Summary
Een gewijzigde protocol voor ploïdie manipulatie maakt gebruik van een heat shock naar een één-cyclus kraam in cytokinese induceren in de vroege embryo. Dit protocol wordt gedemonstreerd in de zebravis, maar kan voor andere soorten.
Abstract
Manipulatie van ploïdie zorgt voor nuttige transformaties, zoals diploïde te tetraploïden of haploïden te diploïde. In de zebravis Danio rerio bijzonder de productie van homozygote gynogenetic diploïde nuttig in genetische analyse omdat het de directe productie van homozygoten van een heterozygote moeder. Dit artikel beschrijft een gemodificeerd protocol voor ploïdie duplicatie op basis van warmte puls tijdens de eerste celcyclus, Heat Shock 2 (HS2). Door remming van centriole duplicatie deze werkwijze resulteert in een precieze celdeling stall tijdens de tweede celcyclus. De precieze één cyclus divisie stal, gekoppeld aan onaangetast DNA duplicatie, resulteert in een hele genoom duplicatie. Protocollen in verband met deze methode zijn ei en sperma inzameling, UV-behandeling van sperma, in vitro fertilisatie en warmte puls naar een one-celcyclus divisie vertraging en ploïdie duplicatie veroorzaken. Een aangepaste versie van dit protocol kunnen worden toegepastom ploïdie veranderingen in andere diersoorten induceren.
Introduction
Dit protocol maakt de manipulatie van ploïdie in zebravisembryo's, bijvoorbeeld bij het genereren van homozygote diploïde gynogenetic van gynogenetic haploïden (figuur 1) of de productie van tetraploïden. Dit wordt bereikt door het induceren van een vertraging in cytokinese overeenkomt met precies een celcyclus (Figuur 2A, 2B). De sleutel van één cyclus vertraging cytokinese wordt bereikt door behandeling met hitteschok. Het standaardprotocol van hitteschok (HS) zoals oorspronkelijk beschreven door Streisinger en collega betrokken temperatuur puls gedurende de periode 13-15 MPF, resulterend in één cyclus celdeling stall tijdens de eerste celcyclus 1. De efficiëntie van dit protocol is onlangs verbeterd door het scannen van de eerste celdelingen met een glijdende vensterfuncties van hitteshockbehandeling. Deze scan identificeerde een later tijdstip voor een warmteschok, nog binnen de eerste celcyclus (22-24 MPF), wat resulteert in een hoger embryos met één cyclus celdeling box, die in dit geval beïnvloedt de tweede celcyclus 2. De waarneming dat experimentele manipulaties in de eerste celcyclus verstoren celdeling tijdens de tweede celcyclus en leiden tot DNA-inhoud duplicatie is eveneens beschreven in andere vissoorten 3,4. We noemen dit gemodificeerde protocol Heat Shock 2 (HS2 - de term "2" geeft de warmte puls plaats op een later tijdstip dan de standaard HS methode, en dat de celcyclus vertraging veroorzaakt door HS2 optreedt in de tweede celcyclus ). Deze studies toonden aan dat de basis voor cytokinese arrestatie na hitteschok de remming van centriole overlapping tijdens de hitte puls, welke spil vorming en groef inductie in de volgende celcyclus beïnvloedt. HS2 resultaten in opbrengsten van de celcyclus bijna 100%, en de tarieven van ploïdie duplicatie tot 4 keer hoger dan standaard HS 2.
Embryo's behandeld witha heat shock tijdens blastomere celdeling vertonen veel schadelijke effecten, wat erop wijst dat heat shock invloed op meerdere processen die nodig zijn voor de celdeling 2. Anderzijds, indien de heat shock voorafgaand aan de initiatie van celdeling (tijdsperiode 0-30 MPF) wordt toegepast, blijkt het effect consistent met specifieke interferentie met centriole overlapping hebben en lijkt geen andere essentiële cellulaire processen beïnvloeden 2 . Deze studies toonden aan dat de tijd voorafgaand aan de inleiding van blastomere divisie lijkt een ontwikkelingsperiode vatbaar is voor het gebruik van Heat Shock als een instrument om specifiek te manipuleren door middel van ploïdie centriole remming zijn. De onderliggende oorzaak van de schijnbare selectiviteit voor warmteschok op centriole duplicatie is niet bekend, maar kan verband houden met een selectieve afbraak van centrosoom substructuren waargenomen onder hittestress in bepaalde celtypen, zoals leukocyten 5.
Tijdelijke synchronisatie van de embryonalekeling wordt bereikt door in vitro fertilisatie (IVF). Het gebruik van onbehandelde sperma tijdens de bevruchting resulteert in diploïde embryo's dat bij HS2-geïnduceerde één cyclus cytokinese kraam tetraploïde geworden. Het gebruik van UV-behandelde sperma, die verknopingen dat zijn DNA inactiveren, leidt gynogenetic haploïde embryo 6, dat bij HSII geïnduceerde één cyclus cytokinese stall worden gynogenetic diploïde 2 draagt. Door het resulterende gehele genoom duplicatie deze gynogenetic diploïden homozygoot bij elke locus in het genoom. Beknoptheid wordt verwezen naar haploïde embryo gynogenetic als "haploïden" en homozygote gynogenetic diploïde embryo's "homozygote diploïde". Als levensvatbaar en vruchtbaar, kunnen homozygote diploïde worden gebruikt om steriele en dodelijke-vrije lijnen te starten. Direct homozygosity geïnduceerd door HS2 moet ook gemakkelijk worden opgenomen in genetische analyse of genetische screens, omdat homozygote diploïde zijn van koeien die heterozygote dragers van mut zijnaties vertonen tarieven van homozygotie bij hoge en vaste (50%) verhoudingen 2.
