Manipulation Ploïdie de Zebrafish Embryons avec Heat Shock Treatment 2

Summary

Un protocole modifié pour la manipulation ploïdie utilise un choc thermique pour induire un décrochage d'un cycle cytokinèse dans l'embryon précoce. Ce protocole est mise en évidence chez le poisson zèbre, mais il peut être applicable à d'autres espèces.

Abstract

Manipulation de ploïdie permet de transformations utiles, telles que les diploïdes à tétraploïdes ou haploïdes à diploïdes. Dans le Danio rerio zebrafish, en particulier la génération de diploïdes homozygotes gynogénétiques est utile dans l' analyse génétique , car elle permet la production directe d'homozygotes à partir d' une seule mère hétérozygote. Cet article décrit un protocole modifié pour ploïdie duplication basée sur une impulsion de chaleur au cours du premier cycle cellulaire, Heat Shock 2 (HS2). Grâce à l'inhibition de la duplication centriole, cette méthode se traduit par une division cellulaire précise décrochage au cours du deuxième cycle cellulaire. La précision d'un cycle de division décrochage, couplé à pas affecté duplication d'ADN, se traduit par la duplication du génome entier. Protocoles associés à cette méthode comprennent l' oeuf et la collecte de sperme, traitement UV des spermatozoïdes, la fécondation in vitro et le pouls de la chaleur pour provoquer une division d' une cellule de cycle retard et la duplication ploïdie. Une version modifiée de ce protocole peut être appliquépour induire des changements de ploïdie chez d'autres espèces animales.

Introduction

Ce protocole permet la manipulation des embryons de poisson zèbre dans la ploïdie, tels que la génération de diploïdes gynogénétiques homozygotes à partir haploïdes gynogénétiques (figure 1) ou la production de tétraploïdes. Ceci est réalisé en induisant un retard dans la cytocinèse correspondant exactement à un cycle cellulaire (figure 2A, 2B). Le retard touche un cycle cytokinèse est obtenu par le traitement par choc thermique. Le protocole standard de choc thermique (HS) tel que décrit à l' origine par Streisinger et ses collègues impliqués une impulsion de température au cours de la période mpf 13-15, résultant en une un cycle de la division cellulaire décrochage au cours du premier cycle cellulaire ^1. L'efficacité de ce protocole a été récemment améliorée par balayage des cycles cellulaires début d'une fenêtre temporelle de glissement du traitement par choc thermique. Cette analyse a identifié un point de temps plus tard pour un choc thermique, toujours dans le premier cycle cellulaire (22-24 mpf), qui se traduit par un taux de embr supérieuryos avec un cycle de division cellulaire décrochage, qui dans ce cas affecte le second cycle cellulaire ^2. L'observation selon laquelle des manipulations expérimentales pendant le premier cycle cellulaire interfèrent avec la division cellulaire au cours du deuxième cycle cellulaire et provoquer la duplication de l' ADN contenu a également été rapporté dans d' autres espèces de poisson ^3,4. Nous nous référons à ce protocole modifié comme Heat Shock 2 (HS2 - le terme «2» signifie que l'impulsion de chaleur se produit à un moment ultérieur de la méthode de HS standard, et que le retard du cycle cellulaire causé par HS2 se produit au cours du deuxième cycle cellulaire ). Ces études ont montré que la base de la cytokinèse arrestation après un choc thermique est l'inhibition de la duplication centriole pendant l'impulsion de chaleur, ce qui affecte la formation du fuseau et de l'induction sillon dans le cycle cellulaire suivant. Résultats HS2 des rendements de l' arrêt du cycle cellulaire approchant les 100%, et les taux de ploïdie duplication jusqu'à 4 fois plus élevé que la norme HS ^2.

wit Embryons traitésha choc thermique au cours blastomère cycle cellulaire présentent de nombreux effets délétères, ce qui suggère que le choc thermique affecte plusieurs processus nécessaires à la division cellulaire ^2. D'autre part, si le choc thermique est appliqué avant le début du cycle cellulaire (période de temps 0-30 mpf), il semble avoir des effets cohérents avec l' interférence spécifique avec la duplication centriole et ne semble pas affecter d' autres processus cellulaires essentiels ² . Ces études ont montré que le temps avant le début de la division blastomère semble être une période de développement prête à l'utilisation de choc thermique comme un outil pour manipuler spécifiquement ploïdie par inhibition centriole. La cause sous - jacente de la sélectivité apparente pour le choc thermique sur la duplication centriole est inconnue, mais peut être liée à une dégradation sélective des structures centrosome observées sous contrainte thermique dans certains types de cellules, telles que les leucocytes ^5.

