Summary
倍数性操作のための修正されたプロトコルは、初期胚に細胞質分裂における1サイクルのストールを誘導するために熱ショックを使用しています。このプロトコルは、ゼブラフィッシュで実証されているが、他の種にも適用可能です。
Abstract
倍数性の操作は、このような二倍体に四倍に二倍体、または半数体として有用な変換を可能にします。それは、単一のヘテロ接合母親からホモ接合体の直接的な生産を可能にするため、ゼブラフィッシュゼブラフィッシュでは、具体的にホモ接合雌性発生二倍体の生成は、遺伝子解析に有用です。この記事では、まず、細胞周期、熱ショック2（HS2）中の熱パルスに基づいて、倍数性の複製のための修正されたプロトコルについて説明します。中心小体の複製の阻害を介して、この方法は、第2の細胞周期の間に正確な細胞分裂停止をもたらします。影響を受けていないDNAの複製に結合された正確な1サイクルの分割ストールは、全ゲノム重複が生じます。この方法に関連したプロトコルは、1細胞周期の分裂遅延と倍数性の重複を引き起こすために体外受精や熱パルスで 、卵と精子コレクション、精子のUV処理が含まれます。このプロトコルの修正バージョンを適用することができます他の動物種における倍数性変化を誘導します。
Introduction
このプロトコルは、雌性発生半数体（ 図1）または四倍の生産からホモ接合雌性発生二倍体の世代のようにゼブラフィッシュ胚における倍数性の操作を可能にします。これは、正確に1つの細胞周期（ 図2A、2B）に対応する細胞質分裂の遅延を誘導することによって達成されます。細胞質分裂において重要な1サイクルの遅延がヒートショックで処理することにより達成されます。もともとStreisingerらによって記載されるように熱ショック（HS）の標準プロトコルは、最初の細胞周期1の間に1サイクル細胞分裂停止を生じ、期間13-15 MPF時の温度パルスを含みました。このプロトコルの効率は、最近、熱ショック処理のスライディング時間窓を用いて初期の細胞周期をスキャンすることによって改善されています。このスキャンは、まだ最初の細胞周期（22-24 MPF）内で、熱ショックのための後の時点を同定し、そのEMBRの高いレートでの結果この場合、第2の細胞周期2に影響を与える1サイクル細胞分裂停止とYOS。最初の細胞周期中の実験操作は、第二の細胞周期の間に細胞分裂を妨害し、DNAにコンテンツの複製を引き起こす観察は、他の魚種3,4に報告されています。用語「2」熱パルスが標準HS法よりも後の時点で発生すること、およびHS2によって引き起こされる細胞周期の遅延は、第二の細胞周期の間に発生することを反映する - 私たちは、熱ショック2（HS2、この修正されたプロトコルを参照します）。これらの研究は、熱ショック後に細胞質分裂停止のための基礎は、以下の細胞周期における紡錘体形成および溝誘導に影響を与える熱パルス、中中心小体複製の阻害であることが示されました。 HS2の100％に近づいて細胞周期停止の収量の結果、および標準HS 2の4倍の倍数性複製アップの速度。
胚扱わウィットHA割球の細胞周期の間の熱ショックは、熱ショックが細胞分裂2に必要な複数のプロセスに影響を与えることを示唆し、多くの有害な効果を示します。熱ショックは、細胞周期（期間0~30 MPF）の開始前に印加された場合に、中心小体の複製を有する特定の干渉と一致効果を有することが表示され、他の必須の細胞プロセス2に影響を与えていないよう。これらの研究は、前割球の分裂の開始までの時間は、具体的に中心小体阻害を介して倍数性を操作するためのツールとして、熱ショックを使用して、影響を受けやすい発育期間であるように思われることを示しました。中心小体複製の熱ショックの見かけの選択性の根底にある原因は不明であるが、白血球5などの特定の細胞型において熱応力下で観察中心体サブ構造の選択的分解に関連し得ます。
胚ドの時間同期velopmentは、体外受精（IVF）によって達成されます。 HS2に誘導される1サイクル分裂ストール時に四倍になる二倍体胚における受精の結果の間に未処理の精子の使用。そのDNAを不活性化架橋、1サイクルの細胞質分裂のストールは雌性発生二倍体2となっHSIIによって誘発される時に雌性発生半数体胚6、中に結果を運ぶUV処理精子の使用。そのため、得られた全ゲノム重複の、後者の雌性発生二倍体は、ゲノム全体のすべての単一の遺伝子座でホモ接合性です。簡潔にするために、我々は「半数体」、および「ホモ接合二倍体」としてのホモ接合雌性発生二倍体胚として一倍体胚を雌性発生を参照してください。実行可能な肥沃な場合は、ホモ接合二倍体は、滅菌および致死性のない行を開始するために使用することができます。 HS2により誘発される直接的なホモ接合も容易にMUTのヘテロ接合キャリアである雌からホモ接合二倍体以来、遺伝子解析や遺伝子スクリーニングに組み込まれるべきです高い固定でのホモ接合性のations展示率（50％）比2。