Het volgende protocol beschrijft de stappen om HS2 presteren en induceren ploïdie overlapping met de volledige homozygosity. Voor tetraploïde productie moet sperma oplossing onbehandeld zijn. Voor homozygote diploïde productie moet sperma worden geïnactiveerd door UV-behandeling. Bovendien, zoals beschreven in de discussie, zichtbaar pigment markers kunnen ook worden gebruikt om identificatie van homozygote diploïde vergemakkelijken. Zebravis mate in de eerste plaats tijdens de eerste 3 uur na de opening van hun licht cyclus 7, en zowel volwassenen en eieren zijn gevoelig voor circadiaanse ritmes 8, dus voor het beste resultaat van de IVF-procedure moet plaatsvinden binnen deze periode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke experimenten werden uitgevoerd volgens de Universiteit van Wisconsin - Madison en Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) richtlijnen (University of Wisconsin - Madison Assurance nummer A3368-01).
1. Keuze Vrouwtjes Egg Collection via Onderbroken Mating
LET OP:-IVF gebaseerde protocollen rekenen op de extrusie van rijpe eicellen van koeien door middel van handmatige druk 9. Eerdere protocollen vrouwtjes rechtstreeks gebruik van tanks of in combinatie paringen zonder vrouwtjes ondergaan ei afgiftegedrag, maar slechts een klein deel van deze vrouwen (ongeveer 20% of minder, afhankelijk van de zebravis lijn) werd verkregen geëxtrudeerde en competente eieren op manuele druk. In een verbeterde procedure, vrouwtjes zijn pre-gesorteerd voor het leggen van eieren door directe visuele waarneming, gevolgd door onmiddellijke onderbreking van de paring. Deze procedure is zeer effectief, aangezien bijna alle vrouwelijke voorgeselecteerd door deze onderbroken paring stap opbrengst geëxtrudeerd en competente eierenop manuele druk.
- De middag voor het experiment, het opzetten van paren paren van de gewenste zebravis stam in standaard zebravis paring dozen. Houd mannen in dezelfde kamer als vrouwtjes nog fysiek gescheiden van hen, hetzij door middel van een paring doos afdeling of door het plaatsen van de man onder een eierleggende insert en het vrouwtje in de insert.
- De ochtend van het experiment, verwijder de fysieke partitie, het plaatsen van zowel de mannelijke en vrouwelijke binnen dezelfde eierleggende insert, zodat paring begint.
- Inspecteer visueel tanks met paring paren aan de extrusie van de eieren op te sporen tijdens de natuurlijke dekking. Bij de eerste tekenen van ei profielen, gescheiden mannen en vrouwen om de fokkerij te onderbreken. Na de scheiding van mannen, houdt de vooraf geselecteerde vrouwen afzonderlijk of samengevoegd in dezelfde tank. Met meerdere vrouwen afhankelijk van het gewenste aantal (typisch 50-150 eieren / vrouw) embryo.
2. Het voorbereiden van een Sperm Solution
LET OP: IVF relies over de blootstelling van rijpe eicellen van een sperma-oplossing. Deze oplossing kan onbehandeld zijn, diploïde zygoten genereren (dat bij HS2 behandeling worden tetraploïde embryo) of UV-behandelde, op haploïde zygoten (HS2 die na behandeling worden homozygote diploïde embryo's) te genereren. Previous sperma preparaat protocollen suggestie voor het gebruik van capillaire buizen milt verzamelen van de anale regio levende mannetjes, maar dit was niet effectief Werkwijze slechts een klein deel van de mannen gaf hom 9. Het protocol hieronder vertrouwt in plaats daarvan op het sperma voorbereiding van geschoren ontleed testes, die meer betrouwbare resultaten oplevert.
- Bereid Hank's oplossing vroegtijdig als premix Hank's oplossing, omvattende alle componenten (oplossingen 1, 2, 4 en 5), behalve de natriumbicarbonaatoplossing (Oplossing 6). Bereid Oplossing 6 vers en toevoegen voormengsel de ochtend van het experiment (tabel 1). Om Hanks 'oplossing (uiteindelijke oplossing te maken, de voorbereiding van de ochtend van deIVF-procedure), combineer 990 ul van Hank's Premix en 10 ul van de vers bereide Oplossing 6.
- Euthanaseren mannetjes door overmatige blootstelling aan tricaïne als een 0,016% oplossing in geconditioneerd water.
- Bereid tricaïne als 0,2% voorraadoplossing in water (bufferen tot pH 7,0 met 1 M Tris pH 9,0) en bewaar bij 4 ° C. Voeg 8 ml tricaïne voorraad oplossing per 100 ml water in een beker, en gebruik een net om de mannetjes te dragen aan de tricaïne oplossing.
- Gebruik het equivalent van testes één mannelijke per koppeling moest worden bevrucht in een volume van Hank's oplossing overeenkomend met 100 gl per mannelijke (bijv testes van 10 mannen verzameld in 1 ml Hank's oplossing, 10 koppelingen bemesten met 100 gl / koppeling).
- Bevestig euthanasie door het stilleggen van de kieuw bewegingen gedurende 15 minuten. Na euthanasie, verwijder de mannetjes uit de beker met een lepel. Spoel de mannetjes kort met geconditioneerde water en droog ze lichtjes door ze kort op diverse locaties van eenkeukenpapier.
- Om de testikels, eerste Onthoofd gedood mannetjes met behulp van het ontleden van een schaar of een scheermesje te verwijderen, en maak een longitudinale snede langs de buik met het ontleden scissors.Under een dissectie microscoop met een gereflecteerd licht bron, verwijder de inwendige organen met ontleden tang. Trek elk van de testes massa's met een tang en plaats ze in de microcentrifugebuis met Hank's oplossing.
