Summary
En modificeret protokol for ploidi manipulation anvender en varmechok for at inducere en et-cyklus stall i cytokinese i det tidlige embryon. Denne protokol er påvist i zebrafisk, men kan gælde for andre arter.
Abstract
Manipulation af ploidi muliggør nyttige transformationer, såsom diploider til tetraploids eller haploider til diploider. I zebrafisk Danio rerio, specielt dannelsen af homozygote gynogenetic diploider er nyttig til genetisk analyse, fordi det tillader den direkte produktion af homozygoter fra en enkelt heterozygot mor. Denne artikel beskriver en modificeret protokol for ploidi dobbeltarbejde baseret på en varme puls under den første cellecyklus, Heat Shock 2 (HS2). Gennem inhibering af centriole overlapning, denne metode resulterer i et præcist celledeling stall under den anden cellecyklus. Den præcise én-cyklus division stall, koblet til upåvirket DNA dobbeltarbejde, resulterer i hele genomet dobbeltarbejde. Protokoller er forbundet med denne fremgangsmåde, indbefatter æg og sperm indsamling, UV-behandling af sædceller, in vitro-befrugtning og varme impuls til at forårsage en én-cellecyklus division forsinkelse og ploidi overlapning. En modificeret version af denne protokol kan anvendesat fremkalde ploidi ændringer i andre dyrearter.
Introduction
Denne protokol tillader manipulation af ploidi i zebrafisk embryoer, såsom i frembringelsen af homozygote gynogenetic diploider fra gynogenetic haploider (figur 1) eller produktionen af tetraploids. Dette opnås ved at inducere en forsinkelse i cytokinese svarende til netop en cellecyklus (figur 2A, 2B). Nøglen én-cyklus forsinkelse i cytokinese opnås ved behandling med varmeshock. Standardprotokollen af Heat Shock (HS) som oprindeligt beskrevet af Streisinger og kolleger involverede en temperatur puls i perioden 13-15 mpf, hvilket resulterer i en én-cyklus celledeling stall under den første cellecyklus 1. Effektiviteten af denne protokol er for nylig blevet forbedret ved at scanne de tidlige cellecyklus med en glidende tidsvindue af varme chokbehandling. Denne scanning identificeret et senere tidspunkt for et varmechok, stadig inden for den første celle cyklus (22-24 MPF), som resulterer i en højere brodeyos med en én-cyklus celledeling stall, som i dette tilfælde påvirker den anden cellecyklus 2. Den iagttagelse, at eksperimentelle manipulationer i den første cellecyklus forstyrre celledeling under den anden cellecyklus og forårsage DNA-indholdet overlapning er også blevet rapporteret i andre fiskearter 3,4. Vi henviser til denne modificerede protokol som Heat Shock 2 (HS2 - udtrykket "2" afspejler, at varmepulsen sker på et senere tidspunkt end standard HS metode, og at cellecyklus forsinkelse forårsaget af HS2 forekommer under den anden cellecyklus ). Disse undersøgelser viste, at grundlaget for cytokinese arrest efter varmechok er inhiberingen af centriole overlapning under varmen puls, som påvirker spindeldannelse og fure induktion i følgende cellecyklus. HS2 resulterer i udbytter af cellecyklusstop nærmer 100%, og satser ploidi dobbeltarbejde op til 4 gange højere end standard HS 2.
Embryoner behandlet witha varmechok under blastomer cellecyklus udviser mange skadelige virkninger, tyder på, at varmechok påvirker flere processer, der kræves for celledeling 2. På den anden side, hvis varmen chok påføres forud for indledningen af cellecyklus (tidsperiode 0-30 MPF), det ser ud til at have virkninger i overensstemmelse med specifikke indgreb centriole dobbeltarbejde og synes ikke at påvirke andre væsentlige celle processer 2 . Disse undersøgelser viste, at tiden forud for indledningen af blastomer division synes at være en udviklingsperiode modtagelig for hjælp Heat Shock som et redskab til specifikt at manipulere ploidi gennem centriole hæmning. Den underliggende årsag til den tilsyneladende selektivitet for varmechok på centriole overlapning er ukendt, men kan være relateret til en selektiv nedbrydning af centrosom substrukturer observeret under varmestress i visse celletyper, såsom leukocytter 5.
Temporal synkronisering af embryonale deling opnås ved in vitro fertilisering (IVF). Anvendelse af ubehandlet sperm under befrugtning resulterer i diploide embryoner at ved HS2-induceret én-cyklus cytokinese stall bliver tetraploid. Anvendelse af UV-behandlede sædceller, som bærer tværbindinger som inaktiverer sit DNA, resulterer i gynogenetic haploide embryoner 6, som ved HSII-induceret én-cyklus cytokinese stall bliver gynogenetic diploider 2. På grund af den resulterende hele genomet overlapning, sidstnævnte gynogenetic diploider er homozygote på hvert enkelt locus tværs genomet. For koncis, henviser vi til gynogenetic haploide embryoner som "haploider", og homozygote gynogenetic diploide embryoner som "homozygote diploider". Hvis levedygtig og frugtbar, kan homozygote diploider bruges til at indlede sterile og dødelige-fri linjer. Direkte homozygoti induceret af HS2 bør også let inkorporeres i genetisk analyse eller genetiske skærme, da homozygote diploider fra hundyr, som er heterozygote bærere af muttioner udviser satser homozygositet ved høje og faste (50%) nøgletal 2.