以下のプロトコルは、HS2を実行し、完全なホモ接合性と倍数性の重複を誘導する手順を説明します。四倍体製造のために、精子の解決策は、未処理でなければなりません。ホモ接合二倍体を製造するために、精子は、UV処理により不活性化されるべきです。また、議論で説明したように、目に見える色素マーカーはまたホモ接合二倍体の識別を容易にするために使用することができます。最良の結果を得るためIVF手順はこの期間内に発生する必要がありますので、主に光のサイクル7、および両方の大人と卵の開始の最初の3時間の間にゼブラフィッシュの仲間は、概日リズム8に敏感です。
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Protocol
マディソン・機関動物実験委員会（IACUC）ガイドライン（ウィスコンシン大学 - - マディソン保証番号A3368-01）全ての動物実験は、ウィスコンシン大学に従って行いました。
1.中断交配を経て卵コレクションのための女性の選択
注：IVFベースのプロトコルは、手動圧力〜9人の女性からの成熟卵の押し出しに依存しています。前のプロトコルは、卵の放出挙動を受け、女性ずにタンクから、またはペアの交配で直接メスを使用していたが、（ゼブラフィッシュラインに依存して約20％以下、）これらの雌の小部分のみが手動圧力に押し出され、有能な卵をもたらします。改良された手順では、メスは交尾の即時中断が続く直接目視によって産卵のために事前にソートされています。この手順では、ほぼすべての女性が押し出され、有能な卵この中断さ交配段階収率を介して予め選択、非常に有効です手の圧力に依存します。
- 実験前の午後には、標準的なゼブラフィッシュ交配ボックスで目的のゼブラフィッシュ株の交配のペアを設定します。まだ物理的に交配ボックス部門を介して、または、インサート内部の産卵インサートと女性の下で男性を置くことによってのいずれか、それらから分離された雌と同じチャンバ内で男性を保管してください。
- 交配が始まるように、実験の朝は、同じ産卵インサート内で男性と女性の両方を配置すること、物理パーティションを削除します。
- 視覚的に自然交配の間に卵の押し出しを検出するための交配のペアを含むタンクを点検します。卵押し出し、男女別の最初の兆候で繁殖を中断します。男性から分離した後、あらかじめ選択された雌別々にまたは同じタンクに貯留しておきます。 （一般的に50から150卵/女性）希望する胚の数に応じて複数のメスを使用してください。
2.精子ソリューションの準備
注：IVF R精子溶液に成熟卵の暴露にelies。このソリューションは、（HS2の処理時にホモ接合二倍体胚になる）一倍体接合体を生成するために、二倍体（HS2の処理時に倍体胚になる）接合体またはUV処理を生成するために、未処理することができます。前精子調製プロトコールは、ライブ男性の肛門領域から白子を収集するために、毛細管の使用を提案したが、男性のごく一部が白子9を得たので、これは無効なプロセスでした。以下に提示プロトコルは、より信頼性の高い結果をもたらす剪断さ解剖精巣から精子の準備、上の代わりに依存しています。
- 重炭酸ナトリウム溶液（溶液6）を除くすべての成分（溶液1、2、4および5）を含むハンクスプレミックス溶液として前もってハンクス溶液を調製します。実験（ 表1）の朝を解決6新鮮を準備し、プレミックスに追加します。ハンクス液（最終溶液を作製するために、朝の準備IVF手順）、ハンクスプレミックスの990 ULおよびたての解決策6の10μLを兼ね備えています。
- エアコン水中の0.016パーセント溶液としてトリカインするために露出オーバーにより男性を安楽死させます。
- 水中の0.2％の原液としてトリカインを準備（1MトリスpHは9.0でpH7.0にバッファー）と4℃で保ちます。ビーカー内の水100mlあたりトリカイン原液の8ミリリットルを追加し、トリカイン溶液に男性を転送するためにネットを使用しています。