OPMERKING: Testes kan worden geïdentificeerd als elk van twee langwerpige structuren doorschijnende uiterlijk vinden naast het lichaam wanden die convergeren en nabij de cloaca. Testes kan blijven 2-3 min op een petri plaat oppervlak na dissectie en voordat u ze in de oplossing van de Hank's. - Laat de sperma in de oplossing door knippen de testes met een smalle spatel en / of voorzichtig en neer te pipetteren 5-6 keer de testes in oplossing met 1000 ul-tip micropipet, met vermijding luchtbelvorming. Laat de testes puin af te wikkelen.
- Bewaar de oplossing in ijs sperma, waar het zijn vermogen tot 2-3 uur kunnen houden. Als wordt overgegaan tot UV-behandeling van sperma oplossing en spoel de inhoud in een schone microcentrifugebuis waardoor de stukken testes achteren.
3. UV-behandeling
OPMERKING: UV behandeling wordt gebruikt om sperma DNA verknopen om het inactief in het embryo maken. Deze stap wordt alleen gebruikt bij de productie van gynogenetic haploïde of homozygote diploïde gynogenetic embryo's. Sperma oplossing UV behandeling moet worden gescheiden van stukjes testes (stap 2,4), als grote stukken kunnen zaadcellen te beschermen tegen de UV-behandeling.
- Breng de sperma oplossing voor een schone, droge put van een depressie glazen plaat zittend op een ijs bed (bijvoorbeeld ijs in een petrischaal). Gebruik maximaal 1 ml van het sperma oplossing per glasplaat goed.
- Expose het sperma oplossing voor UV door het plaatsen van de depressie glazen plaat op het ijs bed onder een UV-lamp. Behandel het sperma oplossing voor 90 sec met een 115 V (60 Hz, 0.68A) UV-lamp op een 19 cm (7,5 inch) afstand. Met het einde van een pipet tip voorzichtig de oplossing elke 30 seconden gedurende UV-behandeling (een schone pipetpunt elke 30 sec) mix.
- Met behulp van een schone pipet tip en micropipet, de overdracht van de behandelde sperma oplossing voor een nieuwe microcentrifugebuis. Bewaar op ijs totdat het nodig is voor IVF (niet langer dan 2-3 uur van extractie).
4. Manual Extrusie van rijpe eicellen
LET OP: De wijfjes verkregen door onderbreking van de natuurlijke paringen zal gemakkelijk eieren opleveren onder verdoving en manuele druk. Tijdens deze procedure moet tricaïne behandeling zorgvuldig gecontroleerd worden om overbelichting dat het herstel van de vrouwtjes kunnen voorkomen dat te voorkomen.
- Verdoven vrouwtjes door blootstelling aan licht te tricaïne oplossing: overdracht vrouwen met een net om de oplossing in geconditioneerd water tricaïne (gemaakt door het toevoegen van 8 ml tricaïne 0,2% stamoplossing tot 100 ml van geconditioneerd vis water) voor ongeveer 2-5 minuten, tot de vis stop kieuw beweging. <li> Zodra een vrouw stopt kieuw beweging, gebruik een lepel om het op te halen en even uitspoelen in geconditioneerd water. Met hetzelfde lepel om de vis te bewegen, droog het licht door deze herhaaldelijk kort op verschillende locaties van een papieren handdoek en breng deze over naar een schone, droge 10 cm diameter petrischaal. Benader de vis met de lepel in de voorste naar achterste richting, om te voorkomen dat potentieel schadelijke de kieuw operculum.
- Gebruik lab doekjes of zacht weefsel om de anale vin gebied voorzichtig verder te drogen, om eventuele vrijgelaten eieren voorkomen voortijdig wordt geactiveerd door water. Demping van de vingers lichtjes met water (om te voorkomen dat ze vasthouden aan vis schubben), plaatst u een vinger van één hand op de rug van het vrouwtje als ondersteuning, en met een vinger van de andere kant van toepassing lichte druk langs de buik van het vrouwtje tot de eieren geëxtrudeerd worden.
- Gebruik een smalle spatel om de eieren af te stappen van het lichaam van het vrouwtje. Plaats de vrouwelijke terug in een tank met geconditioneerde water voor herstel.
- Activeren (met blootstelling aan water) en bemesten (met sperma oplossing toevoeging) eieren gelijktijdig en binnen 90 seconden na de extrusie (zie paragraaf 5).
5. In Vitro Fertilisatie
LET OP: zebravis bemesting in natuurlijke kruisingen extern is, afhankelijk van de gelijktijdige release en activering door water van de eieren en sperma tijdens het paren. In vitro fertilisatie bootst dit proces de eieren bloot te stellen aan sperma oplossing in de aanwezigheid van water. waterdruk oorspronkelijk klein (1 ml) om de effectieve spermaconcentratie verhogen. Binding door sperma plaatsvindt binnen 15-20 sec 10 </ Sup> en watervolume kan dan worden verhoogd. Chorion het opheffen verder bij aan de nauwe synchronisatie van de koppeling bij het raam te beperken voor de bevoegdheid voor het sperma binden 11,12. De resulterende embryo's vertonen derhalve grotendeels gelijktijdige celdeelcycli tijdens de vroege stadia splitsing.
- Voeg 100 ul sperma oplossing (equivalents van testes van de ene male - zie deel 2) de koppeling van geëxtrudeerd eieren op een petrischaal. Zwenk de pipetpunt gebruikt om het sperma oplossing van de eieren toevoegen sperma en eieren door elkaar, waarbij u de tip niet opheffen van het oppervlak van de petrischaal van eieren te voorkomen.