synchronisation temporelle de l'embryon dedéveloppement est réalisé par la fécondation in vitro (FIV). Utilisation du sperme non traité au cours des résultats de fécondation chez les embryons diploïdes que lors de HS2-induits d'un cycle cytokinesis décrochage se tétraploïde. Utilisation des traités-UV sperme, qui porte réticulations qui inactivent son ADN, les résultats dans les embryons haploïdes gynogénétiques ^6, qui , après HSII induite par un cycle cytokinesis décrochage devenir diploïdes gynogénétiques ^2. En raison de la duplication du génome entier résultant, ce dernier diploïdes gynogénétiques sont homozygotes à chaque locus unique à travers le génome. Pour la concision, nous nous référons à gynogénétiques embryons haploïdes comme «haploïdes», et les embryons diploïdes homozygotes gynogénétiques que "diploïdes homozygotes". Si viables et fertiles, les diploïdes homozygotes peuvent être utilisés pour initier des lignes stériles et létaux-libre. homozygotie directe induite par HS2 devrait également être facilement incorporé dans l'analyse génétique ou écrans génétiques, depuis diploïdes homozygotes des femelles qui sont porteurs hétérozygotes de mutations taux d'exposition de homozygotie à (50%) ² ratios élevés et fixes.

Le protocole suivant décrit les étapes à effectuer HS2 et induire la duplication ploïdie en pleine homozygotie. Pour la production tétraploïde, solution de sperme doit être traitée. Pour la production diploïdes homozygotes, le sperme doit être inactivé par traitement UV. En outre, comme il est décrit dans l'analyse, des marqueurs de pigment visible peuvent également être utilisés pour faciliter l'identification des diploïdes homozygotes. Compagnon Zebrafish principalement durant les 3 premières heures de l'ouverture de leur cycle de lumière ^7, et les deux adultes et les œufs sont sensibles aux rythmes circadiens ^8, donc pour obtenir les meilleurs résultats de la procédure de FIV devrait avoir lieu dans cette période de temps.

Protocol

Toutes les expériences animales ont été réalisées selon l'Université du Wisconsin - Madison et institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Commission (IACUC) des lignes directrices (Université du Wisconsin - Madison Numéro d'assurance A3368-01).

1. Sélection de femelles pour la collecte des oeufs via Mating Interrupted

REMARQUE: des protocoles basés sur FIV reposent sur l'extrusion d'oeufs matures à partir des femelles par pression manuelle ^9. protocoles précédents ont utilisé des femelles directement à partir de réservoirs ou conjugaisons paire sans les femelles subissant oeuf libération comportement, mais seulement une petite fraction de ces femmes (environ 20% ou moins, en fonction de la ligne de zebrafish) donnent des œufs extrudés et compétents à la pression manuelle. Dans une procédure améliorée, les femelles sont pré-triés pour la ponte des œufs par observation visuelle directe, suivie d'une interruption immédiate de l'accouplement. Cette procédure est très efficace, car presque toutes les femmes pré-sélectionnés par ce rendement de l'étape d'accouplement interrompue oeufs extrudés et compétentssur une pression manuelle.

1. L'après-midi avant l'expérience, mis en place des paires d'accouplement de la souche zebrafish souhaitée dans des boîtes d'accouplement de poisson zèbre standard. Gardez les hommes dans la même chambre que les femelles encore physiquement séparés d'eux, soit par une division de la boîte d'accouplement ou en plaçant le mâle dans un insert de ponte et la femelle à l'intérieur de l'insert.
2. Le matin de l'expérience, retirez la partition physique, en plaçant à la fois mâle et femelle dans le même insert de ponte, de sorte que l'accouplement commence.
3. Inspecter visuellement les réservoirs contenant des paires d'accouplement pour détecter l'extrusion des œufs lors de l'accouplement naturel. Dès les premiers signes d'extrusions d'œufs, séparés pour les hommes et les femmes d'interrompre la reproduction. Après la séparation des mâles, garder les femelles pré-sélectionnés séparément ou regroupés dans le même réservoir. Utilisez plusieurs femelles en fonction du nombre d'embryons désirés (typiquement 50-150 oeufs / femelle).