- （100μL/クラッチで10クラッチを肥やすために、1ミリリットルハンクス液に回収10人の男性から例えば精巣）オスあたり100μlに対応するハンクス液の容量で受精するために必要なクラッチごとに1人の男性のための精巣と同等のものを使用してください。
- 15分間の鰓運動の停止によって安楽死を確認してください。安楽死の後、スプーンでビーカーから男性を削除します。馴化水で簡単に男性をすすぎ、のいくつかの場所に簡単にそれらを置くことによって、それらを軽く乾燥ペーパータオル。
- 精巣、解剖ハサミやカミソリの刃を使用して最初の首をはねる安楽死させ、男性を削除し、その反射光を光源とscissors.Underに解剖顕微鏡を解剖と腹部に沿った長手方向のカットを行い、解剖鉗子で内臓を削除します。鉗子で精巣塊のそれぞれを引き出し、ハンクス溶液を含むマイクロ遠心チューブ内に配置します。
注：精巣は、排出腔付近に収束する2つの細長い本体の壁と一緒に見つかった半透明の外観の構造とのそれぞれとして同定することができます。精巣は、解剖後にペトリ皿の表面上およびハンクス溶液中でそれらを配置する前に2-3分滞在することができます。 - 気泡の形成を回避しながら、狭いへらおよび/または穏やかにピペッティング1,000μlの先端マイクロピペットを用いて溶液中のダウン5-6回精巣と精巣を剪断することによって溶液中に精子をリリース。精巣の破片の沈降をしてみましょう。
- それは、最大2-3時間、その効力を保つことができる氷で精子液を、保管してください。精子液のUV処理に進む場合は、背後にある精巣の作品を残してきれいなマイクロ遠心チューブにソリューションを移します。
3. UVトリートメント
注：UV処理は、胚におけるそれを非アクティブにするために精子DNAを架橋するために使用されます。雌性発生半数体またはホモ接合雌性発生二倍体胚を製造する場合、このステップにのみ使用されます。大きな破片がUV処理から精子を保護することができるようにUV処理のための精子のソリューションは、精巣（ステップ2.4）の断片から分離する必要があります。
- 氷のベッドの上に座って、うつ病のガラス板のクリーン、ドライウェル（ペトリ皿の内側例えば氷）に精子のソリューションを転送します。よくガラス板あたりの精子溶液1mlまで使用してください。
- UVランプの下で氷のベッドの上でうつ病のガラス板を配置することにより、UVへの精子のソリューションを公開します。 115 V（60 Hzで90秒間精子ソリューションを扱います、0.68A）19センチメートル（7.5インチ）の距離でUVランプ。ピペットチップの先端で、軽く（30秒ごとクリーンピペットチップを使用）UV処理中に30秒ごとに溶液を混合。
- きれいなピペットチップやマイクロピペットを使用して、新しいマイクロチューブに処理された精子のソリューションを転送します。 IVFのために必要となるまで氷上にストア（もはや抽出2から3時間以上）。
成熟した卵のマニュアル4.押出
注：自然交配の中断によって得られた女性は容易に麻酔と手動圧力の下で卵が得られます。この手順の間、トリカイン処理は慎重に、女性の回復を防止することができる露出オーバーを回避するように制御する必要があります。
- トリカイン溶液への露光によりメスを麻酔：ネットでの転送女性は魚停止するまで、約2〜5分間（馴化魚の水100ミリリットルにトリカイン0.2％原液の8ミリリットルを添加することによって製造）の馴化水溶液をトリカインします鰓運動。 <李は>とすぐに女性が鰓移動を停止するように、それを収集し、簡単に馴化水でそれを洗うためにスプーンを使用しています。それでも清潔で乾燥した直径10cmのペトリ皿に移すその後、ペーパータオルのいくつかの場所に簡単にそれを繰り返し配置することによって、軽く乾かし、魚を移動するためにスプーンを使用して。潜在的鰓蓋の損傷を避けるために、後方方向に前方でスプーンで魚に近づきます。
- 途中で水によって活性化されることからリリースされたすべての卵を防止するために、優しく、さらに肛門フィン面積を乾燥させるためにラボワイプや軟部組織を使用してください。 、（魚の鱗に付着し、それらを避けるために）支持体としての女性の背中に片手の指一本を置き、卵が押し出されになるまで、他の手の指で女性の腹部に沿ってわずかな圧力を適用し、水で軽く指を湿し。
- 女性の体から卵を離れて移動するために狭いへらを使用してください。回復のための馴化水でタンクに戻って女性を置きます。
- （水曝露に）アクティブにして、押出後同時に、90秒以内（精子溶液添加で）卵を受精（第5節参照）。
体外受精5.