- Activeer onmiddellijk de eieren door toevoeging van 1 ml embryonale medium (E3) -oplossing (geconditioneerd water is ook aanvaardbaar als een substituut voor E3 in deel 5 tot 7) en opnieuw zachtjes mengen eieren en sperma door voorzichtig schudden met de pipetpunt. Start een timer om timing ten opzichte van de bevruchting te starten. Op 1 MPF in het volume 1 ml, overspoelen de plaat met E3. Alvorens verder te gaan, laat staan totdat 10-12 mpf ei activering, met inbegrip van volledige chorion expansie mogelijk te maken.
6. Heat Shock Treatment
OPMERKING: Een heat shock toegepast in het vroege embryo remt centriole overlapping resulteert in een incomplete complement van centrioles spindel formatie rijden tijdens de daaropvolgende celcyclus 2. Aangezien spil op zijn beurt resulteert in het ontbreken van groef 13 vormen.
- Na de uitbreiding van het chorions (10-12 MPF), giet de embryo's uit de petrischaal in een theezeefje. Spoel de petrischaal met een wasfles met E3 om resterende embryo's in de theezeef verzamelen.
- Plaats de theezeef het embryo in een bekerglas in een voorverwarmd bad met E3 bij 28,5 ° C. Pre-evenwicht van de beker en de E3 om het waterbad temperatuur, en zorg ervoor dat er genoeg E3 zodat alle embryo's in de theezeef wordt blootgesteld aan het medium.
- Op 22 mpf, verwijder de theezeefje uit de 28,5 ° C waterbad, kort dep het op een papieren handdoek om overtollig vocht te verwijderen, en plaats deze in een vergelijkbaar voorverwarmd E3 beker in een warmte-bad bij 41,4 ° C.
- Op 24 mpf, de overdracht van de theezeefje terug naar de E3 in het waterbad bij 28,5 ° C na een korte blotting. Op 29 mpf, gebruik dan een spuitfles met E3 om de embryo's te dragen van de theezeefje een 10 cm Petri plaat.
7. Selectie voor embryo's met een One-cyclus Cytokinese Stall
- Gedurende de periode 35-45 mpf, onder een dissectie microscoop met een verzonden lichtbron, selecteert u die embryo's die symmetrisch splitsing ondergaan in de 2-cel stadium, en die worden dan ook bevrucht. Verwijder embryo's die niet cel splitsing ondergaan.
- Verder observeren van de bevruchte embryo's geselecteerd voor normale celdeling tijdens de eerste celcyclus en in de second celcyclus (50-65 MPF).
- Sorteer embryo volgens de volgende categorieën (Figuur 2C): 4 cellen ( "geen stall", in het 2: 2 arrangement standaard voor een 4-cel embryo); 3 cellen ( "gedeeltelijke stal", in een afwijkende 2 kleinere cellen: 1 grote cel arrangement); en 2 cellen ( "geblokkeerd", embryo's vertonen in één celcyclus vertraging in een 1: 1 arrangement identiek aan die van een 2-cel embryo). Sorteer de vastgelopen embryo's in een frisse petrischaal.
Opmerking: In deze fase, embryo's in de 2: 2 opstelling overeen met die waarbij tijdens de tweede celcyclus noch blastomere onderging een celdeling meststal embryo in een afwijkende 2 kleinere cellen: 1 grootcellig arrangement overeen met die waarbij hitteschok veroorzaakt een celcyclus stall tijdens de tweede celcyclus in een blastomeer maar niet de andere; en embryo "vastgelopen" in een 1: 1 arrangement overeenkomen met die waar in de tweede celcyclus zowel blastomeren onderging de gewenste celdelingkraam. Vastgelopen embryo's moet cel splitsing te hervatten tijdens de volgende celcyclus periode (65-80 MPF). De opstelling van blastomeren kan variabel zijn, vanwege de onvolledige wachten van de vorige celcyclus de spindel 2,14 te stabiliseren, maar de meeste embryo's een relatief normaal blastula die normale ontwikkeling kunnen ondergaan vormen. - Laat embryo's te ontwikkelen in de Petri plaat, met een limiet van 80 embryo's per 10 cm plaat. Bij 24 HPF, acht de embryo's te bepalen of zij een normale morfologie kenmerk van diploïde of homozygote diploïde embryo 6 (normale omvang van as verlenging (Figuur 3A, 3C)), in tegenstelling tot minder as uitbreiding en verhoogde lichaamstemperatuur dikte kenmerkend haploïden (Figuur 3B)), en / of diploidization bepalen met behulp van genetische merkers pigment bij 36 MPF, zoals goud of albino en andere dergelijke tests (figuur 3 en zie hierna) 2,6,9. Verwijder alle embryo's die verschijnen om een haploïde morfologie hebben, of die zijn gelyseerd of vertonen andere grove abnormale afwijkingen.