2. Préparer une solution de sperme

NOTE: FIV rElies sur l'exposition des oeufs matures à une solution de sperme. Cette solution peut être traitée, pour générer des zygotes diploïdes (qui, par traitement MT2 embryons tétraploïdes deviennent) ou UV-traitée, pour générer des zygotes haploïdes (qui, par traitement MT2 deviennent des embryons diploïdes homozygotes). Précédent protocoles de préparation de sperme ont suggéré l'utilisation de tubes capillaires pour recueillir la laitance de la région anale des hommes vivants, mais cela a été un processus inefficace en tant que seule une petite fraction des hommes a abouti à la laitance ^9. Le protocole présenté ci-dessous repose plutôt sur la préparation des spermatozoïdes des testicules disséqués cisaillées, ce qui donne des résultats plus fiables.

1. Préparer une solution de Hank à l'avance en tant que solution de prémélange de Hank, comprenant tous les composants (solutions 1, 2, 4 et 5) à l'exception de la solution de bicarbonate de sodium (Solution 6). Préparer une solution fraîche 6 et ajoute au prémélange le matin de l'expérience (tableau 1). Pour faire une solution de Hanks (solution finale, préparer le matin duprocédure de fécondation in vitro), mélanger 990 pi de prémélange de Hank et 10 ul de la solution fraîchement préparée 6.
2. Euthanasier mâles par une surexposition au Tricaine comme une solution de 0,016% dans l'eau conditionnée.
   1. Préparer tricaïne comme une solution mère de 0,2% dans l'eau (tampon à pH 7,0 avec 1 M Tris pH 9,0) et conserver à 4 ° C. Ajouter 8 ml de solution tricaïne mère par 100 ml d'eau dans un bécher, et d'utiliser un filet pour transférer les mâles à la solution de tricaïne.
   2. Utiliser l'équivalent des testicules pour un homme par l' embrayage nécessaire pour être fécondé dans un volume de solution de Hank correspond à 100 ul par mâle (par exemple , les testicules de 10 mâles collectés dans 1 ml de solution de Hank, pour fertiliser 10 embrayages avec 100 pl / embrayage).
   3. Confirmer l'euthanasie par la cessation des mouvements maillants pendant 15 minutes. Après l'euthanasie, retirer les hommes du bêcher avec une cuillère. Rincer les mâles brièvement avec de l'eau conditionnée et les sécher légèrement en les plaçant brièvement plusieurs emplacements d'unessuie-tout.
3. Pour enlever les testicules, les premiers Décapitez euthanasiés mâles avec des ciseaux de dissection ou une lame de rasoir, et faire une coupe longitudinale le long de l'abdomen avec dissection scissors.Under un microscope à dissection avec une source de lumière réfléchie, retirer les organes internes avec des pinces à dissection. Tirez sur chacune des testicules masses avec des pinces et les placer à l'intérieur du tube de microcentrifugation contenant la solution de Hank.
   NOTE: Testicules peuvent être identifiés comme chacune des deux structures allongées d'aspect translucide trouvés le long des parois du corps et qui convergent près du cloaque. Testicules peuvent rester 2-3 min sur une surface de la plaque de Pétri après dissection et avant de les placer dans la solution de Hank.
4. Relâchez le sperme dans la solution par cisaillement les testicules avec une spatule étroite et / ou légèrement pipetage de haut en bas 5-6 fois les testicules en solution avec une micropipette 1000 ul-pointe, tout en évitant la formation de bulles d'air. Laisser déposer les testicules des débris.
5. Conserver la solution de sperme dans la glace, où il peut garder sa puissance jusqu'à 2-3 heures. Si procédant aux UV-traitement de la solution de sperme, transférer la solution dans un tube propre en laissant les morceaux de testicules derrière.

3. Traitement UV

REMARQUE: traitement aux UV est utilisé pour réticuler l'ADN des spermatozoïdes afin de le rendre inactif dans l'embryon. Cette étape est uniquement utilisé lors de la production d'embryons diploïdes gynogénétiques haploïdes ou homozygotes gynogénétiques. solution de sperme pour le traitement UV doit être séparé des morceaux de testicules (étape 2.4), comme de gros morceaux peuvent protéger le sperme du traitement UV.