Følgende protokol beskriver trin for at udføre HS2 og inducerer ploidi overlapning med fuld homozygoti. For tetraploid produktion, bør sperm løsning være ubehandlet. For homozygot diploid produktion, bør sperm inaktiveres ved UV-behandling. Endvidere som beskrevet i diskussionen, synlige pigment markører kan også anvendes til at lette identifikation af homozygote diploider. Zebrafisk mate primært i den første 3 timer om indledningen af deres lys cyklus 7, og både voksne og æg er følsomme over for døgnrytmen 8, så de bedste resultater bør ske IVF procedure inden for denne periode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter dyr blev udført i henhold til University of Wisconsin - Madison og Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) retningslinjer (University of Wisconsin - Madison Assurance nummer A3368-01).
1. Valg af Hunner for Egg Collection via afbrudt Parring
BEMÆRK: IVF-baserede protokoller stole på ekstrudering af modne æg fra kvinder via manuel tryk 9. Tidligere protokoller har benyttes hundyr direkte fra tanke eller i par parringer uden hunnerne undergår æg frigivelse adfærd, men kun en lille brøkdel af disse hunner (ca. 20% eller mindre, afhængig af zebrafisk linje), hvilket gav ekstruderede og kompetente æg ved manuelt tryk. I en forbedret procedure, hunner er forsorteret til æglægning ved direkte visuel observation, efterfulgt af øjeblikkelig afbrydelse af parring. Denne procedure er meget effektiv, da næsten alle hunner forhånd udvalgt gennem denne afbrudte parring trin udbytte ekstruderede og kompetente ægved manuelt tryk.
- Om eftermiddagen før forsøget, oprettet parring par af den ønskede zebrafisk stammen i standard zebrafisk parring bokse. Hold hanner i samme kammer som hunner endnu fysisk adskilte fra dem, enten via en parring kasse division eller ved at placere den mandlige under et æg-æglæggende indsatsen og kvindelige inden i indsatsen.
- Om morgenen for eksperimentet fjerne fysiske partition, anbringelse både mandlige og kvindelige inden for samme æglægning insert, således at parring begynder.
- Efterse tanke, der indeholder parring par at opdage ekstrudering af æg under naturlig parring. Ved de første tegn på æg strengpressede, separat mandlige og kvindelige at afbryde avl. Efter adskillelse fra hanner, holde de foreløbigt udvalgte hunner enten separat eller fælles i den samme tank. Brug flere hunner afhængigt af antallet af embryoner ønskede (typisk 50-150 æg / kvinde).
2. Forberedelse af en Sperm Solution
BEMÆRK: IVF rElies om eksponering af modne æg til en sædcelle opløsning. Denne løsning kan være ubehandlet, til at generere diploide zygoter (som ved HS2 behandling bliver tetraploide embryoner) eller UV-behandlet til generering haploide zygoter (som ved HS2 behandling bliver homozygote diploide embryoner). Tidligere sperm forberedelse protokoller foreslog at benytte kapillarrør til at indsamle milt fra den anale region af levende hanner, men dette var en ineffektiv proces, da kun en lille brøkdel af hanner viste Milt 9. Protokollen nedenfor bygger i stedet på sæd forberedelse fra klippet dissekerede testiklerne, som giver mere pålidelige resultater.
- Forbered Hanks opløsning forud for tid som Hanks præmix, bestående af alle komponenter (opløsninger 1, 2, 4 og 5) undtagen natriumbicarbonatopløsning (Løsning 6). Forbered Løsning 6 friske og føje til forblandingen morgenen for eksperimentet (tabel 1). For at gøre Hanks opløsning (endelig opløsning, forberede morgenen denIVF procedure), kombinere 990 ul Hanks Premix og 10 pi af frisk gjort Løsning 6.
- Afliv mænd ved overeksponering for tricaine som en 0,016% opløsning i konditioneret vand.
- Forbered tricaine som en 0,2% stamopløsning i vand (puffer til pH 7,0 med 1 M Tris, pH 9,0) og holde ved 4 ° C. Tilsæt 8 ml tricaine stamopløsning pr 100 ml vand i et bægerglas, og bruge et net til at overføre hannerne til tricaine opløsning.
- Anvendes en ækvivalent af testiklerne for én mand pr kobling er nødvendig for at blive befrugtet i et volumen på Hanks opløsning svarende til 100 pi pr mænd (f.eks testikler fra 10 hanner opsamlet i 1 ml Hanks opløsning, at gøde 10 koblinger med 100 pl / clutch).
- Bekræft dødshjælp ved ophør af gill bevægelser i 15 minutter. Efter eutanasi, fjerne hanner fra bægeret med en ske. Skyl hannerne kortvarigt med konditioneret vand og tør dem let ved at placere dem kort på flere placeringer af enkøkkenrulle.
- For at fjerne testiklerne, først halshugge aflives hanner bruger dissekere saks eller et barberblad, og gøre en langsgående snit langs maven med dissekering scissors.Under et dissektionsmikroskop med en reflekteret lyskilde, fjerne indre organer med dissekere pincet. Træk hver af testiklerne masserne med pincet og placere dem inde i mikrocentrifugerør indeholdende Hanks opløsning.