OPMERKING: Indien gewenst laat embryo ontwikkeling tot 5 dagen na de bevruchting, terwijl zij gelyseerd of verregaand abnormale embryo's dagelijks te verwijderen en het toevoegen van verse E3 aan het medium vernieuwen. LET OP: Het overleven van embryo's kunnen ook worden gekweekt na zwemblaas inflatie op dag 5 door de overdracht naar een broederij systeem en voederen onder normale omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ondanks de één celcyclus cytokinese stal, DNA replicatie plaatsvindt normaliter in dergelijke embryo, wat resulteert in de verdubbeling van de DNA inhoud van de embryo (figuur 1). De Streisinger Heat Shock-protocol (standaard HS) betreft een warmte puls in de periode 13-15 minuten na de bevruchting (MPF) en induceert voornamelijk cytokinese arrestatie tijdens de eerste embryonale celdeling op 35 mpf 1,2, terwijl de afgeleide hier beschreven methode, aangeduid als Heat shock 2 (HS2), maakt gebruik van een heat shock gedurende de periode 22-24 mpf en induceert cytokinese arrestatie tijdens de tweede embryonale celdeling bij 50 mpf (figuur 2; 2,3,4). Bij 24 HPF, observatie van het embryo toe te bepalen of zij een normale morfologie kenmerk van diploïde of homozygote diploïde embryo of de kortere en bredere lichaamsas-morfologie kenmerk van haploïde embryo's (Figuur 3)
Figuur 1: Bemesting types. (A) Natuurlijke paring. Mannelijke en vrouwelijke gameten zijn behandeld, waardoor een natuurlijke diploïde. (B) Het sperma wordt behandeld met UV, wat resulteert in de vernietiging van de vaderlijke DNA en het produceren van haploïde zygoten. Indien onbehandeld, hebben dergelijke haploïden niet overleven afgelopen dag 2-3 van ontwikkeling. (C) Behandeling van haploïde zygoten met Heat Shock 2 (HS2) remt één cyclus van cytokinese van mitose in het vroege embryo. Dit celcyclus kraam, paard om onaangetast DNA-replicatie, genereert homozygote diploïde zaden die levensvatbaar en vruchtbaar volwassenen kunnen worden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: HS2 bevordert de gehele genoom duplicatie door haperende de tweede celcyclus. (A) Cell splitsingspatroon van een onbehandelde embryo gedurende de eerste drie celcyclus, overeenkomend met 2-, 4- en 8-cellige embryo. (B) HS2 behandeling resulteert in een één-cyclus kraam van de celdeling tijdens de tweede celcyclus. Tijdens de stal, lopende DNA-synthese resultaten in embryo's ondergaan diploidization, van beide haploïde tot diploïde (n -> 2n) of diploïde tot tetraploïde (2n -> 4N) (zie tekst). Na deze kraam, het embryo hervat celdeling, met het neWLY verworven ploïdie. (C) HS2-behandelde embryo een grote blastomeer regeling naargelang blastomeren vertonen een celdeling vertraging tijdens de tweede celcyclus vertonen: i) "nee stall": geen blastomere vertoont vertraging, waardoor een 2: 2 arrangement kenmerkend 4-cellig stadium embryo, ii) "gedeeltelijke stall": één of twee blastomeren vertoont vertraging, wat resulteert in een afwijkende 2: 1 arrangement, en iii) "vastgelopen": zowel blastomeren vertonen vertraging, wat resulteert in een 1: 1 arrangement karakteristiek 2-cellig stadium embryo. In (A - C) zijn weergegeven als kernen blauwe cirkels, met het diploidization gebeurtenis weergegeven door een uitbreiding van de kerngrootte. Zie referentie 2 voor een diagram dat centriolar gedrag als de voorgestelde basis voor de celdeling kraam. Klik hier om een grotere versi bekijkenop van dit cijfer.
Figuur 3: morfologie van de natuurlijke diploïde, haploïden en gynogenotes. (A) Normale embryonale morfologie van een diploïde verkregen door middel van natuurlijke kruisingen. (B) haploïde embryo's vertonen een kortere en bredere lichaamsas. (C) homozygote diploïde een normale lichaam morfologie. Embryo's bovendien dragen een recessieve mutatie in het gen pigmentatie gouden vergemakkelijken het bijhouden van de ouderlijke DNA erfenis: moeders zijn homozygote dragers voor een mutatie in gouden en vaders wild-type voor dit gen. Zo, natuurlijk diploïde, heterozygoot voor gouden, vertonen wild-type pigmentatie, terwijl beide haploïden (hemizygoot voor golden) en homozygote diploïde (homozygoot voor golden) vertonen mutant pigmentatie. Schaal bar = 0,5 mm. Panels gewijzigd ten opzichte van reconferentie 2, met toestemming overgenomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Oplossing | Components | Opslag condities |
| Hanks 'oplossing 1 | 8,0 g NaCl, en 0,4 g KCl in 100 ml DDH 2 O | Bewaren bij 4 ° C |
| Hanks 'oplossing 2 | 0,358 g watervrij Na 2 HPO 4, en 0,6 g KH 2 PO 4 in 100 ml DDH 2 O | Bewaren bij 4 ° C |
| Hanks 'oplossing 4 | 0,72 g CaCl2 in 50 ml DDH 2 O | Bewaren bij 4 ° C |
| Hanks 'oplossing 5 | 1,23 g MgSO4 ∙ 7H 2 O in 50 ml DDH 2 O | Bewaren bij 4 ° C |
| Hank's Premix | Toe te voegen, in de volgende volgorde: 10,0 ml oplossing 1, 1,0 ml Oplossing 2, 1,0 ml oplossing 4, 86,0 ml ddH2O en 1,0 ml Oplossing 5 | Bewaren bij 4 ° C |
| Hanks 'oplossing 6 | 0,33 g NaHCO3 in 10 ml DDH 2 O | Vers bereid de ochtend van de IVF-procedure |
Tabel 1. Bereiding van oplossingen Hank's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
kritische stappen