1. Transférer la solution de sperme à un puits sec et propre d'une plaque de verre de dépression assis sur un lit de glace (par exemple glace à l' intérieur d' une boîte de Pétri). Utilisez jusqu'à 1 ml de solution de spermatozoïdes par plaque de verre ainsi.
2. Exposer la solution de sperme aux UV en plaçant la plaque de verre creux sur le lit de glace sous une lampe UV. Traiter la solution de sperme pendant 90 secondes avec un 115 V (60 Hz, 0.68A) lampe UV à un 19 cm (7,5 pouces) distance. Avec la fin d'une pointe de pipette, mélanger délicatement la solution toutes les 30 secondes pendant le traitement UV (utiliser une pointe de pipette propre toutes les 30 secondes).
3. En utilisant une pointe de pipette propre et micropipette, transférer la solution de sperme traité à un nouveau tube. Stocker sur la glace jusqu'à ce que nécessaire pour la FIV (pas plus de 2-3 heures d'extraction).

4. Manuel Extrusion des oeufs d'âge mûr

NOTE: Les femelles obtenues par interruption de croisements naturels seront facilement obtenir des œufs sous anesthésie et une pression manuelle. Pendant cette procédure, le traitement tricaïne doit être soigneusement contrôlée pour éviter une surexposition qui peut empêcher la récupération des femelles.

1. Anesthésier femelles par exposition à la lumière à la solution de tricaïne: femelles de transfert avec un filet à Tricaine solution dans l'eau conditionnée (fait en ajoutant 8 ml de Tricaine 0,2% solution mère à 100 ml d'eau de poisson conditionné) pendant environ 2-5 min, jusqu'à l'arrêt de poisson mouvement branchies.
<li> Dès qu'une femme arrête le mouvement des branchies, utilisez une cuillère pour recueillir et rincer à l'eau conditionnée brièvement. Toujours à l'aide de la cuillère pour déplacer le poisson, sécher légèrement en le plaçant brièvement et à plusieurs reprises sur plusieurs endroits d'une serviette en papier, puis le transférer à un sèche 10 cm assiette propre, diamètre de Pétri. Approchez le poisson avec la cuillère dans la partie antérieure à la direction postérieure, afin d'éviter d'endommager potentiellement l'opercule des branchies.
2. Utilisez des lingettes de laboratoire ou d'un tissu doux pour sécher doucement en outre la zone anale, pour éviter tous les oeufs libérés prématurément étant activé par l'eau. Mouillage les doigts légèrement avec de l'eau (pour éviter de les coller à des écailles de poisson), placez un doigt d'une main sur le dos de la femelle comme support, et avec un doigt de l'autre main applique une légère pression le long de l'abdomen de la femelle jusqu'à ce que les œufs deviennent extrudée.
3. Utiliser une spatule étroite pour déplacer les œufs à distance du corps de la femelle. Placez la femelle de retour dans un réservoir avec de l'eau conditionnée pour la récupération.
   
4. Activer (avec exposition à l'eau) et fertiliser (avec addition de sperme de solution) des œufs en même temps et dans les 90 secondes après extrusion (voir section 5).

5. Fécondation In Vitro

NOTE: la fécondation Zebrafish dans les croisements naturels est externe, en fonction de la libération et l'activation simultanée par l'eau des oeufs et du sperme lors de l'accouplement. Dans mimétiques de fécondation in vitro de ce processus en exposant les oeufs à une solution de sperme en présence d'eau. Le volume d'eau est initialement faible (1 ml) afin d'accroître la concentration des spermatozoïdes efficace. La liaison par le sperme se produit dans les 15 à 20 secondes ^{10 <}/ Sup>, et le volume d'eau peut alors être augmenté. Chorion levage contribue en outre à la synchronisation à proximité de l'embrayage en limitant la fenêtre de compétence pour la fixation du sperme ^11,12. Les embryons ainsi obtenus présentent donc des cycles de division cellulaire largement simultanées au cours des étapes de clivage précoce.

1. Ajouter 100 pi de solution de sperme (correspondant à l'équivalent des testicules de un mâle - voir partie 2) à l'embrayage d'œufs extrudés sur une plaque de Pétri. Remuer doucement la pointe de la pipette utilisée pour ajouter la solution de sperme parmi les oeufs pour mélanger le sperme et les oeufs ensemble, en étant sûr de ne pas soulever la pointe de la surface de la plaque de Pétri pour éviter des dommages aux œufs.
2. activer immédiatement les œufs en ajoutant 1 ml de milieu embryonnaire (E3) solution (eau conditionnée est également acceptable comme un substitut à l'E3 dans les parties 5 à 7) et encore les œufs délicatement mélanger et de sperme en remuant doucement avec la pointe de la pipette. Démarrer une minuterie pour amorcer le calendrier par rapport à la fécondation. A 1 mpf dans le volume 1 ml, inonder la plaque avec E3. Avant de continuer, laisser reposer jusqu'à 10-12 mpf pour permettre l'activation de l'œuf, y compris l'expansion de chorion complète.