BEMÆRK: Testikler kan identificeres som hver af to langstrakte strukturer gennemskinnelige udseende fundet sammen kroppen vægge og der konvergerer nær kloakken. Testes kan bo 2-3 min på en petriskål overflade efter dissektion og før du placerer dem i Hanks løsning. - Slip sperm i opløsningen ved forskydning testiklerne med en smal spatel og / eller forsigtigt at pipettere op og ned 5-6 gange testiklerne i opløsning med en 1.000 pi-tip mikropipette, og samtidig undgå luftboble formation. Lad testiklerne vragrester bosætte.
- sperm løsning i is, hvor det kan holde sin styrke i op til 2-3 timer opbevares. Hvis du fortsætter til UV-behandling af sæd løsning, hvorefter opløsningen overføres til et rent mikrocentrifugerør forlader stykker af testiklerne bag.
3. UV-behandling
BEMÆRK: UV-behandling anvendes til at tværbinde sperma DNA for at gøre det inaktivt i embryoet. Dette trin anvendes kun, når der producerer gynogenetic haploide eller homozygote gynogenetic diploide embryoner. Sperm løsning for UV-behandling skal være adskilt fra stykker af testikler (trin 2.4), som store stykker kan afskærme sæd fra UV behandling.
- Overfør sperm opløsningen til en ren, tør brønd af en depression glasplade sidder på en is seng (f.eks is inde i en petriskål). Brug op til 1 ml sæd opløsning pr glasplade godt.
- Udsætte sperm løsning for UV ved at placere depression glasplade på isen sengen under en UV-lampe. Behandl sperm opløsning i 90 sekunder med en 115 V (60 Hz, 0.68A) UV-lampe i en 19 cm (7,5 inches) afstand. Med afslutningen af en pipettespids, forsigtigt blande opløsningen hver 30 sekunder under UV-behandling (brug en ren pipettespids hver 30 sek).
- Ved hjælp af en ren pipettespids og mikropipette, overføre den behandlede sperm opløsningen til en ny mikrocentrifugerør. Opbevar på is indtil de skal bruges til IVF (ikke længere end 2-3 timer fra ekstraktion).
4. Manuel Ekstrudering af modne æg
BEMÆRK: Kvinder fremstillet ved afbrydelse af naturlige parringer vil let give æg under anæstesi og manuel tryk. Under denne procedure, bør tricaine behandling nøje kontrolleret for at undgå overeksponering, som kan forhindre inddrivelse af hunnerne.
- Bedøver hunner efter lyseksponering til tricaine opløsning: overførsel hunner med en mål tricaine opløsning i konditioneret vand (fremstillet ved tilsætning af 8 ml tricaine 0,2% stamopløsning til 100 ml konditioneret fisk vand) i ca. 2-5 min, indtil fisk stopper gælle bevægelse. <li> Så snart en kvindelig stopper gælle bevægelse, brug en ske til at indsamle det og kortvarigt skyl det i konditioneret vand. Stadig bruger skeen til at bevæge fisken, tør det let ved at placere det kort og flere gange på flere steder af en køkkenrulle, og derefter overføre det til en ren, tør 10 cm petri diameter plade. Tilgang fisken med skeen i den forreste til bageste retning, for at undgå potentielt beskadige gælle Laag.
- Brug lab klude eller blødt væv til forsigtigt yderligere tørre gatfinne område, for at forhindre eventuelle frigivne æg fra for tidligt at blive aktiveret af vand. Afdæmpende fingrene let med vand (for at undgå dem stikning til fiskeskæl), placere en finger af en hånd på kvindens tilbage som støtte, og med en finger på den anden side anvender let tryk langs den kvindelige underliv indtil æggene bliver ekstruderet.
- Brug en smal spatel til at flytte æg fra kvindens krop. Placer kvindelige tilbage i en tank med konditioneret vand til nyttiggørelse.
- Aktivér (med eksponering vand) og gøde (med sperm løsning tilføjelse) æg samtidig og inden 90 sekunder efter ekstrudering (se afsnit 5).
5. In vitro-befrugtning
BEMÆRK: Zebrafisk befrugtning i naturlige kors er ekstern, afhængig af den samtidige frigivelse og aktivering af vand af æg og sæd under parring. In vitro befrugtning efterligner denne proces ved at udsætte æggene til sædceller opløsning i nærvær af vand. Vandmængde er oprindeligt lille (1 ml) for at øge den effektive koncentration af sædceller. Binding af sæd sker inden 15-20 sek 10 </ Sup>, og vandmængde kan derefter øges. Chorion løft bidrager yderligere til den tætte synkronisering af koblingen ved at begrænse vinduet til kompetencen til sperm binding 11,12. De resulterende embryoer udviser derfor stort set samtidige celledelingscykler løbet spaltningsprodukterne faser tidligt.
- Tilsæt 100 pi sperm opløsning (svarende til hvad der svarer til testikler fra en mand - se del 2) til kobling af ekstruderede æg på en petriskål. Vend forsigtigt pipettespidsen bruges til at tilføje sæd løsning blandt æggene at blande sæd og æg sammen, og sørg for ikke at løfte spidsen fra overfladen af petriskålen for at undgå skader æg.
