Summary
يستخدم بروتوكول تعديل للتلاعب الصيغة الصبغية صدمة الحرارة للحث على المماطلة دورة واحدة في الانقسام السيتوبلازمي في الجنين في وقت مبكر. ويتجلى هذا البروتوكول في الزرد ولكن قد تكون قابلة للتطبيق على الأنواع الأخرى.
Abstract
التلاعب في الصيغة الصبغية يسمح للتحولات مفيدة، مثل diploids إلى الرباعي، أو haploids إلى diploids. في rerio دانيو الزرد، وتحديدا توليد diploids gynogenetic متماثل مفيد في التحليل الجيني لأنه يسمح بالإنتاج المباشر من أصحاب الزيجوت المتماثلة الألائل من أم متخالف واحدة. توضح هذه المقالة بروتوكول تعديل الازدواجية الصيغة الصبغية بناء على نبض الحرارة خلال دورة الخلية الأولى، الحرارة صدمة 2 (HS2). من خلال تثبيط الازدواجية المركزيه، النتائج هذه الطريقة في الدقيقة كشك انقسام الخلية خلال دورة الخلية الثانية. في الدقيقة دورة واحدة تقسيم كشك، بالإضافة إلى ازدواجية الحمض النووي لم تتأثر، النتائج في كامل الازدواجية الجينوم. وتشمل البروتوكولات المرتبطة بهذا الأسلوب البيض وجمع الحيوانات المنوية، والعلاج بالأشعة فوق البنفسجية من الحيوانات المنوية، والتخصيب في المختبر ونبض حرارة أن يتسبب في خلية واحدة تأخير تقسيم دورة والازدواجية الصيغة الصبغية. ويمكن تطبيق نسخة معدلة من هذا البروتوكولللحث على التغييرات الصيغة الصبغية في الأنواع الحيوانية الأخرى.
Introduction
يسمح هذا البروتوكول التلاعب الصيغة الصبغية في الأجنة الزرد، كما هو الحال في توليد diploids gynogenetic متماثل من haploids gynogenetic (الشكل 1) أو إنتاج الرباعي. ويتحقق ذلك عن طريق إحداث تأخير في السيتوبلازمي الموافق بالضبط دورة خلية واحدة (الشكل 2A، 2B). ويتحقق المفتاح تأخير دورة واحدة في الانقسام السيتوبلازمي عن طريق العلاج مع الصدمة الحرارية. وتضمن البروتوكول القياسي من الحرارة صدمة (HS) كما هو موضح في الأصل من قبل Streisinger وزملاؤه نبض درجة الحرارة خلال MPF فترة 13-15، مما أدى إلى دورة واحدة انقسام الخلايا كشك خلال أول دورة الخلية 1. كفاءة هذا البروتوكول قد تحسنت في الآونة الأخيرة عن طريق مسح دورات الخلية الأولى مع انزلاق نافذة الزمني لمعالجة الصدمة الحرارية. هذا المسح تحديد نقطة زمنية لاحقة لصدمة الحرارة، لا يزال ضمن دورة الخلية الأولى (22-24 MPF)، الذي يؤدي إلى ارتفاع معدل EMBRيوس مع دورة واحدة كشك انقسام الخلايا، مما يؤثر في هذه الحالة الخلية الثانية دورة 2. كما تم الإبلاغ عن ملاحظة أن التلاعب التجريبية خلال دورة الخلية الأولى تتداخل مع انقسام الخلية خلال دورة الخلية الثانية وتسبب الحمض النووي ازدواجية المحتوى في غيرها من أنواع الأسماك 3،4. نشير إلى هذا البروتوكول تعديلها حسب الحرارة صدمة 2 (HS2 - مصطلح "2" يعكس أن النبض الحرارة يحدث في نقطة زمنية لاحقة من طريقة HS القياسية، وأن تأخير دورة الخلية الناجمة عن HS2 يحدث خلال دورة الخلية الثانية ). وأظهرت هذه الدراسات أن أساس اعتقال السيتوبلازمي بعد الصدمة الحرارية هو تثبيط الازدواجية المركزيه خلال نبض الحرارة، مما يؤثر على تكوين المغزل وتحريض ثلم في دورة الخلية التالية. النتائج HS2 في غلة اعتقال دورة الخلية تقترب من 100٪، ومعدلات تكرار الصيغة الصبغية تصل إلى 4 أضعاف HS القياسية 2.
الأجنة تعامل الطرافةها الصدمة الحرارية خلال قسيم أرومي خلية الدراجات يحمل العديد من الآثار الضارة، مما يوحي بأن الصدمة الحرارية يؤثر على عمليات متعددة اللازمة لانقسام الخلية 2. من ناحية أخرى، إذا تم تطبيق الصدمة الحرارية قبل الشروع في ركوب الدراجات الخلية (الفترة الزمنية 0-30 MPF)، ويبدو أن يكون لها آثار تتفق مع تدخل معين مع الازدواجية المركزيه ولا يبدو أن تؤثر عمليات الخلية الأساسية الأخرى 2 . وأظهرت هذه الدراسات أن الوقت قبل الشروع في تقسيم قسيم أرومي يبدو أن فترة تنموية قابلة للاستخدام الصدمة الحرارية كأداة للتلاعب على وجه التحديد الصيغة الصبغية من خلال تثبيط المركزيه. السبب الكامن وراء انتقائية واضحة لالصدمة الحرارية على الازدواجية المركزيه غير معروف، ولكن قد تكون ذات صلة إلى تدهور الانتقائي للالأساسات الجسيم المركزي لوحظ تحت الإجهاد الحراري في أنواع الخلايا معينة، مثل الكريات البيض 5.
تزامن الزمني للدي الجنينيةويتحقق اإلنمائية التي كتبها التخصيب في المختبر (IVF). استخدام الحيوانات المنوية غير المعالجة خلال النتائج الإخصاب في الأجنة مضاعفا أنه عند HS2 الناجم عن دورة واحدة السيتوبلازمي كشك يصبح رباعي الصيغة الصبغية. استخدام الحيوانات المنوية المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية، والذي يحمل crosslinks أن تعطيل الحمض النووي، والنتائج في الأجنة فرداني gynogenetic 6، التي تقوم عليها HSII الناجم عن دورة واحدة السيتوبلازمي المماطلة أصبحت diploids gynogenetic 2. بسبب ينجم عن ذلك من ازدواجية الجينوم كاملة، وdiploids gynogenetic الأخير هم متماثل في كل مكان واحد عبر الجينوم. لالايجاز، فإننا نشير إلى gynogenetic الأجنة فرداني باسم "haploids"، ومتماثل الأجنة مضاعفا gynogenetic باسم "diploids متماثل". إذا قابلة للحياة وخصبة، diploids متماثل يمكن استخدامها لبدء خطوط معقمة وخالية المميتة. زيجوت متماثلة الألائل المباشر الناجم عن HS2 كما ينبغي أن يدرج بسهولة إلى التحليل الجيني أو شاشات الوراثية، منذ diploids متماثل من الإناث التي هي ناقلات متخالف من موتمعدلات المعرض بالجمع من زيجوت متماثلة الألائل في (50٪) نسب عالية وثابتة 2.