注：自然交配でのゼブラフィッシュ受精は、外部交配時の卵の水と精子による同時リリースと活性化に依存しています。水の存在下で精子溶液に卵を公開することによって、体外受精の模倣では、このプロセス。水の量は、効果的な精子の濃度を増加させるために、（1 ml）をもともと小さいです。精子によって結合は15-20秒10内で発生します</ SUP>、及び水の量は、その後、増加させることができます。絨毛膜は、精子が11,12を結合するための能力のためのウィンドウを制限することにより、クラッチの近く同期へのさらなる貢献を持ち上げます。得られた胚は、したがって初期の切断段階大きく同時細胞分裂周期を示します。
- ペトリ皿で押し出した卵のクラッチに - （パート2を参照してください男性1から精巣の同等に相当）精子溶液100μlを加えます。静かに卵の損傷を避けるために、ペトリ皿の表面から先端を持ち上げないようにしてくださいされて、一緒に精子と卵を混合する卵の中で精子のソリューションを追加するために使用されるピペットチップを旋回させます。
- すぐに胚の培地の1ミリリットル（E3）溶液を添加し（エアコン水が部品5〜7におけるE3の代替品としても可）し、再び静かに静かにピペットチップで旋回することにより卵と精子を混ぜことで卵を活性化させます。受精への相対的なタイミングを開始するためにタイマーを起動します。 1ミリリットルの容量で1 MPFでは、E3でプレートをあふれさせます。続行する前に、完全絨毛膜の拡大を含む卵活性化を可能にするために10月12日MPFまで邪魔されないままにしておきます。
6.ヒートショック療法
注：初期胚に適用される熱ショックは、その後の細胞周期2の間に紡錘体形成を駆動するために中心小体の不完全な補数で、その結果、中心小体の複製を阻害します。畝間形成13の欠如でターン結果にスピンドルの不在。
- 絨毛膜（10-12 MPF）の拡大した後、茶こしにペトリ皿から胚を注ぎます。茶こしに残っている胚を収集するために、E3での洗浄ボトルを使用して、ペトリ皿をすすぎます。
- 28.5℃のE3で予備加熱した浴中でビーカーの内側胚と茶こしを置きます。水浴温度にビーカーとE3を事前に平衡化し、十分なE3があることを確認しているので、茶内のすべての胚ストレーナは、媒体にさらされています。
- 22 MPFでは、簡単に、28.5℃の水浴から茶こしを削除余分な水分を除去するためにペーパータオルの上にブロットし、41.4℃の熱浴でも同様に予熱E3ビーカーの内側に配置します。
- 24 MPFでは、簡単なブロッティング後に28.5℃の水浴に戻っE3に茶こしを転送します。 29 MPFでは、10センチメートルペトリプレートに茶こしから胚を転送するためにE3で洗浄ボトルを使用します。
ワンサイクル質分裂のストールと胚7.選択
- 期間35-45 MPF中は、送信光源と解剖顕微鏡下で、2細胞期に対称的切断を受けているため、受精されているものの胚を選択します。細胞分裂を受けていない胚を削除します。
- 最初の細胞周期の間、正常な細胞分裂のために選択された受精胚を、観察し続ける、と秒の間に二の細胞周期（50-65 MPF）。
- 4細胞（「ノーストール」、2：4細胞期胚のための2の配置標準）以下のカテゴリー（ 図2C）に従ってソート胚; 3細胞（異常2より小さいセルにおける「部分ストール」、：1大型セル配置）。 2細胞（2細胞期胚と同一の1構成胚1における一細胞周期の遅延を示し、「ストール」）。新鮮なペトリ皿にストールした胚をソートします。
注：この段階では、2胚：2配列は、第二の細胞周期の間にも割球は、細胞分裂の停止を受けたものに対応します。異常な2より小さいセルにおける胚：1大型セルの配置は、熱ショックが1割球に第二の細胞周期の間に細胞周期のストールを引き起こしたが、他のないところものに対応します。胚1の「ストール」：1の構成は、第二の細胞周期の間に両方の割球は、所望の細胞分裂を受けた場合、それらに対応しますストール。ストールした胚は、次の細胞周期期間（65-80 MPF）中に細胞分裂を再開する必要があります。割球の配置は、スピンドル2,14を安定化するために、ほとんどの胚は、正常な発達を受けることができる比較的正常胞胚を形成することにより、前の細胞周期からの不完全な合図に、可変であってもよいです。 - 胚は10cmプレート当たり80胚の限界で、ペトリ皿に開発することができます。 24 HPFで、それらは減少軸延長とは対照的に、二倍体、またはホモ接合の二倍体胚6（軸拡張子（ 図3A、3C）の正常範囲）の正常な形態特性を有しており、半数体の増加した本体厚特性かどうかを決定するために胚を観察します（ 図3B））、および/またはそのような金色やアルビノおよび他のそのようなアッセイのような36 MPF、（ 図3および下記参照）2,6,9-で遺伝顔料マーカーを使用して二倍体化を評価します。 半数体の形態を有するように見える任意の胚を削除するか、それが溶解している、または他の肉眼的に異常な欠陥を示します。
注：必要に応じて、日常的に溶解されたか、ひどく異常な胚を除去し続けるとメディアをリフレッシュするために、新鮮なE3を加えながら胚は、5日後に受精まで開発することができます。注：生存した胚はまた、孵化場のシステムに転送し、標準的な条件の下で供給することにより、5日目に浮袋膨張後に成長させることができます。