- Umiddelbart aktivere æggene ved at tilsætte 1 ml embryonale medium (E3) løsning (konditioneret vand er også acceptabel som en erstatning for E3 i del 5 til 7) og igen forsigtigt blandes æg og sædceller ved forsigtigt hvirvlende med pipettespidsen. Start en timer til at indlede timing i forhold til befrugtning. Ved en mpf i 1 ml volumen, oversvømme pladen med E3. Før du fortsætter, henstår, indtil 10-12 mpf at tillade æg aktivering, herunder fuld chorion ekspansion.
6. Heat Shock Treatment
BEMÆRK: En varmechok anvendt i det tidlige embryon inhiberer centriole overlapning, hvilket resulterer i en ufuldstændig komplement af centrioler at drive spindeldannelse under den efterfølgende cellecyklus 2. Fraværet af spindlen igen resulterer i manglende furen formation 13.
- Efter udvidelse af chorions (10-12 MPF), hæld embryoner fra petriskålen i en tesi. Skyl petriskål med en vaskeflaske med E3 for at indsamle de resterende embryoner i tesi.
- Placer tesi med embryonerne inde et bæger i en forvarmet bad med E3 ved 28,5 ° C. Pre-ligevægt bægeret og E3 til vandbad temperatur, og sørg for der er nok E3, således at alle embryoner i tesi er udsat for mediet.
- På 22 mpf, fjerne tesi fra 28,5 ° C vandbad, kort skamplet det på et stykke køkkenrulle for at fjerne overskydende fugt, og læg den i en tilsvarende forvarmet E3 bæger i en varme bad ved 41,4 ° C.
- Ved 24 mpf, overføre tesi tilbage til E3 i vandbad ved 28,5 ° C efter kort blotting. På 29 mpf, bruge en vask flaske med E3 at overføre embryoner fra tesi til en 10 cm Petri plade.
7. Valg til Embryoner med en One-cycle Cytokinese Stall
- I tidsperioden 35-45 mpf, under et dissektionsmikroskop med et transmitteret lyskilde, skal du vælge disse embryoner, der er under symmetriske spaltning i to-celle stadiet, og som derfor befrugtet. Fjern embryoner, der ikke undergår celle spaltning.
- Fortsæt observere befrugtede embryoner, der er udvalgt til normal celledeling under den første cellecyklus, og under secOND cellecyklus (50-65 MPF).
- Sorter embryoner i henhold til de følgende kategorier (Figur 2C): 4 celler ( "ingen stall", i 2: 2 arrangement standard for en 4-celle embryon); 3 celler ( "delvis stall", i en afvigende 2 mindre celler: 1 stor celle arrangement); og 2-celler ( "kørt fast", embryoer udviser en en-cellecyklus forsinkelse i en 1: 1 arrangement identisk med en 2-celle embryoer). Sortere den strandede embryoner i en frisk petriskål.
BEMÆRK: På dette tidspunkt, embryoner i 2: 2 arrangement, svarer til dem, hvor under den anden cellecyklus hverken blastomer undergik en celledeling stall; embryoner i en afvigende 2 mindre celler: 1 stor celle arrangement svarer til dem, hvor varmeshock forårsagede en cellecyklus stall under den anden cellecyklus i en blastomer men ikke den anden; og embryoner "gået i stå" i en 1: 1 arrangement svarer til dem, hvor der i den anden cellecyklus begge blastomererne undergik den ønskede celledelinggå i stå. Gået i stå embryoner bør genoptage celle spaltning under den følgende cellecyklus periode (65-80 MPF). Arrangementet af blastomererne kan være variabel, på grund af ufuldstændige signaler fra den foregående cellecyklus at stabilisere spindlen 2,14, men de fleste embryoer vil danne en forholdsvis normal blastula der kan undergå normale udvikling. - Tillad embryoner at udvikle sig i Petri plade, med en grænse på 80 embryoner pr 10 cm plade. På 24 HPF, observere embryoner at afgøre, om de har en normal morfologi karakteristisk for diploide eller homozygote diploide embryoner 6 (normal grad af akse forlængelse (figur 3A, 3C)), i modsætning til reduceret akse udvidelse og øget krop tykkelse karakteristisk for haploider (figur 3B)), og / eller vurdere diploidization anvende genetiske pigment markører ved 36 mpf, såsom gylden eller albino og andre sådanne assays (figur 3 og se nedenfor) 2,6,9. Fjern eventuelle embryoner, der synes at have en haploid morfologi, eller som har lyseres eller udviser andre groft unormale defekter.