Het is essentieel om te werken voor daadwerkelijke in vitro fertilisatie. Om een goed aanbod van rijpe eicellen (stap 1) te verzekeren, het opzetten van de vrouwtjes te paren mag niet zijn opgezet in paring kruizen gedurende minstens 5 dagen en moeten zwangere verschijnen. Tijdens de onderbreking van de fokkerij, kan een waarnemer adequaat toezicht 15-30 tanks voor de eerste verschijning van de natuurlijke ei extrusie. Onderbreking van de paring moet zo snel optreden mogelijk wanneer de eerste eitjes worden vrijgegeven door natuurlijke paringen, zodat de meeste eieren binnen de vrouwtjes voor IVF blijven. Deze vrouwen, die nu klaar zijn voor manuele extrusie van rijpe eicellen kunnen worden gescheiden gehouden tot 2 uur zonder een duidelijk effect op de latere eiversie. Een effectieve sperma oplossing (stap 2) te bereiden, dient mannelijk onder robuust en idealiter met een roodachtige tint, die kenmerkend zebravis mannetjes fokken. Een schone dissectie meestal gaat remoVing de intestinale spoor door het naar de achterkant van het lichaam, en de zwemblaas door hem naar voren te trekken trekken. Na verwijdering van centrale organen, de testes blijven zoals doorschijnende langwerpige massa langs elke zijde van de interne lichaamswand. Vermijd waaronder ongewenste organen (bijv ingewanden) in het sperma oplossing; indien nodig scheiden deze uit testes door te werken aan een droge petrischaal oppervlak voordat het in de oplossing van de Hank's wordt geplaatst. Om hoge bemestingsdoseringen bereiken tijdens IVF (stap 4), is het essentieel dat geëxtrudeerd eieren bevoegde totdat zaadcellen toevoeging gehandhaafd. Eieren die bevoegd is voor de bevruchting vertonen een enigszins gele toon en zijn doorschijnend. Vermijd eieren die elk contact met water voorafgaand aan sperma Bovendien, omdat water ei activering en voortijdige activering zal leiden zal de bevruchting in de weg. Water activering en bemesting moet gebeuren binnen 90 seconden van de extrusie van de vrouwelijke om uitdroging van de eieren te voorkomen, die zalleiden tot hun degradatie. Indien nodig, kan geëxtrudeerd eieren langer (tot 1,5 uur of meer) worden gehouden 100-200 pl Hank's oplossing aangevuld met 0,5% runderserumalbumine (BSA) 17 (bij de opstelling van Hank's oplossing voor dit doel, bereid de premix te corrigeren voor het watergehalte toegevoegd tijdens BSA suppletie). Als eieren bevoegde met de hulp van Hank's BSA-oplossing zijn gehouden, verwijderen overtollige Hank's BSA uit de eieren met behulp van een micropipet en bemesten binnen 1 min.
Een kritische stap voor het welslagen van diploidization gebruik HS2 is het sorteren van vastgelopen embryo (stap 7). Initial sortering van symmetrisch splitsen van 2-cellige embryo's kiest voor embryo's die bevrucht worden en beginnen celdeling (occasionele dispermy tijdens IVF resultaten in embryo's die de overgang rechtstreeks van 1- tot 4-cellen bij 35-50 mpf - die embryo's moet worden weggegooid). Cell fietsen gebeurt elke 15 minuten tijdens deze vroege embryonale stleeftijden (35-50 MPF voor de eerste celcyclus, 50-65 MPF voor de tweede celcyclus, enzovoort), zodat sortering splitsen embryo gedurende de eerste 10 minuten van elke celcyclus verzekert een afwezigheid van overlap tussen de cycli en accurate identificatie van een celdeling stal.
Wijzigingen en het oplossen van problemen
De sterkte van de UV-behandeling in stap 3 (bijv belichtingstijd, lampvermogen, afstand tot lamp) kan indien gewenst worden aangepast door het testen oorspronkelijke bemestingsdoseringen en de frequentie van haploiden bij afwezigheid van verdere behandeling HSII: de juiste hoeveelheid UV-blootstelling geen merkbaar effect op bemestingsdoseringen terwijl resulteert in 100% van haploïde embryo's (zie Representatieve resultaten aan van haploïde diploïde embryo onderscheiden). Teveel UV blootstelling veroorzaakt verminderde bemesting tarieven vermoedelijk als gevolg van schadelijke effecten op het sperma functie, terwijl onvoldoende UV-straling produceert diploïde embryo's als gevolg van to incomplete inactivatie van sperma DNA.
Als embryo ontwikkelingsstoornissen of letaliteit vertonen na hervatting van celbreking (stap 7), kan de hitteschok temperatuur van stap 6 enigszins kleiner (bijv 41,0 ° C) tot embryo overleving te verhogen; condities die resulteren in ongeveer gelijke fracties van afwijkende 3-cel en vastgelopen 2-cellige embryo's tijdens de tweede celcyclus (en zijn daarom in de buurt drempel voor een effect op centriolar duplicatie) resulteren in een minimale latere ontwikkelingsstoornissen gebreken en verhoogde overleving na de hervatting van de cel fietsen .
De HS2 methode is uitgerust met een handige en intrinsieke mechanisme voor celdeling kraam (en dus gehele genoom duplicatie) beoordelen, omdat directe observatie van embryo's als ze zich ontwikkelen maakt het bijhouden van de verschillende cel cycli. Handmatige selectie van embryo's die een one-celcyclus divisie kraam hebben ondergaan, maakt het genereren van een uniforme populatie van diploidized embryos. HS2 kan op elke zebravis genetische stam (bv AB, Tübingen, WIK) worden uitgevoerd, als de een-celdeling stal fungeert als een intrinsiek mechanisme voor DNA-duplicatie te bevestigen. Bovendien kan toegankelijk genetische merkers ingebracht in de stam worden gebruikt voor de identificatie van diploidized embryo (figuur 3) te vergemakkelijken. Bijvoorbeeld, het gebruik van eieren van koeien die homozygoot recessieve mutaties in genen pigmentatie, zoals goud of albino zijn, kunnen worden gecombineerd met sperma verkregen uit wildtype stammen die normale allelen van hetzelfde gen pigmentatie. In deze situatie, omdat UV behandeld sperma geen wild-type pigment allelen kan bijdragen haploïde en diploïde embryo homozygote vertonen recessieve mutatie pigment. Bovendien vertonen homozygote diploïde wildtype morfologie bij 24 HPF, in schril contrast met de minder uitgebreide haploïde morfologie. De combinatie van het uiterlijk van de maternale recessieve eigenschap en algemene embryo morfologie bevestigt succesvolle ploïdie duplicatie. Verdere bevestiging kan worden verkregen door middel van chromosoom tellingen van behandelde en onbehandelde embryo's.