يصف بروتوكول التالية الخطوات لتنفيذ HS2 وحمل الازدواجية الصيغة الصبغية مع زيجوت متماثلة الألائل الكامل. لإنتاج رباعي الصيغة الصبغية، وينبغي أن يكون الحل الحيوانات المنوية غير المعالجة. لإنتاج مضاعفا متماثل، يجب المعطل الحيوانات المنوية عن طريق العلاج بالأشعة فوق البنفسجية. وبالإضافة إلى ذلك، كما هو موضح في مناقشة، علامات الصباغ واضحة يمكن أن تستخدم أيضا لتسهيل تحديد diploids متماثل. زميله الزرد في المقام الأول خلال ساعة 3 الأولى من بدء دورة ضوءها 7، والكبار على حد سواء والبيض حساسة لإيقاعات الساعة البيولوجية 8، وذلك لأفضل النتائج ينبغي أن يحدث إجراء عمليات التلقيح الصناعي غضون هذه الفترة الزمنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت التجارب على الحيوانات فقط وفقا لجامعة ويسكونسن - ماديسون ورعاية الحيوان المؤسسية والمبادئ التوجيهية للجنة الاستخدام (IACUC) (جامعة ويسكونسن - ماديسون ضمان عدد A3368-01).
1. اختيار الإناث لجمع البيض عن طريق التزاوج وتوقف
ملاحظة: البروتوكولات القائمة على التلقيح الاصطناعي تعتمد على قذف البيض نضجا من الإناث من خلال الضغط اليدوي 9. وقد استخدمت البروتوكولات السابقة الإناث مباشرة من الدبابات أو في التزاوج الزوج دون الإناث تمر السلوك الإفراج البيض، ولكن فقط جزء صغير من هذه الإناث (حوالي 20٪ أو أقل، وهذا يتوقف على خط الزرد) تسفر عن البيض مقذوف والمختصة على الضغط اليدوي. في الإجراءات المحسنة، والإناث قبل فرزها لوضع البيض خلال الملاحظة البصرية المباشرة، تليها انقطاع فوري من التزاوج. هذا الإجراء هو فعالة جدا، وتقريبا جميع الإناث تم اختيارها مسبقا من خلال هذا التزاوج العائد خطوة توقف البيض مقذوف والمختصةعلى الضغط اليدوي.
- بعد ظهر اليوم قبل التجربة، وإنشاء أزواج التزاوج من سلالة الزرد المطلوب في صناديق التزاوج الزرد القياسية. حافظ على الذكور في نفس الغرفة كما الإناث يفصل بعد جسديا منهم، سواء من خلال تقسيم مربع التزاوج أو عن طريق وضع الذكور تحت إدراج وضع البيض والأنثى داخل إدراج.
- صباح التجربة، وإزالة التقسيم المادي، ووضع كل من الذكور والإناث في نفس إدراج وضع البيض، لذلك يبدأ هذا التزاوج.
- تفقد البصر الدبابات التي تحتوي على أزواج التزاوج للكشف عن قذف البيض أثناء التزاوج الطبيعي. في أولى بوادر سحب البيض، ومنفصلة للرجال والنساء لقطع تربية. بعد الانفصال عن الذكور، والحفاظ على الإناث محددة مسبقا، إما منفردة أو مجمعة في الدبابة نفسها. استخدام الإناث متعددة اعتمادا على عدد من الأجنة المطلوب (عادة 50-150 بيضة / أنثى).
2. إعداد الحل الحيوانات المنوية
ملاحظة: التلقيح الاصطناعي صelies عن تعرض البيض نضجا إلى حل الحيوانات المنوية. هذا الحل يمكن أن يكون غير المعالجة، لتوليد بيضات ملقحة مضاعفا (التي على العلاج HS2 تصبح أجنة رباعي الصيغة الصبغية) أو الأشعة فوق البنفسجية المعالجة، لتوليد بيضات ملقحة فرداني (التي على العلاج HS2 تصبح أجنة مضاعفا متماثل). واقترح السابقة بروتوكولات إعداد الحيوانات المنوية لاستخدام الأنابيب الشعرية إلى جمع السائل المنوى من منطقة الشرج من الذكور الحية، ولكن هذا كان عملية غير فعالة كما سوى جزء صغير من الذكور أسفرت السائل المنوى 9. بروتوكول المعروضة أدناه تعتمد بدلا من ذلك على إعداد الحيوانات المنوية من الخصيتين تشريح المنفصمة، التي تعطي نتائج أكثر موثوقية.
- يعد حل هانك في وقت مبكر كحل بريمكس لهانك، تتألف من جميع مكونات (حلول 1 و 2 و 4 و 5) إلا على حل بيكربونات الصوديوم (الحل 6). إعداد الحل 6 الطازجة وإضافة إلى بريمكس صباح التجربة (الجدول 1). لجعل حل هانكس "(الحل النهائي، وإعداد صباحإجراء عمليات التلقيح الصناعي)، والجمع بين 990 من المجاهدين بريمكس هانك و 10 ميكرولتر من تقدم طازجة الحل 6.
- الموت ببطء الذكور عن التعرض المفرط لتريكين كحل 0.016٪ في المياه مكيفة.
- إعداد تريكين كحل الأسهم بنسبة 0.2٪ في الماء (العازلة لدرجة الحموضة 7.0 مع 1M تريس درجة الحموضة 9.0) والحفاظ على 4 درجات مئوية. إضافة 8 مل من محلول المخزون تريكين لكل 100 مل من الماء في كوب، واستخدام شبكة لنقل الذكور إلى حل تريكين.
- استخدام ما يعادل الخصيتين للذكر واحد لكل مخلب تحتاج إلى المخصبة في حجم محلول هانك في المقابل إلى 100 ميكرولتر لكل من الذكور (مثل الخصيتين من 10 ذكور التي تم جمعها في 1 مل من محلول هانك، لتسميد 10 براثن مع 100 ميكرولتر / مخلب).
- تأكيد القتل الرحيم من وقف الحركات الخيشومية لمدة 15 دقيقة. بعد القتل الرحيم، وإزالة الذكور من الدورق مع ملعقة. شطف الذكور لفترة وجيزة مع الماء مشروط وتجفيفها برفق عن طريق وضعها لفترة وجيزة على عدة مواقع لمنشفة ورقية.