6. Heat Shock Treatment

NOTE: Un choc thermique appliqué dans l'embryon précoce inhibe centriole duplication, ce qui entraîne un complément incomplet de centrioles pour conduire la formation du fuseau au cours du cycle cellulaire ultérieure ^2. L'absence de broche dans son tour entraîne l'absence de formation de sillon ^13.

1. Après l'expansion des chorions (10-12 mpf), verser les embryons à partir de la plaque de Pétri dans une passoire à thé. Rincer la plaque de Pétri en utilisant une bouteille de lavage avec E3 afin de recueillir tous les embryons restants dans la passoire à thé.
2. Placez la passoire à thé avec les embryons à l'intérieur d'un bêcher dans un bain préchauffé avec E3 à 28,5 ° C. Pré-équilibrer le bécher et E3 à la température du bain d'eau, et assurez-vous qu'il ya assez E3 de telle sorte que tous les embryons dans le thécrépine sont exposés au milieu.
3. A 22 mpf, retirez la passoire à thé du bain d'eau à 28,5 °, brièvement épongez sur une serviette en papier pour enlever l'excès d'humidité, et le placer dans un bécher E3 préchauffé similaire dans un bain de chaleur à 41,4 ° C.
4. A 24 mpf, transférer la passoire à thé de retour à l'E3 dans le bain d'eau à 28,5 ° C après une brève blot. A 29 mpf, utilisez une bouteille de lavage avec E3 pour transférer les embryons de la passoire à thé sur une plaque de 10 cm de Pétri.

7. Sélection des embryons avec un One cycle Cytocinèse Stall

1. Au cours de la mpf période 35-45, sous un microscope binoculaire avec une source de lumière transmise, sélectionner les embryons qui subissent un clivage symétrique dans le stade 2 cellules, et qui sont donc fertilisés. Retirer les embryons qui ne subissent pas de clivage cellulaire.
2. Continuer en observant les embryons fécondés, sélectionnés pour la division cellulaire normale au cours du premier cycle cellulaire, et pendant le second cycle cellulaire (50-65 mpf).
3. Trier les embryons selon les catégories suivantes (figure 2C): 4 cellules ( "no décrochage", dans le 2: standard arrangement 2 pour un embryon 4 cellules); 3 cellules ( "décrochage partiel", dans un aberrants 2 petites cellules: 1 grand arrangement cellulaire); et 2 cellules ( "bloqués", les embryons présentant un retard de cycle d'une cellule dans un mélange 1: 1 disposition identique à celui d'un embryon de 2 cellules). Trier les embryons bloqués dans une plaque de Pétri frais.
   NOTE: A ce stade, les embryons dans le 2: 2 arrangement correspondent à ceux qui, au cours du deuxième cycle cellulaire ni blastomère a subi un décrochage de la division cellulaire; embryons dans un aberrants 2 petites cellules: 1 grand arrangement de cellules correspondent à ceux où le choc thermique provoqué un décrochage du cycle cellulaire au cours du deuxième cycle cellulaire dans un blastomère mais pas l'autre; et les embryons "bloqués" dans un mélange 1: 1 disposition correspondent à celles où, au cours du deuxième cycle cellulaire, les deux blastomères ont subi la division cellulaire désiréestalle. les embryons bloqués doivent reprendre le clivage cellulaire pendant la période du cycle cellulaire suivant (65-80 MPF). L'agencement des blastomères peut être variable, en raison des indices incomplets à partir du cycle de la cellule précédente pour stabiliser la broche ^2,14, mais la plupart des embryons formera une blastula relativement normale qui peut subir un développement normal.
4. Permettre aux embryons de se développer dans la boîte de Petri, avec une limite de 80 embryons par 10 cm plaque. À 24 HPF, observer les embryons afin de déterminer si elles ont une morphologie caractéristique normale des embryons diploïdes diploïde homozygote ou ⁶ (mesure normale du prolongement de l' axe (figure 3A, 3C)), par opposition à l' extension axiale réduite et une plus grande épaisseur de corps caractéristique de haploïdes (figure 3B)), et / ou évaluer diploïdisation en utilisant des marqueurs génétiques de pigment à 36 FPM, comme d' or ou albinos et d' autres dosages (figure 3 et ci-dessous) ^2,6,9. Retirez tous les embryons qui semblent avoir une morphologie haploïde, ou qui ont lysées ou présentent d'autres défauts grossièrement anormaux.
   NOTE: Si vous le souhaitez, laisser les embryons se développer jusqu'à 5 jours après la fécondation, tout en continuant à éliminer les embryons lysées ou grossièrement anormales sur une base quotidienne et en ajoutant frais E3 pour rafraîchir le milieu. NOTE: Survivre embryons peuvent également être cultivées après inflation vessie natatoire au jour 5 en transférant à un système d'écloserie et d'alimentation dans des conditions standard.