De hierboven beschreven genetische markering, gebaseerd op recessieve zichtbare genetische merkers, maakt het ook de bevestiging van de afwezigheid van sperma derived DNA in het nageslacht, omdat de resulterende embryo's vertonen wild-soort pigmentatie indien sperma niet volledig geïnactiveerd door de UV-behandeling . Aangezien een genetisch markeersysteem, kan een monster van embryo's kunnen ontwikkelen in afwezigheid van hitteschok te bevestigen dat alle embryo's vertonen haploïde morfologie bij 24 HPF, en dus dat sperma DNA inactivering voltooid was. In combinatie met volledig geïnactiveerd sperma, hetzelfde genetische markering ook in het achterhalen potentiële spontane poollichaampje falen. Zo'n gebeurtenis zou resulteren in het verschijnen van recessieve gemarkeerd met diploïde embryo morfologie zonder diploidization behandeling. Spontane polar body falen is niet waargenomen in de zebravis, maar wordt gerapporteerd in Xenopus tropicalis 18. Indien aanwezig in een bepaald systeem, zou dit spontane evenement moeten worden verminderd of gecontroleerd voor om optimaal te kunnen implementeren ploïdie manipulatie.
Beperkingen van de techniek
Het vermogen om levensvatbare gynogenotes produceren gebaseerd op de afwezigheid van achtergrond genvarianten die, wanneer homozygoot zijn schadelijk. Aldus zal het succes van de procedure afhankelijk van de genetische stam gebruikt. Selectie van genetische stammen door meerdere generaties gynogenese is aangetoond dat de levensvatbaarheid 1 verbeteren.
HS2 de werkwijze bij gebruik in combinatie met onbehandelde zaadcellen diploïde embryo's, maakt ook de productie van tetraploïde embryo's met een hoge frequentie. In dit geval, als gevolg van de diploïde tetraploide transformatie, genetische merkers niet gemakkelijk zorgen voor de bevestiging van hele genomduplicatie. In dit geval moet onder meer het ene celcyclus stal in gesynchroniseerd embryo's en selectie van vastgelopen embryo tetraploïde selectie verzekeren en chromosoom tellingen kan worden gebruikt om ploïdie verder te bevestigen.
Belang met betrekking tot de bestaande / alternatieve methoden
Hoewel beschreven door Streisinger meer dan 40 jaar geleden 1, de standaard GS-methode is nog niet op grote schaal gebruikt vanwege de slechte opbrengst. In plaats daarvan heeft ploïdie manipulatie vrijwel uitsluitend gebaseerd op de alternatieve en relatief efficiëntere methode van vroege druk, wat resulteert in de ploïdie overlapping door de remming van de tweede meiotische deling. Echter, vroeg druk resulteert in wisselende verhoudingen van gen homozygosity 9,19, dat zijn waarde als een genetisch hulpmiddel vermindert. Recente studies tonen aan dat HS2, een modificatie van de standaard GS protocol, namelijk de toepassing van de warmte-impuls op een ander tijdstip tijdens de eerste celcyclus (de 22-24MPF periode HS2, vergeleken met 12-14 MPF in standaard HS) leidt tot 4 maal verhoogd rendement van homozygote diploïde producties.
De werking van de warmte puls kan worden afgeleid optreden vanwege de remming van centriole overlapping in de tijd van hitteschok (22-24 MPF, in de eerste celcyclus) die dientengevolge niet de juiste aanvulling op een spil te genereren en bemiddelen celdeling tijdens de volgende celcyclus (50-65 MPF, overeenkomend met de tweede celcyclus). Centriole duplicatie kan worden hervat in afwezigheid van hitteschok bij latere celcyclus, waardoor ontwikkeling te gaan na een nauwkeurige één-celcyclus stall. Omdat centriole duplicatie en DNA-replicatie cycli zijn onderling afhankelijk 20, DNA-replicatie verloopt normaal, zelfs tijdens de vastgelopen divisie in de tweede celcyclus. Dit resulteert in een nauwkeurige gehele genoom duplicatie en volledige homozygoten.
toekomstige toepassingen
21 zou vereisen vergemakkelijken.