- لإزالة الخصيتين، الأولى قطع رأس الموت الرحيم الذكور باستخدام مقص تشريح أو شفرة حلاقة، وجعل قطع طولية على طول البطن مع تشريح scissors.Under المجهر تشريح مع مصدر الضوء المنعكس، وإزالة الأعضاء الداخلية مع ملقط تشريح. سحب كل الجماهير الخصيتين مع ملقط ووضعها داخل أنبوب microcentrifuge تحتوي على حل هانك.
يمكن التعرف على الخصية حيث أن كل من هيكلين ممدود من مظهر شفاف وجدت إلى جانب الجدران الجسم والتي تلتقي بالقرب من مجرور: ملاحظة. يمكن الخصيتين البقاء مدة 2-3 دقيقة على سطح لوحة بتري بعد تشريح وقبل وضعها في الحل هانك. - الافراج عن الحيوانات المنوية إلى حل عن طريق قص الخصيتين مع ملعقة الضيقة و / أو بلطف pipetting صعودا وهبوطا 5-6 مرات الخصيتين في حل مع micropipette 1000 ميكرولتر طرف، مع تجنب تشكيل فقاعة الهواء. السماح للتسوية الخصيتين الحطام.
- تخزين حل الحيوانات المنوية في الجليد، حيث أنها يمكن أن تبقي فعاليته لمدة تصل إلى 2-3 ساعة. إذا الشروع في الأشعة فوق البنفسجية علاج حل الحيوانات المنوية، ونقل الحل في أنبوب microcentrifuge نظيفة وترك قطعة من الخصيتين وراء.
3. علاج الأشعة فوق البنفسجية
ويستخدم العلاج بالأشعة فوق البنفسجية لتشعبي الحمض النووي الحيوانات المنوية من أجل جعله غير في الجنين: ملاحظة. يتم استخدام هذه الخطوة فقط عند إنتاج gynogenetic الأجنة مضاعفا gynogenetic فرداني أو متماثل. يجب فصل الحيوانات المنوية حل لعلاج الأشعة فوق البنفسجية من قطع الخصيتين (الخطوة 2.4)، وقطع كبيرة قد يحمي الحيوانات المنوية من العلاج بالأشعة فوق البنفسجية.
- نقل الحل الحيوانات المنوية إلى بئر نظيفة وجافة لوحة الاكتئاب الزجاج يجلس على السرير الجليد (مثل الجليد داخل لوحة بتري). استخدام ما يصل إلى 1 مل من محلول الحيوانات المنوية في لوحة من الزجاج جيدا.
- فضح حل الحيوانات المنوية للأشعة فوق البنفسجية من خلال وضع لوحة من الزجاج الاكتئاب على السرير الجليد تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية. علاج الحل الحيوانات المنوية لمدة 90 ثانية مع 115 V (60 هرتز، 0.68A) الأشعة فوق البنفسجية مصباح في +19 سم (7.5 بوصة) عن بعد. مع نهاية طرف ماصة، المزيج بلطف على حل كل 30 ثانية أثناء العلاج بالأشعة فوق البنفسجية (تستخدم ماصة نظيفة كل 30 ثانية).
- باستخدام طرف الماصة نظيفة وmicropipette، ونقل الحل النطف المنوية إلى أنبوب microcentrifuge جديد. تخزين على الجليد لحين الحاجة إليها لأطفال الأنابيب (لم يعد من 2-3 ساعة من الاستخراج).
4. بثق اليدوي الناضجة البيض
ملاحظة: الإناث التي حصلت عليها انقطاع التزاوج الطبيعية سوف تسفر بسهولة البيض تحت التخدير والضغط اليدوي. خلال هذا الإجراء، العلاج تريكين يجب أن تسيطر عليها بعناية لتجنب التعرض المفرط التي قد تحول دون استرداد الإناث.
- تخدير الاناث، من خلال التعرض للضوء إلى حل تريكين: الإناث نقل مع الشباك لتريكين حل في الماء مشروط (الذي أدلى به مضيفا 8 مل من تريكين 0.2٪ محلول المخزون إلى 100 مل من الماء الأسماك مكيفة) لمدة 2-5 دقائق، حتى توقف الأسماك حركة الخيشومية. <لى> بمجرد توقف أنثى حركة الخيشومية، واستخدام ملعقة لأنه جمع لفترة وجيزة شطفه بالماء مشروط. لا تزال تستخدم ملعقة لنقل الأسماك، جففه برفق عن طريق وضعه لفترة وجيزة وبشكل متكرر في عدة مواقع من منشفة ورقية، ثم تحويلها إلى وجافة 10 سم قطر الصفيحة بتري نظيفة. الاقتراب من السمك مع ملعقة في سابقة لالاتجاه الخلفي، لتجنب التي قد تسبب تلفا الوصاد الخيشومية.
- استخدام مناديل المختبر أو الأنسجة الرخوة لزيادة بلطف تجفيف منطقة الزعنفة الشرجية، لمنع أي بيض صدر من قبل الأوان يتم تفعيلها عن طريق المياه. الملطف الأصابع بقليل من الماء (لتجنب لهم التمسك قشور السمك)، ضع إصبع واحد يد واحدة على ظهر الأنثى كما دعم، ومع اصبع من جهة أخرى تطبيق ضغط طفيف على طول البطن الأنثى حتى تصبح البيض مقذوف.
- استخدام ملعقة الضيقة لتحريك البيض بعيدا عن جسم الأنثى. وضع الأنثى مرة أخرى إلى الخزان بالماء مشروط لتحقيق الانتعاش.
- تفعيل (مع التعرض الماء) وتسميد (مع الحيوانات المنوية حل الإضافة) البيض في وقت واحد، وخلال 90 ثانية بعد قذف (انظر القسم 5).
5. التخصيب في المختبر
ملاحظة: الإخصاب الزرد في الصلبان الطبيعية الخارجية، اعتمادا على الافراج في وقت واحد والتنشيط بواسطة المياه من البيض والحيوانات المنوية أثناء التزاوج. في يحاكي الإخصاب في المختبر هذه العملية عن طريق تعريض البيض إلى حل الحيوانات المنوية في وجود الماء. حجم المياه صغير في الأصل (1 مل) من أجل زيادة تركيز الحيوانات المنوية فعال. ملزمة من قبل الحيوانات المنوية يحدث داخل 15-20 ثانية 10 </ سوب>، وحجم المياه ومن ثم يمكن زيادة. كوريون رفع المزيد من يساهم في تزامن وثيق من مخلب عن طريق الحد من نافذة الكفاءة للحيوانات المنوية ملزمة 11،12. لذا الأجنة الناتجة يحمل دورات انقسام الخلايا في وقت واحد إلى حد كبير خلال مراحل الانقسام في وقت مبكر.