Representative Results

En dépit de l'une des cellules cytokinèse du cycle de décrochage, la replication de l' ADN se produit normalement dans ces embryons, ce qui entraîne la duplication du contenu d'ADN de l'embryon (figure 1). Le protocole Streisinger Heat Shock (standard HS) implique une impulsion de chaleur au cours de la période 13-15 minutes après la fécondation (MPF) et induit principalement cytokinesis arrestation au cours de la première division cellulaire embryonnaire à 35 mpf ^1,2, alors que la méthode dérivée décrite ici, appelé Heat Shock 2 (HS2), utilise un choc thermique au cours de la période 22-24 mpf et induit cytokinesis arrestation au cours de la deuxième division de cellules embryonnaires à 50 mpf (Figure 2; ^2,3,4). À 24 HPF, l' observation des embryons permettent de déterminer si elles ont une morphologie caractéristique des embryons diploïdes normales diploïdes ou homozygotes ou le corps court et plus large axe morphologie caractéristique des embryons haploïdes (Figure 3) 2. Sélection des lignes de propagation à travers les méthodes gynogénétiques a été démontré que d' augmenter le rendement de la production diploïde homozygote ^1. La confirmation de la duplication du génome entier précis de l'inhibition attendue d'un cycle mitotique peut être obtenue par comptage des chromosomes ^2,3,4,15 ou la quantification d' un diamètre de ^3,4 nucléaire. Le développement normal chez le poisson zèbre que d' autres animaux est très sensible à des anomalies du nombre de chromosomes ¹⁶ et l'observation selon laquelle les diploïdes homozygotes deviennent vadultes iable et fertiles ^1,2,9 fournit une preuve supplémentaire pour diploïdisation réussie. Ploïdie embryon de poisson zèbre peut également être évaluée en utilisant des méthodes moléculaires telles que fluorescent dans l' hybridation in situ (FISH) du nombre de gènes nucléaires et cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour quantifier la teneur en ADN ^16.

Figure 1: types de fertilisation. (A) l' accouplement naturel. gamètes mâles et femelles ne sont pas traitées, ce qui entraîne un diploïde naturel. (B) Les spermatozoïdes sont traités avec des UV, ce qui entraîne la destruction de l'ADN paternel et la production de zygotes haploïdes. Si non traitée, ces haploïdes ne survivent pas à jour passé 2-3 du développement. (C) Traitement des zygotes haploïdes avec Heat Shock 2 (HS2) inhibe un cycle de cytocinèse de la mitose dans l'embryon précoce. Ce cycle cellulaire décrochage, en coupled à la réplication de l'ADN non affecté, génère diploïdes homozygotes qui peuvent devenir des adultes viables et fertiles. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: HS2 favorise la duplication du génome entier en décrochant le deuxième cycle cellulaire. Motif (A) de cellules de clivage d'un embryon non traité au cours des trois premiers cycles cellulaires, ce qui correspond à des embryons 2-, 4 ou 8 cellules. Les résultats du traitement (B) , HS2 dans une stalle d' un cycle de la division cellulaire au cours du deuxième cycle cellulaire. Pendant le décrochage, les résultats de la synthèse d'ADN en cours dans les embryons soumis à diploïdisation, soit de haploïde à diploïde (n -> 2n) ou diploïde à tétraploïde (2n -> 4n) (voir texte). Après ce décrochage, l'embryon reprend la division cellulaire, avec le nec'ouest acquis ploïdie. (C) HS2-traités embryons peuvent présenter une variété d'arrangements blastomere selon que blastomères présentent un retard de la division cellulaire au cours du deuxième cycle cellulaire: i) "ne décrochage": ni expositions blastomere un retard, résultant dans un 2: disposition caractéristique 2 embryons au stade 4 cellules, ii) «décrochage partiel»: un seul des deux blastomères présente un retard, ce qui entraîne une aberrante 2: 1 arrangement, et iii) "au point mort": les deux blastomères présentent un retard, ce qui entraîne dans un 1: 1 disposition caractéristique des embryons au stade 2 cellules. Dans (A - C), les noyaux sont représentés sous forme de cercles bleus, avec l'événement diploïdisation représenté par un élargissement de la taille nucléaire. Voir la référence ² pour un diagramme illustrant le comportement centriolaire comme base proposée pour le décrochage de la division cellulaire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir un plus grand versisur ce chiffre.