BEMÆRK: Hvis det ønskes, give embryoer at udvikle sig indtil 5 dage efter befrugtning, samtidig med at fjerne lyserede eller groft unormale fostre på daglig basis og tilføje frisk E3 for at opdatere mediet. BEMÆRK: Surviving embryoner kan også dyrkes efter swimbladder inflation på dag 5 ved at overføre til et rugeri, og fodring under standardbetingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
På trods af en-cellecyklus cytokinese stall, DNA-replikation forekommer normalt i sådanne embryoner, hvilket resulterer i overlapning af DNA-indholdet af embryo (figur 1). Den Streisinger Heat Shock protokol (standard HS) involverer en varme puls i perioden 13-15 minutter efter befrugtning (MPF) og inducerer primært cytokinese anholdelse under den første embryonale celledeling ved 35 MPF 1,2, mens den afledte her beskrevne fremgangsmåde, benævnt Heat shock 2 (HS2), anvender en varmechok i perioden 22-24 mpf og inducerer cytokinese arrest i andet embryonisk celledeling ved 50 mpf (figur 2; 2,3,4). Ved 24 HPF, observation af embryonerne tillader bestemmelse af, om de har en normal morfologi karakteristisk for diploide eller homozygote diploide embryoner, eller den kortere og bredere krop akse morfologi karakteristisk for haploide embryoner (figur 3)
Figur 1: befrugtning typer. (A) Naturlig parring. Mandlige og kvindelige kønsceller er ubehandlet, hvilket resulterer i en naturlig diploid. (B) Den sæd behandles med UV, hvilket resulterer i ødelæggelse af den faderlige DNA og produktion af haploide zygoter. Hvis ubehandlet, behøver sådanne haploider ikke overleve fortid dag 2-3 af udvikling. (C) Behandling af haploide zygoter med Heat Shock 2 (HS2) hæmmer en cyklus af cytokinese af mitose i det tidlige embryo. Denne celle cyklus stall, pard til upåvirket DNA-replikation, genererer homozygote diploider, der kan blive levedygtige og frugtbare voksne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: HS2 fremmer hele genomet dobbeltarbejde ved at stå den anden celle cyklus. (A) Cell spaltning mønster af en ubehandlet embryo i de tre første cellecyklus, svarende til 2-, 4- og 8-celle embryoer. (B) HS2 behandling resulterer i en én-cyklus stall af celledeling i anden cellecyklus. Under stall, igangværende DNA syntese resulterer i embryoner undergår diploidization, fra enten haploide til diploide (n -> 2n) eller diploide at tetraploide (2n -> 4n) (se tekst). Efter denne stall, genoptager embryo celledeling, med newly erhvervet ploidi. (C) HS2-behandlede embryoer kan udvise en række blastomer arrangementer afhængigt af, om blastomerer udviser en celledeling forsinkelse under den anden cellecyklus: i) "ingen stall": hverken blastomer udviser en forsinkelse, hvilket resulterer i et 2: 2 arrangement er karakteristisk for 4-celle embryoer fase, ii) "delvis stall": kun én af to blastomererne udviser en forsinkelse, hvilket resulterer i en afvigende 2: 1 arrangement, og iii) "stå": begge blastomererne udviser en forsinkelse, hvilket resulterer i en 1: 1 arrangement er karakteristisk for 2-celle embryoer. I (A - C), er kerner repræsenteret som blå cirkler, med diploidization begivenhed repræsenteret ved en udvidelse af den nukleare størrelse. Se reference 2 for en diagram, der viser centriolar adfærd som det foreslåede grundlag for celledeling stall. Klik her for at se et større versipå denne figur.
Figur 3: Morfologi af naturlige diploider, haploider og gynogenotes. (A) Normal embryonale morfologi en diploid opnået gennem naturlige kors. (B) Haploide embryoer udviser en kortere og bredere krop akse. (C) Homozygote diploider har normal organ morfologi. Embryoner desuden bære en recessiv mutation i pigmentering gen gyldne at lette sporing forældrenes DNA arv: mødre er homozygote bærere for en mutation i gylden, og fædre vildtype for dette gen. Således naturlige diploider, heterozygote for gyldne, udviser vildtype pigmentering, mens begge haploider (hemizygote for gyldne) og homozygote diploider (homozygote for gyldne) udviser mutant pigmentering. Scale bar = 0,5 mm. Paneler modificeret fra rekonference 2, genoptrykt med tilladelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Løsning | komponenter | Opbevaringsbetingelser |
| Hanks Løsning 1 | 8,0 g NaCl, og 0,4 g KCI i 100 ml Hedeselskabet 2 O | Opbevares ved 4 ° C |
| Hanks Opløsning 2 | 0,358 g Vandfrit Na 2 HPO 4, og 0,6 g KH 2 PO 4 i 100 ml Hedeselskabet 2 O | Opbevares ved 4 ° C |
| Hanks Opløsning 4 | 0,72 g CaCl2 i 50 ml Hedeselskabet 2 O | Opbevares ved 4 ° C |
| Hanks Løsning 5 | 1,23 g MgSO4 ∙ 7H 2 O i 50 ml Hedeselskabet 2 O | Opbevares ved 4 ° C |
| Hanks Premix | Tilføje, i følgende rækkefølge: 10,0 ml Opløsning 1, 1,0 ml 2, 1,0 ml Opløsning 4, 86,0 ml ddH2O, og 1,0 ml Løsning 5 | Opbevares ved 4 ° C |
| Hanks Løsning 6 | 0,33 g NaHCO3 i 10 ml Hedeselskabet 2 O | Forbered frisk om morgenen den IVF procedure |
Tabel 1. Fremstilling af Hanks løsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin