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Representative Results
一細胞周期の分裂の停止にもかかわらず、DNA複製は、胚（ 図1）のDNA含量の複製をもたらす、そのような胚において通常起こります。 Streisinger熱ショックプロトコル（標準HS）は、期間13から15分のポスト受精（MPF）の間に熱パルスを伴い、派生方法は、ここで説明したのに対し、35 MPF 1,2において第1胚細胞分裂の際に、主に細胞質分裂停止を誘導します、熱ショック2（HS2）と呼ばれる、MPF期間22-24中に熱ショックを使用し、50 MPF（ 図2; 2,3,4）における第二胚細胞分裂の間に細胞質分裂停止を誘導します。 24 HPFでは、胚の観察は、彼らが二倍体またはホモ接合二倍体胚の正常な形態の特性、または半数体胚の形態学的特性軸より短く、より広いボディを持っているかどうかを決定できるように（ 図3）
図1：受精タイプ。 （A）自然交配。雄と雌の配偶子は自然な二倍体で、その結果、未処理です。 （B）精子は、父系DNAと一倍体接合体の製造の破壊をもたらす、UVで処理されます。未処理の場合、このような半数体は、開発の過去の日2-3生存しません。熱ショック2（HS2）と半数体接合体（C）治療は、初期胚における有糸分裂の細胞質分裂の1サイクルを阻害します。この細胞周期のストール、カップル影響を受けていないDNA複製にdは、生存可能であり、肥沃な大人になることができるホモ接合二倍体を生成します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：HS2は、第二の細胞周期をストールすることにより、全ゲノム重複を促進します。 2-、4-、および8細胞胚に対応する最初の3つの細胞周期の間に、未処理の胚の（A）細胞開裂パターン。 （B）第二の細胞周期の間の細胞分裂の1サイクルストールにおけるHS2処理結果。ストール時には、二倍体（nは - > 2N）への半数体のいずれかから二倍体化を受けて胚における継続的なDNA合成の結果、または（2N - > 4N）四倍に二倍体（本文参照）。このストールした後、胚は、NEで、細胞分裂を再開しますWLY倍数性を獲得しました。の2配置特徴：2で、その結果、割球展示遅延もない：ⅰ）「ノーストール」：（C）HS2処理された胚は、割球は、第二の細胞周期の間に細胞分裂の遅れを示すかによって割球の様々なアレンジを示すことができます4細胞期胚、ⅱ）「部分ストール」：1の配置、およびiii）「ストール」：2割球の一方のみが異常な2で、その結果、遅延を示す1：両方の割球が1で、その結果、遅延を示します2細胞期胚の配置特性。 （A - C）では、核は核のサイズの拡大によって表される二倍体化イベントに、青色の円として表されています。細胞分裂のストールのための提案の基礎としてcentriolar挙動を示す図のための基準2を参照してください。 より大きなversiを表示するには、こちらをクリックしてください。この図の上。
図3：自然な二倍体、半数体およびgynogenotesの形態。 （A）の自然交配によって得られた二倍体の正常な胚の形態。 （B）半数体胚は短く、広い体軸を示します。 （C）ホモ接合二倍体は、正常な体形態を有します。胚は、さらに、親DNAの継承を追跡容易にするために黄金の色素沈着遺伝子に劣性突然変異を運ぶ：母親は、この遺伝子のために、野生型ホモ接合黄金における突然変異のためのキャリア、そして父親です。両方（ 黄金のための半接合）半数体および（ 黄金についてホモ接合）ホモ接合二倍体は、変異体の色素沈着を示すのに対し、このように、自然な二倍体、 黄金のためのヘテロ接合は、野生型の色素沈着を示します。スケールバー= 0.5ミリメートル。 reから変更されたパネルフェレンス2は 、許可を得て転載します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 溶液 | コンポーネント | 保管条件 |
| ハンクス液1 | 8.0 gでのNaCl、及び 0.4グラムのKClで100ミリリットルのddH 2 O | 4°Cの時ストア |
| ハンクス液2 | 0.358 gで無水のNa 2 HPO 4、および 0.6グラムのKH 2 PO 4 100ミリリットル中のddH 2 O | 4°Cの時ストア |
| ハンクス溶液4 | 0.72グラムのCaCl 2 50ミリリットルのddH 2 Oで | 4°Cの時ストア |
| ハンクス溶液5 | 1.23グラムのMgSO 4∙7H 2 O 50ミリリットルのddH 2 Oで | 4°Cの時ストア |
| ハンクのプレミックス | 次の順序で、追加します。 10.0ミリリットルソリューション1、 1.0ミリリットル溶液2、 1.0ミリリットル溶液4、 86.0ミリリットルのddH 2 O、および1.0ミリリットルソリューション5 | 4°Cの時ストア |
| ハンクス液6 | 0.33グラムのNaHCO 3 10ミリリットルのddH 2 Oで | IVF手順の新鮮な朝を準備します |
ハンクスソリューションの表1.準備。
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Discussion
重要なステップ