- إضافة 100 ميكرولتر من حل الحيوانات المنوية (المقابلة إلى ما يعادل الخصيتين من الذكور واحدة - انظر الجزء 2) إلى مخلب من البيض مقذوف على طبق بتري. دوامة بلطف طرف ماصة تستخدم لإضافة محلول الحيوانات المنوية بين البيض إلى مزيج الحيوانات المنوية والبيض معا، ويجري التأكد من عدم رفع غيض من سطح لوحة بتري لتجنب الضرر البيض.
- تفعيل البيض على الفور عن طريق إضافة 1 مل من محلول الجنينية المتوسطة (E3) (المياه مكيفة غير مقبولة أيضا كبديل للE3 في أجزاء من 5 إلى 7) ومرة أخرى المزيج بلطف البيض والحيوانات المنوية التي يحوم بلطف مع طرف ماصة. بدء الموقت لبدء توقيت بالنسبة للإخصاب. في 1 MPF في حجم 1 مل، إغراق لوحة مع E3. قبل المتابعة، وترك دون عائق حتى 10-12 MPF للسماح تفعيل البيض، بما في ذلك توسيع المشيمه الكامل.
6. المعالجة الحرارية صدمة
ملاحظة: الصدمة الحرارية المطبقة في الجنين في وقت مبكر يمنع الازدواجية المركزيه، مما أدى إلى تكملة ناقصة من مريكز لدفع تشكيل المغزل خلال دورة الخلية اللاحقة 2. غياب المغزل بدوره يؤدي إلى عدم تشكيل ثلم 13.
- بعد توسيع chorions (10-12 MPF)، صب الأجنة من لوحة بتري في مصفاة الشاي. شطف لوحة بتري باستخدام زجاجة غسل مع E3 من أجل جمع أي الأجنة المتبقية في مصفاة الشاي.
- وضع مصفاة الشاي مع الأجنة داخل الدورق في حمام قبل ساخنة مع E3 في 28.5 درجة مئوية. قبل تتوازن الكأس وE3 لدرجة حرارة مياه الاستحمام، وتأكد من وجود ما يكفي من E3 حتى يتسنى لجميع الأجنة في الشايتتعرض مصفاة إلى المتوسطة.
- في 22 MPF، إزالة مصفاة الشاي من C حمام الماء 28.5 درجة، لفترة وجيزة صمة عار على منشفة ورقية لإزالة الرطوبة الزائدة، ووضعه داخل دورق E3 مسخن بالمثل في حمام الحرارة التي بلغت 41.4 درجة مئوية.
- في 24 MPF، ونقل مصفاة الشاي إلى E3 في حمام مائي عند 28.5 درجة مئوية بعد النشاف وجيزة. في 29 MPF، استخدام زجاجة غسل مع E3 لنقل الأجنة من مصفاة الشاي إلى 10 سم لوحة بيتري.
7. اختيار لأجنة مع دورة واحدة الانقسام السيتوبلازمي كشك
- خلال MPF الفترة الزمنية 35-45، تحت المجهر تشريح مع مصدر الضوء المرسل، اختر بالتالي يتم إخصاب هذه الأجنة التي تشهد انشقاق متناظرة في المرحلة 2-الخلية، والتي. إزالة الأجنة التي لم تشهد الانقسام الخلوي.
- مواصلة مراقبة الأجنة المخصبة، التي اختيرت لانقسام الخلايا العادية خلال دورة الخلية الأولى، وخلال ثانيةأندو دورة الخلية (50-65 MPF).
- الأجنة الفرز وفقا للفئات التالية (الشكل 2C): 4 خلايا ( "لا المماطلة"، في 2: معيار الترتيب 2 للجنين 4 خلايا)؛ 3 خلايا ( "كشك جزئي"، في الشاذة 2 أصغر الخلايا: 1 ترتيب خلية كبيرة)؛ و2 الخلايا ( "توقف" والأجنة واظهار تأخير دورة خلية واحدة في 1: الترتيب 1 متطابقة إلى أن من جنين 2-الخلية). فرز الأجنة المجمدة في لوحة بتري جديدة.
ملاحظة: في هذه المرحلة والأجنة في 2: الترتيب 2 تتوافق مع تلك التي خلال دورة الخلية الثانية لا قسيم أرومي خضع كشك انقسام الخلايا. الأجنة في الشاذة 2 أصغر الخلايا: 1 ترتيب خلية كبيرة تتوافق مع تلك التي تسببت الصدمة الحرارية كشك دورة الخلية خلال دورة الخلية الثانية في قسيم أرومي احد ولكن لا الآخر؛ والأجنة "المتعثرة" في 1: الترتيب 1 تتوافق مع تلك التي خضعت على حد سواء عن Blastomeres خلال دورة الخلية الثانية في انقسام الخلايا المطلوبمماطلة أو تعطل. يجب أن الأجنة المتوقفة استئناف الانقسام الخلوي خلال فترة دورة الخلية التالية (65-80 MPF). ترتيب عن Blastomeres قد يكون متغير، وذلك بسبب الاشارات غير مكتملة من دورة الخلية السابقة لتحقيق الاستقرار في المغزل 2،14، ولكن معظم الأجنة تشكيل الأريمة عادية نسبيا التي يمكن أن تخضع التطور الطبيعي. - السماح للأجنة لتطوير في لوحة بيتري، مع حد من 80 الأجنة في 10 سم لوحة. في 24 HPF، ومراقبة الأجنة لتحديد ما إذا كان لديهم سمة التشكل الطبيعي للأجنة مضاعفا مضاعفا أو متماثل 6 (مدى الطبيعي للتمديد محور (الشكل 3A، 3C))، في المقابل إلى انخفاض تمديد محور وزيادة الجسم سمك سمة من haploids (الشكل 3B))، و / أو تقييم diploidization باستخدام علامات صبغة وراثية في 36 MPF، مثل الذهبي أو البيضاء وغيرها من مثل هذه المقايسات (الشكل 3 وانظر أدناه) 2،6،9. إزالة أي الأجنة التي يبدو أن لها التشكل فرداني، أو التي هي lysed أو تظهر العيوب غير طبيعية بشكل صارخ أخرى.
ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، تسمح الأجنة لتطوير حتى 5 أيام بعد الإخصاب، مع الاستمرار في إزالة الأجنة هي lysed أو غير طبيعية بشكل فاضح على أساس يومي، وإضافة E3 جديدة لتحديث المتوسطة. ويمكن أيضا أن تنمو على قيد الحياة الأجنة بعد التضخم swimbladder يوم 5 عن طريق نقل إلى نظام التفريخ وتغذية تحت الظروف القياسية: ملاحظة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وعلى الرغم من خلية واحدة دورة السيتوبلازمي كشك، يحدث تكرار الحمض النووي عادة في مثل هذه الأجنة، مما أدى إلى ازدواجية محتوى الحمض النووي للجنين (الشكل 1). بروتوكول Streisinger الحرارة صدمة (معيار HS) ينطوي على نبض الحرارة خلال آخر فترة دقيقة 13-15 الإخصاب (MPF) ويدفع في المقام الأول اعتقال السيتوبلازمي خلال أول انقسام الخلايا الجنينية في 35 MPF 1،2، في حين أن طريقة المستمدة وصف هنا، يشار إلى حرارة صدمة 2 (HS2)، يستخدم الصدمة الحرارية خلال MPF الفترة 22-24 ويؤدي اعتقال السيتوبلازمي خلال انقسام الخلايا الجنينية الثاني في 50 MPF (الشكل 2، 2،3،4). في 24 HPF، ومراقبة الأجنة تسمح تحديد ما إذا كان لديهم سمة التشكل الطبيعي للأجنة مضاعفا مضاعفا أو متماثل أو الجسم أقصر وأوسع محور صفة مورفولوجية الأجنة فرداني (الشكل 3)
الشكل 1: أنواع التسميد. (A) التزاوج الطبيعي. الأمشاج الذكرية والأنثوية هي غير المعالجة، مما أدى إلى مضاعفا الطبيعي. يتم التعامل مع (ب) الحيوانات المنوية مع الأشعة فوق البنفسجية، مما أدى إلى تدمير الحمض النووي الأب وإنتاج بيضات ملقحة فرداني. وإذا لم يعالج، هذه haploids لا البقاء على قيد الحياة اليوم السابق 2-3 التنمية. (ج) علاج بيضات ملقحة فرداني مع الحرارة صدمة 2 (HS2) يثبط دورة واحدة من الانقسام السيتوبلازمي من الانقسام في الجنين في وقت مبكر. هذه دورة الخلية كشك، زوجيند لتكرار الحمض النووي لم يتأثر، يولد diploids متماثل التي يمكن أن تصبح الكبار قابلة للحياة وخصبة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: HS2 يعزز كلها الازدواجية الجينوم التي تعطل دورة الخلية الثانية. النمط (A) انشقاق خلية من الجنين دون علاج خلال أول ثلاث دورات خلية الموافق الأجنة 2-، 4- و 8 خلايا. نتائج العلاج (B) HS2 في كشك دورة واحدة من انقسام الخلية خلال دورة الخلية الثانية. خلال المماطلة، والنتائج الجارية توليف الحمض النووي في الأجنة تمر diploidization، إما من فرداني إلى مضاعفا (ن -> 2N) أو مضاعفا لرباعي الصيغة الصبغية (2N -> 4N) (انظر النص). بعد هذه المماطلة، الجنين يستأنف الانقسام الخلوي، مع نيحصلت wly الصيغة الصبغية. (C) HS2 المعالجة يمكن أن الأجنة المعرض مجموعة متنوعة من الترتيبات قسيم أرومي حسب ما إذا عن Blastomeres يحمل تأخير انقسام الخلية خلال دورة الخلية الثانية: أ) "لا كشك": لا المعروضات قسيم أرومي تأخير، مما أدى إلى 2: ترتيب مميزة 2 من 4 خلايا الأجنة المرحلة الثانية) "كشك الجزئي": واحد فقط من اثنين عن Blastomeres يسلك تأخير، مما أدى إلى الشاذة 2: 1 الترتيب، والثالث) "المتعثرة": على حد سواء عن Blastomeres يحمل تأخير، مما أدى إلى 1: 1 خاصية ترتيب الأجنة مرحلة 2-الخلية. في (A - C)، ويمثل نواة كما الدوائر الزرقاء، مع الحدث diploidization ممثلة توسيع حجم النووي. أنظر المرجع 2 لرسم تخطيطي تصور السلوك مريكزي كأساس المقترحة لالمماطلة انقسام الخلايا. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر فيرسيعلى هذا الرقم.
الشكل 3: مورفولوجيا diploids الطبيعية، haploids وgynogenotes. (أ) التشكل الجنيني عادي لمضاعفا الحصول عليها من خلال الصلبان الطبيعية. (ب) الأجنة فرداني يحمل محور أقصر وأوسع الجسم. (C) diploids متماثل الجينات لديها مورفولوجيا الجسم الطبيعي. الأجنة بالإضافة إلى تحمل طفرة المتنحية في الذهبي تصبغ الجينات لتسهيل تتبع الوراثة الحمض النووي الوالدين: الأمهات حاملات متماثل لطفرة في الذهبي، وآباء البرية من نوع لهذا الجين. وهكذا، diploids الطبيعي، متخالف للذهبي، تظهر من النوع البري تصبغ، في حين أن كلا haploids (فرداني الزيجوت للذهبي) وdiploids متماثل (متماثل للذهبي) يحمل تصبغ متحولة. شريط مقياس = 0.5 مم. لوحات تعديل من إعادةاملؤمتر 2، وأعيد طبعه بإذن. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| حل | مكونات | شروط التخزين |
| هانكس "الحل 1 | 8.0 غرام كلوريد الصوديوم، و 0.4 ز بوكل في 100 مل ده 2 O | تخزينها في 4 درجة مئوية |
| هانكس "الحل 2 | 0.358 غرام اللامائية نا 2 هبو 4، و 0.6 ز KH 2 PO 4 في 100 مل ده 2 O | تخزينها في 4 درجة مئوية |
| هانكس "الحل 4 | 0.72 ز CaCl 2 في 50 مل ده 2 O | تخزينها في 4 درجة مئوية |
| هانكس "الحل 5 | 1.23 ز MgSO 4 ∙ 7H 2 O في 50 مل ده 2 O | تخزينها في 4 درجة مئوية |
| بريمكس هانك | إضافة، بالترتيب التالي: 10.0 مل الحل 1، 1.0 مل الحل 2، 1.0 مل الحل 4، 86.0 مل ddH2O، و 1.0 مل الحل 5 | تخزينها في 4 درجة مئوية |
| هانكس "الحل 6 | 0.33 ز NaHCO 3 في 10 مل ده 2 O | إعداد جديدة صباح يوم إجراء عمليات التلقيح الصناعي |
الجدول 1. إعداد الحلول هانك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات الحاسمة