Figure 3: Morphologie des diploïdes naturels, haploïdes et gynogenotes. (A) de la morphologie embryonnaire normal d'un diploïde obtenu par des croisements naturels. (B) embryons haploïdes présentent un axe de corps plus court et plus large. (C) diploïdes homozygotes ont une morphologie normale du corps. Embryons portent en outre une mutation récessive dans le doré du gène de la pigmentation pour faciliter le suivi de l' héritage de l' ADN parental: les mères sont porteurs homozygotes pour une mutation dans d' or, et les pères de type sauvage pour ce gène. Ainsi, les diploïdes naturels, hétérozygotes pour or, présentent de type sauvage pigmentation, alors que les deux haploïdes (hémizygotes pour or) et diploïdes homozygotes (homozygotes pour or) présentent une pigmentation mutant. Barre d'échelle = 0,5 mm. Panneaux modifiés de reConférence ^2, réimprimé avec la permission. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Solution	Composants	Conditions de stockage
La solution de Hanks 1	8,0 g de NaCl, et 0,4 g de KCl dans 100 ml ddH 2 O	Conserver à 4 o C
Solution 2 de Hanks	0,358 g anhydres Na 2 HPO 4, et 0,6 g KH 2 PO 4 dans 100 ml ddH 2 O	Conserver à 4 o C
Solution 4 Hanks	0,72 g CaCl2 dans 50 ml ddH 2 O	Conserver à 4 o C
Solution 5 Hanks	1,23 g MgSO 4 ∙ 7H 2 O dans 50 ml ddH 2 O	Conserver à 4 o C
Le Premix de Hank	Ajouter, dans l'ordre suivant: 10,0 ml Solution 1, 1,0 ml de solution 2, 1,0 ml de solution 4, 86,0 ml ddH2O, et 1,0 ml Solution 5	Conserver à 4 o C
Solution de Hanks 6	0,33 g NaHCO3 dans 10 ml ddH 2 O	Préparer frais le matin de la procédure de fécondation in vitro

Tableau 1. Préparation des solutions de Hank.

Discussion

Les étapes critiques

Il est essentiel de travailler dans des conditions d'efficacité dans la fécondation in vitro. Pour assurer un bon approvisionnement d'oeufs matures (étape 1), les femelles mis en place pour l'accouplement ne doivent pas avoir été mis en place dans les croisements d'accouplement pendant au moins 5 jours et devrait apparaître gravide. Pendant l'interruption de la reproduction, un observateur peut surveiller 15-30 réservoirs de manière adéquate pour la première apparition de l'extrusion des œufs naturels. Interruption de l'accouplement doit avoir lieu le plus rapidement possible lorsque les premiers oeufs sont libérés grâce à des accouplements naturels, afin de permettre à la plupart des œufs restent à l'intérieur des femelles pour la procédure de FIV. Ces femmes, qui sont maintenant prêts pour l'extrusion manuelle des oeufs matures, peuvent être maintenus séparés jusqu'à 2 heures sans effet apparent sur la ponte subséquente. Pour préparer une solution de sperme efficace (étape 2), les hommes doivent apparaître robuste et idéalement avec une teinte rougeâtre, qui est caractéristique de l'élevage mâles de poisson zèbre. Une dissection propre implique typiquement remoVing la voie intestinale en le tirant vers le postérieur du corps, et la vessie natatoire en le tirant en avant. Après le retrait des organes internes centraux, les testicules restent masses allongées translucides aux côtés de chaque côté de la paroi interne du corps. Évitez d' inclure les organes indésirables (par exemple les intestins) dans la solution de sperme; le cas échéant les séparer les testicules en travaillant sur une surface de la plaque de pétri à sec avant d'être placé dans la solution de Hank. Pour atteindre des taux de fécondation lors de la FIV (étape 4), il est essentiel que les œufs extrudés sont maintenues compétente jusqu'à plus de sperme. Eggs compétentes pour la fécondation présentent une tonalité légèrement jaune et sont translucides. Évitez les œufs ayant tout contact avec l'eau avant l'addition du sperme, car l'eau va déclencher l'activation de l'œuf et l'activation prématurée empêchera la fécondation. activation de l'eau et la fertilisation devraient se produire dans 90 sec d'extrusion de la femelle afin d'éviter la déshydratation des œufs, qui seraconduire à leur dégradation. Si nécessaire, les œufs extrudés peuvent être conservés pendant des périodes plus longues (jusqu'à 1,5 heures ou plus) dans 100-200 ul de la solution de Hank supplémenté avec 0,5% de sérum albumine bovine (BSA) ¹⁷ (lors de la préparation de la solution de Hank dans ce but précis, préparer le prémélange pour corriger la teneur en eau ajoutée lors de BSA supplémentation). Si les œufs ont été conservés compétente avec l'aide de la solution de BSA de Hank, retirer le BSA de l'excès Hank des oeufs en utilisant une micropipette et fertiliser en 1 min.

