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).
- Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion. Nat Commun. 6, 7164 (2015).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens. Biotechniques. 23, (1997).
- Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).
- Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis. J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).
- Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).
- Bai, X., et al. Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients. J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).
- McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume. Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circ Res. 107, 677-684 (2010).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, e24145 (2011).
- Kannan, M., Atreya, C. Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs. Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).
- Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS One. 3, e2360 (2008).
- Balzano, F., et al. miRNA Stability in Frozen Plasma Samples. Molecules. 20, 19030-19040 (2015).
- Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
- Cheung, M. C., Wolf, A. C. Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations. J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).
- Kunitake, S. T., Kane, J. P. Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge. J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).
- Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. J Extracell Vesicles. 4, 26533 (2015).