فمن الأهمية بمكان أن تعمل في ظل ظروف فعالة التخصيب في المختبر. لضمان امدادات جيدة من البيض نضجا (الخطوة 1)، مجموعة تصل الإناث للتزاوج لا ينبغي أن تم وضعها في التقاطعات التزاوج لمدة 5 أيام على الأقل، ويجب أن يظهر حامل. خلال انقطاع تربية، يمكن للمراقب مراقبة 15-30 الدبابات على نحو كاف لظهور أول من قذف البيض الطبيعي. يجب أن يحدث انقطاع التزاوج في أقرب وقت ممكن عندما يتم الإفراج عن البيض الأولى من خلال التزاوج الطبيعي، من أجل السماح معظم البيض أن تبقى داخل الإناث لإجراء التلقيح الاصطناعي. هذه الإناث، والتي هي الآن جاهزة للقذف اليدوي البيض ناضجة، يمكن أن تبقى فصلها لمدة تصل إلى 2 ساعة دون تأثير واضح على إطلاق سراح البيض لاحق. لإعداد حل الحيوانات المنوية فعال (الخطوة 2)، يجب أن تظهر الذكور قوية ومثالي مع لون ضارب الى الحمرة، الذي هو سمة من تربية الذكور الزرد. وتشريح نظيفة عادة ما ينطوي على ريموفينج مسار الأمعاء عن طريق سحبها نحو لالخلفي من الجسم، والمثانة السباحة عن طريق سحبها الأمامية. بعد إزالة الأعضاء الداخلية المركزية، لا تزال الخصيتين الجماهير ممدود كما شفافة جنبا إلى جنب مع كل جانب من جدار الجسم الداخلية. تجنب بما في ذلك أجهزة غير المرغوب فيها (على سبيل المثال الأمعاء) في حل الحيوانات المنوية. إذا لزم الأمر فصل هذه من الخصيتين من خلال العمل على سطح لوحة بتري الجافة قبل وضعها في الحل هانك. لتحقيق معدلات التسميد عالية خلال عملية التلقيح الاصطناعي (الخطوة 4)، فمن الضروري أن البيض مقذوف يتم الاحتفاظ المختصة حتى إضافة الحيوانات المنوية. البيض المختصة للإخصاب المعرض لهجة صفراء قليلا وهي شفافة. تجنب البيض وجود أي اتصال مع الماء قبل إضافة الحيوانات المنوية، ولأن المياه من شأنه أن يؤدي تفعيل البيض وتفعيل السابق لأوانه سوف يمنع الإخصاب. يجب أن يحدث تنشيط المياه والتسميد خلال 90 ثانية من قذف من الإناث لتجنب الجفاف من البيض، والتي سوفتؤدي إلى تدهورها. إذا لزم الأمر، والبيض مقذوف يمكن أن تبقى لفترات أطول (تصل إلى 1.5 ساعة أو أكثر) في 100-200 ميكرولتر من محلول هانك تستكمل مع 0.5٪ الأبقار مصل الزلال (BSA) 17 (عند إعداد الحل هانك لهذا الغرض المحدد، وإعداد بريميكس لتصحيح محتوى الماء المضاف أثناء BSA مكملات). إذا ظلت البيض المختصة بمساعدة حل جيش صرب البوسنة هانك، وإزالة BSA الزائد هانك من البيض باستخدام micropipette وتسميد حدود 1 دقيقة.
خطوة حاسمة لنجاح diploidization باستخدام HS2 هي فرز الأجنة المجمدة (الخطوة 7). الفرز الأولي من الشق متناظر الأجنة 2-خلية يختار لأجنة أن تصبح بويضات ويبدأ انقسام الخلايا (إنطاف مزدوج عرضية خلال نتائج عمليات التلقيح الصناعي في الأجنة التي الانتقال مباشرة من 1- إلى 4 خلايا في 35-50 MPF - يجب التخلص من هذه الأجنة). ركوب الدراجات ويحدث خلية كل 15 دقيقة خلال هذه أوائل الحادي الجنينيةالأعمار (35-50 MPF لدورة الخلية الأولى، 50-65 MPF لدورة الخلية الثانية، وهلم جرا)، لذلك فرز الشق الأجنة خلال 10 دقيقة الأولى من كل دورة الخلية يؤمن غياب التداخل بين دورات ودقيقة تحديد كشك انقسام الخلايا.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
قوة العلاج بالأشعة فوق البنفسجية في الخطوة 3 (على سبيل المثال وقت التعرض، والطاقة مصباح، المسافة إلى مصباح) يمكن تعديلها إذا لزم الأمر عن طريق اختبار معدلات التسميد الأولية، فضلا عن تواتر haploids في غياب العلاج HSII اللاحقة: المبلغ الصحيح لل التعرض للأشعة فوق البنفسجية لا يكون لها تأثير ملحوظ على معدلات الإخصاب في حين أدى في 100٪ من الأجنة فرداني (انظر ممثل النتائج للتمييز فرداني من الأجنة مضاعفا). الكثير من التعرض للأشعة فوق البنفسجية يسبب انخفاض معدلات التسميد بسبب يفترض أن الآثار الضارة على وظائف الحيوانات المنوية، بينما ينتج عدم كفاية التعرض للأشعة فوق البنفسجية الأجنة مضاعفا ر المناسبس تثبيط غير مكتملة من الحمض النووي الحيوانات المنوية.
إذا الأجنة يحمل عيوب التنموية أو الفتك بعد استئناف الانقسام الخلوي (الخطوة 7)، ودرجة الحرارة الصدمة الحرارية في الخطوة 6 يمكن أن تخفض قليلا (على سبيل المثال إلى 41.0 درجة مئوية) لزيادة بقاء الجنين. الظروف التي تؤدي إلى كسور متساوية تقريبا من الشاذة 3-الخلية والمتوقفة الأجنة 2-خلية خلال دورة الخلية الثانية (وبالتالي فهي قرب عتبة لها تأثير على الازدواجية مريكزي) يؤدي إلى بعض التشوهات التطورية اللاحقة الحد الأدنى وزيادة البقاء على قيد الحياة بعد استئناف الدراجات خلية .
ويتضمن طريقة HS2 آلية مريحة والجوهرية لتقييم كشك انقسام الخلايا (وبالتالي كلها الازدواجية الجينوم)، منذ الملاحظة المباشرة من الأجنة لأنها تضع يسمح تتبع دورات الخلايا المختلفة. دليل اختيار الأجنة التي خضعت كشك تقسيم دورة خلية واحدة يسمح تولد السكان موحد للجنين diploidizedالصورة. يمكن أن يتم HS2 في أي سلالة وراثية الزرد (على سبيل المثال AB، توبنغن، ويك)، والأفعال خلية واحدة تقسيم كشك كآلية جوهرية لتأكيد الازدواجية الحمض النووي. بالإضافة إلى ذلك، علامات وراثية واضحة أدخلت على سلالة يمكن استخدامها لتسهيل التعرف على الأجنة diploidized (الشكل 3). على سبيل المثال، استخدام البيض من الإناث التي تكون متماثلة اللواقح بالنسبة الطفرات المتنحية في الجينات تصبغ، مثل الذهبي أو البيضاء، يمكن دمجها مع الحيوانات المنوية المستمدة من السلالات البرية من نوع تحمل أليل طبيعية لنفس الجين تصبغ. في هذه الحالة، لأن الحيوانات المنوية المعالجة الأشعة فوق البنفسجية لا يمكن أن يساهم من النوع البري الأليلات الصباغ والأجنة مضاعفا فرداني ومتماثل يحمل طفرة الصباغ المتنحية. وبالإضافة إلى ذلك، diploids متماثل يحمل البرية من نوع التشكل في 24 HPF، في تناقض حاد مع التشكل فرداني أقل الموسعة. مزيج من ظهور مقهورة الأمهات وامبري العامس التشكل يؤكد نجاح الازدواجية الصيغة الصبغية. ويمكن الحصول على مزيد من التأكيد من خلال التهم كروموسوم الأجنة المعالجة وغير المعالجة.