Det er afgørende at arbejde under forhold med effektiv in vitro-befrugtning. For at sikre et godt udbud af modne æg (trin 1), hunner oprettet til parring ikke burde have været oprettet i parring kors i mindst 5 dage og skal vises gravid. Under afbrydelse af avl, kan en observatør overvåge 15-30 tanke tilstrækkeligt for den første forekomst af naturlige æg ekstrudering. Afbrydelse af parring bør ske så hurtigt som muligt, når de første æg er frigivet gennem naturlige parringer, således at de fleste æg til at forblive inde hunnerne for IVF procedure. Disse hunner, som nu er klar til manuel ekstrudering af modne æg, kan holdes adskilt i op til 2 timer uden en tydelig effekt på efterfølgende æg frigivelse. Til fremstilling af en effektiv sperm opløsning (trin 2), bør hanner fremstår robuste og helst med et rødligt skær, som er karakteristisk for avl zebrafisk hanner. En ren dissektion indebærer typisk remoVing tarm spor ved at trække den mod til den bageste af kroppen, og svømme blære ved at trække den anteriort. Efter fjernelse af centrale indre organer, testiklerne forblive som gennemskinnelige langstrakte masser side om side af indvendige legeme væg. Undgå herunder uønskede organer (f.eks indvolde) ind i sperm løsning; hvis det er nødvendigt at adskille disse fra testiklerne ved at arbejde på en tør petriskål overflade inden det bringes ind i Hanks løsning. For at opnå høje fertilisationsgrader under IVF (trin 4), er det vigtigt, ekstruderede æg opretholdes kompetente indtil sperm tilsætning. Æg kompetente til befrugtning udviser en svagt gul tone og er gennemsigtig. Undgå æg med en eller kontakt med vand før sperm Eftersom vand vil udløse æg aktivering og for tidlig aktivering hinder befrugtning. Vand aktivering og befrugtning bør ske inden 90 sek af ekstrudering fra hunnen for at undgå dehydrering af æggene, som vilføre til deres nedbrydning. Hvis det er nødvendigt, kan ekstruderede æg skal opbevares i længere perioder (op til 1,5 timer eller mere) i 100-200 ml Hanks løsning suppleret med 0,5% bovint serumalbumin (BSA) 17 (i forbindelse med forberedelsen af Hanks løsning til dette specifikke formål, forberede forblandingen at korrigere for vandindhold tilsættes under BSA tilskud). Hvis æg er blevet holdt kompetente ved hjælp af Hanks BSA-opløsning, fjerne overskydende Hanks BSA fra æggene ved anvendelse af en mikropipette og befrugte inden for 1 min.
Et afgørende skridt for succes i diploidization hjælp HS2 er sortering af strandede embryoner (trin 7). Indledende sortering af symmetrisk spalte 2-celle embryoer vælger for embryoner, der bliver befrugtet og begynder celledeling (lejlighedsvis dispermy under IVF resultater i embryoner, overgang direkte fra 1- til 4-celler ved 35-50 mpf - sådanne embryoner skal kasseres). Cell cykling sker hver 15 minutter i løbet af disse tidlige embryonale staldre (35-50 MPF for første cellecyklus, 50-65 MPF for den anden cellecyklus, og så videre), så sortering spalte embryoner i de første 10 minutter af hver celle cyklus sikrer et fravær af overlapning mellem cykler og præcise identifikation af en celledeling stall.
Ændringer og fejlfinding
Styrken af UV-behandling i trin 3 (f.eks eksponeringstid, lampe magt, afstand til lampe) kan justeres efter behov ved at teste de første fertilisationsgrader samt hyppigheden af haploider i fravær af efterfølgende HSII behandling: den korrekte mængde UV eksponering ikke har en mærkbar effekt på fertilisationsgrader mens resulterer i 100% af haploide embryoner (se Repræsentative resultater til at skelne haploide fra diploide embryoner). For meget UV eksponering forårsager reducerede fertilisationsgrader formentlig på grund af skadelige virkninger på sperm funktion, mens utilstrækkelig UV eksponering producerer diploide embryoner grund to ufuldstændig inaktivering af sperma DNA.
Hvis embryoner udviser udviklingsmæssige defekter eller letalitet efter genoptagelsen af celle spaltning (trin 7), kan varmen chok temperaturen i trin 6 blive reduceret en smule (f.eks til 41,0 ° C) for at øge embryo overlevelse; betingelser, der resulterer i omtrent lige store fraktioner af afvigende 3-celle og strandede 2-celle embryoer i løbet af anden celle cyklus (og derfor nær grænsen til en effekt på centriolar dobbeltarbejde) resulterer i minimale efterfølgende udviklingsmæssige defekter og øget overlevelse efter genoptagelsen af cellecyklus .
Den HS2-metoden indeholder en praktisk og iboende mekanisme til at vurdere celledeling stall (og derfor hele genomet dobbeltarbejde), da direkte observation af embryoner, som de udvikler tillader sporing af de forskellige celle cyklusser. Manuelt valg af embryoner, der har undergået en én-cellecyklus division stall tillader frembringelse af en ensartet population af diploidized embryos. HS2 kan udføres i enhver zebrafisk genetisk stamme (f.eks AB, Tübingen, WIK), som one-celledeling stall virker som en iboende mekanisme til at bekræfte DNA overlapning. Derudover kan synlige genetiske markører indført i stammen anvendes til at lette identifikationen af diploidized embryoner (figur 3). For eksempel er anvendelsen af æg fra hunner, der er homozygote for recessive mutationer i pigmentering gener, såsom gylden eller albino, kan kombineres med sæd afledt af vildtype-stammer, der bærer normale alleler for samme pigmentering genet. I denne situation, fordi UV-behandlede sædceller ikke kan bidrage vildtype pigment alleler, haploide og homozygote diploide embryoner udviser den recessive pigment mutation. Desuden homozygote diploider udviser vildtype morfologi ved 24 HPF, i skarp kontrast til den mindre udvidede haploide morfologi. Kombinationen af udseendet af moderens recessivt træk og samlet Embryo morfologi bekræfter succesfuld ploidi dobbeltarbejde. Yderligere bekræftelse kan fås gennem kromosom tællinger af behandlede og ubehandlede embryoner.