体外受精のに有効な条件下で動作することが重要です。成熟卵（ステップ1）の十分な供給を保証するために、交配用に設定雌は、少なくとも5日間交配交配に設定されているべきではないと妊娠を表示されます。繁殖の中断の間に、観察者は自然卵の押し出しの最初の出現のために十分15-30タンクを監視することができます。最初の卵は自然交配を通じてリリースされたときに、相手の中断は、ほとんどの卵がIVF手順のために、女性の内側に残ることを可能にするために、できるだけ早く行う必要があります。今成熟卵の手動押し出しの準備ができているこれらの女性が、その後の卵放出に対する明白な影響を与えることなく、最大2時間分離保持することができます。効果的な精子溶液（ステップ2）を調製するために、男性は堅牢で、理想的にゼブラフィッシュの雄の繁殖の特徴である赤みを帯びた色合いで表示されます。きれいな解剖は通常、レモを伴います本体の後部と、前方にそれを引いて浮き袋に向かってそれを引っ張ることによって、腸のトラックをレイムス。中央の内臓を除去した後、精巣、内部体壁の各側の横などの半透明の細長い塊が残ります。精子溶液に不要な器官（ 例えば 、腸）を含めないでください。必要に応じて、ハンクス溶液中に配置される前に、乾燥ペトリ皿の表面に働くことによって精巣からこれらを分離します。 IVF（ステップ4）の間に、高い受精率を達成するために、押し出された卵は、精子の添加までコンピ維持されることが必須です。受精のための有能な卵はわずかに黄色の色調を示し、半透明です。水は受精を排除します卵活性化と早期の活性化を誘発するので、精子の添加前に水との接触を持つ卵を避けてください。水の活性化と受精は卵の脱水を避けるために、女性から押し出しの90秒以内に発生する必要があり、その意志それらの分解につながります。必要に応じて、押し出された卵は17、0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）を補充したハンクス液の100から200μlの中（1.5時間またはそれ以上まで）長期間保つことができるこの特定の目的のためにハンクス液を調製する場合（、準備BSA補充の際に添加される水の含有量）を補正するプレミックス。卵はハンクスBSA溶液の助けを借りて、有能な保たれている場合は、マイクロピペットを用いて、卵から過剰ハンクスのBSAを除去し、1分以内に受精。
HS2を使用して、二倍体の成功のための重要なステップは、ストール胚（ステップ7）のソートです。対称的に2細胞胚を切断する最初のソートは受精になると（ - そのような胚は廃棄すべき35-50 MPFで1〜4細胞から直接、その移行胚におけるIVFの結果の間に時折二精）細胞分裂を開始した胚について選択します。細胞周期は、これらの初期胚世紀の間に15分ごとに発生します年齢（最初の細胞周期のために35-50 MPF、第二の細胞サイクルの50~65 MPFなど）ので、各細胞周期の最初の10分の間に切断胚の選別する周期と正確間のオーバーラップが存在しないことを保証細胞分裂停止の同定。
修正およびトラブルシューティング
初期の受精率だけでなく、その後のHSII治療の不在下での半数体の頻度をテストすることによって、必要に応じてステップ3でのUV処理の強度は、（ 例えば 、露光時間、ランプ電力、ランプまでの距離）を調整することができる：正確な量の半数体胚の100％が得られながら、UV露光は、受精率に顕著な効果を持っていない（二倍体胚から半数体を区別するために、 代表的な結果を参照してください）。不十分なUV暴露が原因トン二倍体胚を生成しながら、あまりにも多くのUV露光は、精子機能に有害な影響をおそらく減少した受精率を引き起こし精子DNAのO不完全な不活性化。
胚細胞開裂（工程7）の再開後に発達障害又は致死性を示す場合には、ステップ6において熱ショック温度は、胚の生存を増加させるために（ 例えば 、41.0℃）、わずかに減少させることができます。異常な3セルのほぼ等しい画分になると、第二の細胞周期の間に2細胞胚をストール（およびcentriolar複製への影響のためのしきい値の近くに、したがってある）の条件は、最小限のその後の発達障害を引き起こし、細胞周期の再開後の生存を増加させました。
彼らが開発する胚の直接観察は、種々の細胞周期を追跡することができますので、HS2の方法は、細胞分裂ストール（したがって、全ゲノム重複）を評価するための便利で本質的なメカニズムが組み込まれています。 1 - 細胞周期分裂ストールを受けた胚の手動選択は、二倍体胚の均一な集団を生成することができます秒。 HS2は、DNAの複製を確認する固有のメカニズムとして、一細胞分裂停止作用するように、任意のゼブラフィッシュ遺伝子株（ 例えば AB、テュービンゲン、WIK）で行うことができます。加えて、株に導入可視遺伝子マーカーは、二倍体胚（ 図3）の識別を容易にするために使用することができます。例えば、 金色やアルビノなどの色素沈着遺伝子における劣性変異についてホモ接合性である雌の卵の使用は、同一の色素沈着遺伝子のための通常の対立遺伝子を担持する野生型株に由来する精子と組み合わせることができます。 UV処理された精子は、野生型色素対立遺伝子が寄与することができないので、このような状況では、半数体およびホモ接合性の二倍体胚は、劣性色素変異を示します。また、ホモ接合二倍体は、以下の拡張半数体形態への鋭い対照的に、24 HPFで野生型の形態を示します。母体の劣性形質の外観と全体的なエンブリーの組み合わせO形態は成功した倍数性の重複を確認します。さらなる確認は、処理および未処理胚の染色体数によって得ることができます。