نظام علامات وراثية المبين أعلاه، استنادا إلى علامات وراثية واضحة المتنحية، كما يسمح يؤكد عدم وجود الحمض النووي المشتقة من الحيوانات المنوية في ذرية، لأن الأجنة الناتجة يحمل البرية من نوع تصبغ إلا إذا الحيوانات المنوية لم المعطل بالكامل من قبل العلاج بالأشعة فوق البنفسجية . في حالة عدم وجود نظام لوضع علامات وراثية، يمكن أن يسمح عينة من الأجنة لتطوير في غياب الصدمة الحرارية للتأكد من أن جميع الأجنة يحمل التشكل فرداني في 24 HPF، وبالتالي كان ذلك تعطيل الحمض النووي الحيوانات المنوية الكامل. جنبا إلى جنب مع الحيوانات المنوية المعطل تماما، وهذا نفس نظام وضع علامات وراثية أيضا يسمح اكتشاف فشل الجسم القطبي عفوية المحتملين. ومثل هذا الحدث يؤدي إلى ظهور الأجنة ملحوظ مقهور مع التشكل مضاعفا من دون علاج diploidization. بو القطبي العفويلم يحترم فشل دى في الزرد ولكن ذكرت في مداري القيطم 18. إذا كان موجودا في نظام معين، فإن هذا الحدث عفوية يجب أن يتم تخفيض أو الخاضعة للرقابة من أجل تنفيذ أمثل التلاعب الصيغة الصبغية.
القيود المفروضة على تقنية
القدرة على إنتاج gynogenotes قابلة للحياة تعتمد على عدم وجود متغيرات جينية الخلفية التي عندما متماثل هي ضارة. وهكذا، فإن نجاح العملية تختلف تبعا للسلالة وراثية المستخدمة. وقد تبين أن اختيار السلالات الوراثية من خلال أجيال متعددة من تكون بيضي لتحسين قابلية 1.
طريقة HS2، عندما تستخدم بالاقتران مع الحيوانات المنوية غير المعالجة لإنتاج أجنة مضاعفا، كما يتيح إنتاج أجنة رباعي الصيغة الصبغية في ذات تردد عال. ومع ذلك، في هذه الحالة، ويرجع ذلك إلى مضاعفا لتحول رباعي الصيغة الصبغية، علامات وراثية لا تسمح بسهولة لتأكيد genom كلهالبريد الازدواجية. في هذه الحالة، يجب مراقبة المماطلة دورة خلية واحدة في الأجنة متزامنة واختيار الأجنة المجمدة تأمين اختيار رباعي الصيغة الصبغية، وتعول كروموسوم يمكن استخدامها لمزيد من تأكيد الصيغة الصبغية.
أهمية فيما يتعلق بأساليب الحالية / بديلة
على الرغم من وصفها Streisinger منذ أكثر من 40 عاما 1، لم يستخدم أسلوب HS القياسية على نطاق واسع بسبب ضعف العائد. بدلا من ذلك، قد اعتمد التلاعب الصيغة الصبغية بشكل حصري تقريبا على البديل وطريقة أكثر كفاءة نسبيا من الضغط المبكر، مما يؤدي إلى الازدواجية الصيغة الصبغية من خلال تثبيط الميتوزي الثاني. ومع ذلك، ونتائج الضغط في وقت مبكر في نسب متفاوتة من زيجوت متماثلة الألائل الجينات 9،19، مما يقلل قيمته كأداة الوراثية. تبين الدراسات الحديثة أن HS2، تعديل البروتوكول HS المعتاد، أي تطبيق نبض الحرارة في وقت آخر خلال دورة الخلية الأولى (من 22-24 فترة الحماية المتعددة الجنسيات في HS2، مقارنة مع 12-14 MPF في HS قياسي) نتائج في ما يصل إلى 4 مرات زيادة الغلة من الإنتاج مضاعفا متماثل.
العمل من نبض الحرارة يمكن أن يستدل على أن يحدث بحكم تثبيط الازدواجية المركزيه خلال فترة الصدمة الحرارية (22-24 MPF، خلال دورة الخلية الأولى)، والتي تفتقر بالتالي تكملة السليم لتوليد المغزل والتوسط انقسام الخلية خلال دورة التالية الخلية (50-65 MPF، المقابلة لدورة الخلية الثانية). الازدواجية المركزيه يمكن أن تستأنف في غياب الصدمة الحرارية خلال دورات خلية اللاحقة، ما يتيح تطوير المضي قدما بعد خلية واحدة كشك دورة الدقيق. بسبب الازدواجية المركزيه وتكرار الحمض النووي دورات مترابطة 20، تكرار الحمض النووي يمضي بشكل طبيعي حتى خلال تقسيم المتوقفة في دورة الخلية الثانية. هذه النتائج في الدقيقة الازدواجية الجينوم كاملة وتشكل زيجوت متماثلة الألائل كاملة.
التطبيقات المستقبلية
= "jove_content"> التلاعب الصيغة الصبغية هي طريقة مريحة لتسهيل التحليل الجيني. على وجه الخصوص، واقتران الإنتاج الجنين فرداني (من خلال التخصيب في المختبر مع الحيوانات المنوية المعالجة الأشعة فوق البنفسجية) والازدواجية الصيغة الصبغية (من خلال HS2) يسمح تشكل زيجوت متماثلة الألائل المباشرة (في جيل واحد) في نسبة عالية وثابتة (50٪) من الطفرات الموجودة في أنثى متخالف. وهذا بدوره يساعد على تجاوز الأجيال إضافية من شأنها أن تكون هناك حاجة للتوصل تشكل زيجوت متماثلة الألائل استخدام الصلبان الطبيعية، وتقليل كمية والمساحة اللازمة لمثل هذه المخططات الجينية. هذه الطريقة يمكن أن تسهل المخططات الوراثية مثل الشاشات وراثية، ولا سيما تلك التي تتطلب أجيال متعددة تشمل الجينات الكبار و / أو الدية تأثير، أو تلك التي تنطوي على أليلات متعددة، كما هو الحال في شاشات القامع / محسن 21.