Det ovenfor beskrevne genetiske mærkning system baseret på recessive synlige genetiske markører, tillader også bekræfter fraværet af sæd afledt DNA i afkommet, idet de resulterende embryoer udviser vildtype pigmentering, hvis sædceller ikke er fuldt inaktiveret ved UV-behandling . I fraværet af en genetisk mærkning system, kan en prøve af embryoner får lov til at udvikle sig i fravær af varmechok at bekræfte, at alle embryoner udviser den haploide morfologi ved 24 HPF, og således at sperma DNA inaktivering var fuldstændig. I forbindelse med fuldt inaktiveret sperm, den samme genetiske mærkningssystem også tillader detektering potentiel spontan polar krop fiasko. En sådan begivenhed ville resultere i fremkomsten af recessivt markerede embryoner med diploid morfologi uden diploidization behandling. Spontan polar body fiasko er ikke blevet observeret i zebrafisk, men er rapporteret i Xenopus tropicalis 18. Hvis det findes i et givet system, ville denne spontane begivenhed skulle reduceres eller kontrolleres efter for at optimalt gennemføre ploidi manipulation.
Begrænsninger af teknikken
Evnen til at producere levedygtige gynogenotes beror på manglende baggrund genvarianter, som når homozygot er skadelig. Således vil udfaldet jo variere afhængigt af den genetiske anvendte stamme. Udvælgelse af genetiske stammer gennem flere generationer af gynogenesis har vist sig at forbedre levedygtighed 1.
Den HS2 metode, når de anvendes sammen med ubehandlede sædceller til at producere diploide embryoner, tillader også produktion af tetraploide embryoner ved en høj frekvens. Men i dette tilfælde, på grund af den diploide til tetraploid transformation, genetiske markører ikke let tillader bekræftelse af hele genome dobbeltarbejde. I dette tilfælde bør observation af en cellecyklus stall i synkroniserede embryoner og udvælgelse af strandede embryoner forsikre tetraploid udvælgelse, og kromosom- tællinger kan anvendes til yderligere at bekræfte ploidi.
Har betydning for eksisterende / alternative metoder
Selvom beskrevet af Streisinger over 40 år siden en, standard HS metode har ikke været meget anvendt på grund af dårlig udbytte. I stedet har ploidi manipulation næsten udelukkende påberåbt på alternative og relativt mere effektiv metode til tidlig Pressure, hvilket resulterer i ploidi duplikering gennem hæmning af den anden meiotiske deling. Men Tidlige tryk resulterer i variable andele af gen homozygositet 9,19, hvilket mindsker sin værdi som en genetisk værktøj. Nylige undersøgelser viser, at HS2, en modifikation af standard HS-protokollen, nemlig anvendelse af varmen pulsen på et andet tidspunkt i løbet af den første celle cyklus (den 22-24MPF periode i HS2, sammenlignet med 12-14 mpf i standard HS) resulterer i op til 4 gange forøget udbytte af homozygote diploide produktioner.
Virkningen af varmepulsen kan udledes at forekomme på grund af hæmningen af centriole overlapning i den tid af varmechok (22-24 mpf, under den første cellecyklus), som derfor mangler den rigtige supplement til at generere en spindel og mediere celledeling under den efterfølgende cellecyklus (50-65 mpf, svarende til den anden cellecyklus). Centriole overlapning kan genoptages i fravær af varmechok under efterfølgende cellecyklus, hvilket tillader udvikling kan fortsætte efter en præcis én-cellecyklus stall. Fordi centriole dobbeltarbejde og DNA replikation cykler er indbyrdes afhængige 20, DNA-replikation forløber normalt selv under gået i stå division i den anden celle cyklus. Dette resulterer i præcis hele genomet dobbeltarbejde og komplet homozygosis.
Fremtidige anvendelser
21.