劣性可視遺伝子マーカーに基づいて上記の遺伝子マーキングシステムは、また、得られた胚は、精子が完全にUV処理によって不活性化されていない場合にのみ、野生型の色素沈着を示すので、子孫における精子由来のDNAが存在しないことを確認することができ。遺伝子マーキングシステムの非存在下では、胚の試料は、精子のDNAの不活性化が完了したこと、したがって、すべての胚は24 HPFで半数体形態を示すことを確認するために、熱ショックの非存在下で成長させ、そしてすることができます。完全に不活性化された精子と一緒に、この同じ遺伝子マーキングシステムは、また、潜在的な自発的な極体の障害を検出することができます。このようなイベントは、二倍体化処理をせずに二倍体の形態を有する劣性マークされた胚の出現をもたらすであろう。自発的極性BODY失敗は、ゼブラフィッシュで観察されていないが、 アフリカツメガエルトロピカ 18で報告されています。所与のシステム内に存在する場合、この自発的なイベントは、最適倍数性操作を実行するために縮小またはのために制御されなければなりません。
技術の制限事項
実行可能なgynogenotesを産生する能力は、ホモ接合が有害である背景遺伝子変異体が存在しないことに依存しています。したがって、手順の成功は、使用される遺伝子株に依存して変化します。雌性発生の複数世代を通して遺伝株の選択は、生存率1を改善することが示されています。
二倍体胚を生成するために、未処理の精子と一緒に使用HS2方法は、高い頻度で四倍体胚の生成を可能にします。しかし、この場合には、四倍の変換に二倍体のために、遺伝子マーカーは、容易に全体GENOMの確認のために許可されていません電子重複。この場合には、ストールした胚の同期胚における1細胞周期停止の観察および選択は四倍体の選択を保証する必要があり、染色体数はさらに倍数性を確認するために使用することができます。
既存の/別の方法に関して意義
1 40年以上前Streisingerによって説明されているが、標準的なHS法が広く不良による歩留まりに使用されていません。その代わりに、倍数性の操作は、ほぼ独占的に第二減数分裂の阻害を介して倍数性の重複が生じる初期圧力、の代替と比較的より効率的な方法に頼ってきました。しかし、遺伝的ツールとしての価値を軽減する遺伝子ホモ接合9,19の可変割合で初期圧力をもたらします。最近の研究は、そのHS2、標準HSプロトコル、最初の細胞周期中の異なる時点での熱パルスの、即ちアプリケーションの修正（22-24標準HSで12-14 MPFに比べHS2でMPF期間は、）ホモ接合二倍体生産の最大4倍の収量の増加をもたらします。
熱パルスの作用は、結果としてスピンドルを生成し、媒介する適切な補体を欠いている（最初の細胞周期中22-24 MPF）ヒートショックの時、中中心小体複製の阻害によって生じると推測することができます以下の細胞周期の間の細胞分裂（50-65 MPF、第二の細胞周期に相当します）。中心小体の複製が開発は、正確な1-細胞周期停止後の進行させ、その後の細胞周期の間にヒートショックが存在しない状態で再開することができます。中心小体重複やDNA複製サイクルが20相互に依存しているので、DNA複製があっても第二の細胞周期におけるストール分裂の間に正常に進行します。これは、正確な全ゲノム重複と完全なホモ接合になります。
将来の応用
21のように複数の対立遺伝子を、伴うものを含む複数の世代を必要とするもの、特に、このような遺伝子スクリーニングなどの遺伝的スキームを、容易にすることができます。
HS2と同様のアプローチは、現在でも、遺伝システムとして使用されていないもの、体外受精と他の種にも適用することができます。この方法特に、熱パルスが中心小体の複製に影響を与え、有害な発生影響を生じることなく、正確な細胞分裂ストールと全ゲノム重複を生成することができ割球サイクリングの開始を通して受精からの時間を利用しています。したがって、この初期期間は、他の動物系における倍数性操作に基づく遺伝学的方法を開発するために熱衝撃感度を探索することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S3264 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| MgSO4-7H2O | Sigma | 63138 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Tricaine | Western Chemical | Tricaine-D (MS 222) | FDA approved (ANADA 200-226) |
| Tris base | Sigma | 77-86-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| HCl | Sigma | 920-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| Fish net (fine mesh) (4-5 in) | PennPlax | (ThatFishThatPlace # 212370) | available in ThatFishThatPlace |