نهج مماثل لHS2 يمكن تطبيقها على أنواع أخرى مع الإخصاب الخارجي، حتى أولئك الذين لا حاليا تستخدم أنظمة الوراثية. هذه الطريقةعلى وجه الخصوص يستفيد من فترة من الزمن من التسميد من خلال الشروع في ركوب الدراجات قسيم أرومي حيث نبض الحرارة يمكن أن يؤثر على الازدواجية المركزيه وإنشاء الدقيق كشك انقسام الخلايا وكلها الازدواجية الجينوم دون إحداث تأثيرات ضارة التنموية. وهكذا، يمكن استكشاف هذه الفترة الزمنية الأولى للحساسية الصدمة الحرارية لتطوير أساليب الوراثية الصيغة الصبغية القائم على التلاعب في أنظمة الحيوانية الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S3264 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| MgSO4-7H2O | Sigma | 63138 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Tricaine | Western Chemical | Tricaine-D (MS 222) | FDA approved (ANADA 200-226) |
| Tris base | Sigma | 77-86-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| HCl | Sigma | 920-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| Fish net (fine mesh) (4-5 in) | PennPlax | (ThatFishThatPlace # 212370) | available in ThatFishThatPlace |
| Plastic spoon | available in most standard stores | ||
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissecting forceps | Dumont | SS | available from Fine Science Tools |
| Dissecting stereoscope (with transmitted light source) | Nikon | SMZ645 | or equivalent |
| Reflective light source (LED arms) | Fostec | KL1600 LED | or equivalent |
| Petri plates 10 cm diameter | any maker | ||
| Eppendorf tubes 1.5 ml | any maker | ||
| Ice bucket | any maker | ||
| Pipetteman P-1000 | any maker | ||
| Pipette tips 1,000 µl | any maker | ||
| Narrow spatula | Fisher | 14-374 | |
| Depression glass plate | Corning Inc | 722085 (Fisher cat. No 13-748B) | available from Fisher Scientific |
| UV lamp | UVP | Model XX-15 (cat No. UVP18006201) | available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting) |
| UV glasses | any maker | ||
| Paper towels | any maker | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666-11 | available from Fisher Scientific |
| Timer stop watch | any maker | ||
| Wash bottle | Thermo Scientific | 24020500 | available from Fisher Scientific |
| Tea strainer | available in kitchen stores | ||
| beakers, 250 ml (2) | Corning Inc. | 1000250 | available from Fisher Scientific |
| water bath (2) | any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series) | ||
| Hanks’ Solution 1 | see above | see above | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O. Store at 4°C. |
| Hanks’ Solution 2 | see above | see above | 0.358 g Anhydrous Na2HPO4, 0.6 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O. Store at 4 °C. |
| Hanks’ Solution 4 | see above | see above | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O. Store at 4 °C. |
| Hank's Premix | see above | see above | add, in the following order: 10.0 ml Solution 1; 1.0 ml Solution 2; 1.0 ml Solution 4; 86.0 ml ddH2O; 1.0 ml Solution 5. Store at 4 °C |
| Hanks’ Solution 6 | see above | see above | 0.33 g NaHCO3 in 10 ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure. |
| Hank's Solution (final solution) | see above | see above | Combine 990 μl of Hank’s Premix and 10 μl of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution) |
References
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
- Heier, J., Takle, K., Hasley, A., Pelegri, F. Ploidy manipulation and induction of alternate clevage patterns through inhibition of centrosome duplication in the early zebrafish embryo. Dev. Dyn. 244, 1300-1312 (2015).
- Zhang, X., Onozato, H. Hydrostatic pressure treatment during the first mitosis does not suppress the first cleavage but the second one. Aquaculture. 240, 101-113 (2004).
- Zhu, X. P., You, F., Zhang, P. J., Xu, J. H., Sun, W. Effects of hydrostatic pressure on microtubule organization and cell cycle in gynogenetically activated eggs of olive flounder (Paralichthys olivaceus). Theriogenology. 68, 873-881 (2007).
- Vertii, A., Zimmerman, W., Ivshina, M., Doxsey, S. Centrosome-intrinsic mechanisms modulate centrosome integrity during fever. Mol. Biol. Cell. 26, 3451-3463 (2015).
- Walker, C. The zebrafish: Genetics and genomics. Vol. 60 Methods in Cell Biology. Detrich, W. H., Westerfield, M., Zon, L. I. , Academic Press. 43-70 (1999).
- Blanco-Vives, B., Sánchez-Vázquez, F. J. Synchronisation to light and feeding time of circadian rhythms of spawning and locomotor activity in zebrafish. Physiol. Behav. 98, 268-275 (2009).
- Dekens, M. P. S., et al. Light regulates the cell cycle in zebrafish. Curr. Biol. 13, 2051-2057 (2003).
- Pelegri, F., Schulte-Merker, S. The Zebrafish: Genetics and Genomics Vol. 60 Methods in Cell Biology. Detrich, W., Zon, L. I., Westerfield, M. , Academic Press. 1-20 (1999).
- Hart, N. H., Becker, K. A., Wolenski, J. S. The sperm entry site during fertilization of the zebrafish egg: localization of actin. Mol. Reprod. Dev. 32, 217-228 (1992).
- Tsaadon, A., Eliyahu, E., Shtraizent, N., Shalgi, R. When a sperm meets an egg: block to polyspermy. Mol. Cell. Endocrinol. 252, 107-114 (2006).
- Wong, J. L., Wessel, G. M. Defending the zygote: search for the ancestral animal block to polyspermy. Curr. Top. Dev. Biol. 72, 1-151 (2006).
- Rappaport, R., Rappaport, B. N. Establishment of cleavage furrows by the mitotic spindle. J. Exp. Zool. 189, 189-196 (1974).
- Wühr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W. I., Mitchinson, T. J. A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos. Curr. Biol. 20, 2040-2045 (2010).
- Yabe, T., Ge, X., Pelegri, F. The zebrafish maternal-effect gene cellular atoll encodes the centriolar component Sas-6 and defects in its paternal function promote whole genome duplication. Dev. Biol. 312, 44-60 (2007).
- Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes Dev. 18, 1527-1532 (2004).
- Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank's saline containing bovine serum albumin. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 6, 84-87 (1997).
- Roco, A. S., Olmstead, A. W., Degitz, S. J., Amano, T., Zimmerman, L. B., Bullejos, M. Coexistence of Y, W, and Z sex chromosomes in Xenopus tropicalis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, 4752-4761 (2015).
- Streisinger, G., Singer, F., Walker, C., Knauber, D., Dower, N. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112, 311-319 (1986).
- Dekens, M. P. S., Pelegri, F. J., Maischein, H. -M., Nüsslein-Volhard, C. The maternal-effect gene futile cycle.is essential for pronuclear congression and mitotic spindle assembly in the zebrafish zygote. Development. 130, 3907-3916 (2003).
- Pelegri, F., Mullins, M. Met. Cell Biol. Vol. 104. Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. , 83-120 (2011).