Approaches ligner HS2 kan anvendes på andre arter med ekstern befrugtning, selv dem, der ikke i øjeblikket anvendes som genetiske systemer. denne fremgangsmådeisær udnytter en periode fra befrugtning gennem indledningen af blastomer cykling hvor en varme puls kan påvirke centriole dobbeltarbejde og generere en præcis celledeling stall og hele genomet dobbeltarbejde uden at producere skadelige udviklingsmæssige effekter. Således kan denne tidlige periode undersøges for varmechok følsomhed at udvikle ploidi manipulation-baserede genetiske metoder i andre animalske systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S3264 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| MgSO4-7H2O | Sigma | 63138 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Tricaine | Western Chemical | Tricaine-D (MS 222) | FDA approved (ANADA 200-226) |
| Tris base | Sigma | 77-86-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| HCl | Sigma | 920-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| Fish net (fine mesh) (4-5 in) | PennPlax | (ThatFishThatPlace # 212370) | available in ThatFishThatPlace |
| Plastic spoon | available in most standard stores | ||
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissecting forceps | Dumont | SS | available from Fine Science Tools |
| Dissecting stereoscope (with transmitted light source) | Nikon | SMZ645 | or equivalent |
| Reflective light source (LED arms) | Fostec | KL1600 LED | or equivalent |
| Petri plates 10 cm diameter | any maker | ||
| Eppendorf tubes 1.5 ml | any maker | ||
| Ice bucket | any maker | ||
| Pipetteman P-1000 | any maker | ||
| Pipette tips 1,000 µl | any maker | ||
| Narrow spatula | Fisher | 14-374 | |
| Depression glass plate | Corning Inc | 722085 (Fisher cat. No 13-748B) | available from Fisher Scientific |
| UV lamp | UVP | Model XX-15 (cat No. UVP18006201) | available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting) |
| UV glasses | any maker | ||
| Paper towels | any maker | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666-11 | available from Fisher Scientific |
| Timer stop watch | any maker | ||
| Wash bottle | Thermo Scientific | 24020500 | available from Fisher Scientific |
| Tea strainer | available in kitchen stores | ||
| beakers, 250 ml (2) | Corning Inc. | 1000250 | available from Fisher Scientific |
| water bath (2) | any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series) | ||
| Hanks’ Solution 1 | see above | see above | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O. Store at 4°C. |
| Hanks’ Solution 2 | see above | see above | 0.358 g Anhydrous Na2HPO4, 0.6 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O. Store at 4 °C. |
| Hanks’ Solution 4 | see above | see above | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O. Store at 4 °C. |
| Hank's Premix | see above | see above | add, in the following order: 10.0 ml Solution 1; 1.0 ml Solution 2; 1.0 ml Solution 4; 86.0 ml ddH2O; 1.0 ml Solution 5. Store at 4 °C |
| Hanks’ Solution 6 | see above | see above | 0.33 g NaHCO3 in 10 ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure. |
| Hank's Solution (final solution) | see above | see above | Combine 990 μl of Hank’s Premix and 10 μl of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution) |
References
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
- Heier, J., Takle, K., Hasley, A., Pelegri, F. Ploidy manipulation and induction of alternate clevage patterns through inhibition of centrosome duplication in the early zebrafish embryo. Dev. Dyn. 244, 1300-1312 (2015).
- Zhang, X., Onozato, H. Hydrostatic pressure treatment during the first mitosis does not suppress the first cleavage but the second one. Aquaculture. 240, 101-113 (2004).
- Zhu, X. P., You, F., Zhang, P. J., Xu, J. H., Sun, W. Effects of hydrostatic pressure on microtubule organization and cell cycle in gynogenetically activated eggs of olive flounder (Paralichthys olivaceus). Theriogenology. 68, 873-881 (2007).
- Vertii, A., Zimmerman, W., Ivshina, M., Doxsey, S. Centrosome-intrinsic mechanisms modulate centrosome integrity during fever. Mol. Biol. Cell. 26, 3451-3463 (2015).
- Walker, C. The zebrafish: Genetics and genomics. Vol. 60 Methods in Cell Biology. Detrich, W. H., Westerfield, M., Zon, L. I. , Academic Press. 43-70 (1999).
- Blanco-Vives, B., Sánchez-Vázquez, F. J. Synchronisation to light and feeding time of circadian rhythms of spawning and locomotor activity in zebrafish. Physiol. Behav. 98, 268-275 (2009).
- Dekens, M. P. S., et al. Light regulates the cell cycle in zebrafish. Curr. Biol. 13, 2051-2057 (2003).
- Pelegri, F., Schulte-Merker, S. The Zebrafish: Genetics and Genomics Vol. 60 Methods in Cell Biology. Detrich, W., Zon, L. I., Westerfield, M. , Academic Press. 1-20 (1999).
- Hart, N. H., Becker, K. A., Wolenski, J. S. The sperm entry site during fertilization of the zebrafish egg: localization of actin. Mol. Reprod. Dev. 32, 217-228 (1992).
- Tsaadon, A., Eliyahu, E., Shtraizent, N., Shalgi, R. When a sperm meets an egg: block to polyspermy. Mol. Cell. Endocrinol. 252, 107-114 (2006).
- Wong, J. L., Wessel, G. M. Defending the zygote: search for the ancestral animal block to polyspermy. Curr. Top. Dev. Biol. 72, 1-151 (2006).
- Rappaport, R., Rappaport, B. N. Establishment of cleavage furrows by the mitotic spindle. J. Exp. Zool. 189, 189-196 (1974).
- Wühr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W. I., Mitchinson, T. J. A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos. Curr. Biol. 20, 2040-2045 (2010).
- Yabe, T., Ge, X., Pelegri, F. The zebrafish maternal-effect gene cellular atoll encodes the centriolar component Sas-6 and defects in its paternal function promote whole genome duplication. Dev. Biol. 312, 44-60 (2007).
- Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes Dev. 18, 1527-1532 (2004).
- Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank's saline containing bovine serum albumin. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 6, 84-87 (1997).
- Roco, A. S., Olmstead, A. W., Degitz, S. J., Amano, T., Zimmerman, L. B., Bullejos, M. Coexistence of Y, W, and Z sex chromosomes in Xenopus tropicalis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, 4752-4761 (2015).
- Streisinger, G., Singer, F., Walker, C., Knauber, D., Dower, N. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112, 311-319 (1986).
- Dekens, M. P. S., Pelegri, F. J., Maischein, H. -M., Nüsslein-Volhard, C. The maternal-effect gene futile cycle.is essential for pronuclear congression and mitotic spindle assembly in the zebrafish zygote. Development. 130, 3907-3916 (2003).
- Pelegri, F., Mullins, M. Met. Cell Biol. Vol. 104. Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. , 83-120 (2011).