Benaderingen Soortgelijke HS2 kunnen worden toegepast op andere soorten met externe bevruchting, ook als deze niet momenteel gebruikt als genetische systemen. Deze methodein het bijzonder maakt gebruik van een periode vanaf de bevruchting tot de inleiding van blastomeer fietsen, waar een warmte-puls centriole duplicatie van invloed kan zijn en het genereren van een nauwkeurige celdeling kraam en hele genoom duplicatie zonder dat nadelige effecten op de ontwikkeling. Zo kan deze vroege periode worden onderzocht voor heat shock gevoeligheid voor ploïdie-manipulatie op basis van genetische methoden in andere dierlijke systemen te ontwikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S3264 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| MgSO4-7H2O | Sigma | 63138 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Tricaine | Western Chemical | Tricaine-D (MS 222) | FDA approved (ANADA 200-226) |
| Tris base | Sigma | 77-86-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| HCl | Sigma | 920-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| Fish net (fine mesh) (4-5 in) | PennPlax | (ThatFishThatPlace # 212370) | available in ThatFishThatPlace |
| Plastic spoon | available in most standard stores | ||
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissecting forceps | Dumont | SS | available from Fine Science Tools |
| Dissecting stereoscope (with transmitted light source) | Nikon | SMZ645 | or equivalent |
| Reflective light source (LED arms) | Fostec | KL1600 LED | or equivalent |
| Petri plates 10 cm diameter | any maker | ||
| Eppendorf tubes 1.5 ml | any maker | ||
| Ice bucket | any maker | ||
| Pipetteman P-1000 | any maker | ||
| Pipette tips 1,000 µl | any maker | ||
| Narrow spatula | Fisher | 14-374 | |
| Depression glass plate | Corning Inc | 722085 (Fisher cat. No 13-748B) | available from Fisher Scientific |
| UV lamp | UVP | Model XX-15 (cat No. UVP18006201) | available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting) |
| UV glasses | any maker | ||
| Paper towels | any maker | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666-11 | available from Fisher Scientific |
| Timer stop watch | any maker | ||
| Wash bottle | Thermo Scientific | 24020500 | available from Fisher Scientific |
| Tea strainer | available in kitchen stores | ||
| beakers, 250 ml (2) | Corning Inc. | 1000250 | available from Fisher Scientific |
| water bath (2) | any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series) | ||
| Hanks’ Solution 1 | see above | see above | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O. Store at 4°C. |
| Hanks’ Solution 2 | see above | see above | 0.358 g Anhydrous Na2HPO4, 0.6 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O. Store at 4 °C. |
| Hanks’ Solution 4 | see above | see above | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O. Store at 4 °C. |
| Hank's Premix | see above | see above | add, in the following order: 10.0 ml Solution 1; 1.0 ml Solution 2; 1.0 ml Solution 4; 86.0 ml ddH2O; 1.0 ml Solution 5. Store at 4 °C |
| Hanks’ Solution 6 | see above | see above | 0.33 g NaHCO3 in 10 ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure. |
| Hank's Solution (final solution) | see above | see above | Combine 990 μl of Hank’s Premix and 10 μl of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution) |
References
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
- Heier, J., Takle, K., Hasley, A., Pelegri, F. Ploidy manipulation and induction of alternate clevage patterns through inhibition of centrosome duplication in the early zebrafish embryo. Dev. Dyn. 244, 1300-1312 (2015).
- Zhang, X., Onozato, H. Hydrostatic pressure treatment during the first mitosis does not suppress the first cleavage but the second one. Aquaculture. 240, 101-113 (2004).
- Zhu, X. P., You, F., Zhang, P. J., Xu, J. H., Sun, W. Effects of hydrostatic pressure on microtubule organization and cell cycle in gynogenetically activated eggs of olive flounder (Paralichthys olivaceus). Theriogenology. 68, 873-881 (2007).
- Vertii, A., Zimmerman, W., Ivshina, M., Doxsey, S. Centrosome-intrinsic mechanisms modulate centrosome integrity during fever. Mol. Biol. Cell. 26, 3451-3463 (2015).
- Walker, C. The zebrafish: Genetics and genomics. Vol. 60 Methods in Cell Biology. Detrich, W. H., Westerfield, M., Zon, L. I. , Academic Press. 43-70 (1999).
- Blanco-Vives, B., Sánchez-Vázquez, F. J. Synchronisation to light and feeding time of circadian rhythms of spawning and locomotor activity in zebrafish. Physiol. Behav. 98, 268-275 (2009).
- Dekens, M. P. S., et al. Light regulates the cell cycle in zebrafish. Curr. Biol. 13, 2051-2057 (2003).
- Pelegri, F., Schulte-Merker, S. The Zebrafish: Genetics and Genomics Vol. 60 Methods in Cell Biology. Detrich, W., Zon, L. I., Westerfield, M. , Academic Press. 1-20 (1999).
- Hart, N. H., Becker, K. A., Wolenski, J. S. The sperm entry site during fertilization of the zebrafish egg: localization of actin. Mol. Reprod. Dev. 32, 217-228 (1992).
- Tsaadon, A., Eliyahu, E., Shtraizent, N., Shalgi, R. When a sperm meets an egg: block to polyspermy. Mol. Cell. Endocrinol. 252, 107-114 (2006).
- Wong, J. L., Wessel, G. M. Defending the zygote: search for the ancestral animal block to polyspermy. Curr. Top. Dev. Biol. 72, 1-151 (2006).
- Rappaport, R., Rappaport, B. N. Establishment of cleavage furrows by the mitotic spindle. J. Exp. Zool. 189, 189-196 (1974).
- Wühr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W. I., Mitchinson, T. J. A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos. Curr. Biol. 20, 2040-2045 (2010).
- Yabe, T., Ge, X., Pelegri, F. The zebrafish maternal-effect gene cellular atoll encodes the centriolar component Sas-6 and defects in its paternal function promote whole genome duplication. Dev. Biol. 312, 44-60 (2007).
- Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes Dev. 18, 1527-1532 (2004).
- Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank's saline containing bovine serum albumin. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 6, 84-87 (1997).
- Roco, A. S., Olmstead, A. W., Degitz, S. J., Amano, T., Zimmerman, L. B., Bullejos, M. Coexistence of Y, W, and Z sex chromosomes in Xenopus tropicalis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, 4752-4761 (2015).
- Streisinger, G., Singer, F., Walker, C., Knauber, D., Dower, N. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112, 311-319 (1986).
- Dekens, M. P. S., Pelegri, F. J., Maischein, H. -M., Nüsslein-Volhard, C. The maternal-effect gene futile cycle.is essential for pronuclear congression and mitotic spindle assembly in the zebrafish zygote. Development. 130, 3907-3916 (2003).
- Pelegri, F., Mullins, M. Met. Cell Biol. Vol. 104. Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. , 83-120 (2011).