| Plastic spoon | available in most standard stores | ||
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissecting forceps | Dumont | SS | available from Fine Science Tools |
| Dissecting stereoscope (with transmitted light source) | Nikon | SMZ645 | or equivalent |
| Reflective light source (LED arms) | Fostec | KL1600 LED | or equivalent |
| Petri plates 10 cm diameter | any maker | ||
| Eppendorf tubes 1.5 ml | any maker | ||
| Ice bucket | any maker | ||
| Pipetteman P-1000 | any maker | ||
| Pipette tips 1,000 µl | any maker | ||
| Narrow spatula | Fisher | 14-374 | |
| Depression glass plate | Corning Inc | 722085 (Fisher cat. No 13-748B) | available from Fisher Scientific |
| UV lamp | UVP | Model XX-15 (cat No. UVP18006201) | available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting) |
| UV glasses | any maker | ||
| Paper towels | any maker | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666-11 | available from Fisher Scientific |
| Timer stop watch | any maker | ||
| Wash bottle | Thermo Scientific | 24020500 | available from Fisher Scientific |
| Tea strainer | available in kitchen stores | ||
| beakers, 250 ml (2) | Corning Inc. | 1000250 | available from Fisher Scientific |
| water bath (2) | any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series) | ||
| Hanks’ Solution 1 | see above | see above | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O. Store at 4°C. |
| Hanks’ Solution 2 | see above | see above | 0.358 g Anhydrous Na2HPO4, 0.6 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O. Store at 4 °C. |
| Hanks’ Solution 4 | see above | see above | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O. Store at 4 °C. |
| Hank's Premix | see above | see above | add, in the following order: 10.0 ml Solution 1; 1.0 ml Solution 2; 1.0 ml Solution 4; 86.0 ml ddH2O; 1.0 ml Solution 5. Store at 4 °C |
| Hanks’ Solution 6 | see above | see above | 0.33 g NaHCO3 in 10 ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure. |
| Hank's Solution (final solution) | see above | see above | Combine 990 μl of Hank’s Premix and 10 μl of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution) |
References
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