Une étape cruciale pour le succès de diploïdisation utilisant HS2 est le tri des embryons bloqués (étape 7). tri initial de cliver symétriquement embryons de 2 cellules sélectionne pour les embryons qui deviennent fécondés et commencent la division cellulaire (dispermie occasionnelle durant les résultats de la FIV dans des embryons que la transition directement à partir de 1 à 4 cellules à 35-50 mpf - ces embryons doivent être mis au rebut). Cellule vélo se produit toutes les 15 min au cours de ces embryonnaire précoce stâges (35 à 50 FPM pour le premier cycle cellulaire, 50-65 MPF pour le deuxième cycle cellulaire, etc.), afin de cliver le tri des embryons pendant les 10 premières minutes de chaque cycle cellulaire assure une absence de chevauchement entre les cycles et précise l'identification d'une cabine de la division cellulaire.

Modifications et dépannage

La force du traitement UV à l' étape 3 (par exemple , le temps d'exposition, la puissance de la lampe, la distance à la lampe) peut être ajusté si nécessaire en testant les taux de fertilisation initiale ainsi que la fréquence des haploïdes en l'absence de traitement HSII subséquente: la quantité correcte de l' exposition aux UV n'a pas un effet notable sur les taux de fertilisation tout en conduisant à 100% des embryons haploïdes (voir résultats représentatifs pour distinguer haploïdes à partir d' embryons diploïdes). l'exposition aux UV Trop provoque des taux de fertilisation réduits sans doute en raison des effets délétères sur la fonction des spermatozoïdes, tandis que l'exposition aux UV insuffisante produit des embryons diploïdes due to une inactivation incomplète de l'ADN des spermatozoïdes.

Si les embryons présentent des anomalies du développement ou la létalité après la reprise de clivage cellulaire (étape 7), la température de choc thermique à l' étape 6 peut être légèrement réduite (par exemple à 41,0 ° C) pour augmenter la survie des embryons; conditions qui se traduisent par fractions à peu près égales de aberrante 3 cellules et au point mort embryons 2 cellules au cours du deuxième cycle cellulaire (et sont donc près du seuil pour un effet sur la duplication centriolaire) entraîne des défauts de développement ultérieurs minimes et ont augmenté la survie après la reprise du cycle cellulaire .

La méthode HS2 incorpore un mécanisme pratique et intrinsèque pour évaluer la division cellulaire décrochage (et la duplication du génome entier donc), puisque l'observation directe d'embryons car ils développent permet le suivi des différents cycles cellulaires. La sélection manuelle des embryons qui ont subi un décrochage de division de cycle d'une cellule permet de générer une population uniforme de l'embryon diploidizeds. HS2 peut être réalisée en toute souche génétique zebrafish (par exemple AB, Tübingen, WIK), que les actes d' une division cellulaire décrochage comme un mécanisme intrinsèque pour confirmer duplication de l' ADN. En outre, les marqueurs génétiques visibles introduits dans la souche peuvent être utilisés pour faciliter l'identification des embryons diploidized (figure 3). Par exemple, l'utilisation d'œufs de femelles qui sont homozygotes pour les mutations récessives dans des gènes de la pigmentation, tels que l' or ou albinos, peut être combiné avec du sperme provenant de souches de type sauvage portant des alleles normaux pour le même gène de la pigmentation. Dans cette situation, parce que le sperme traité UV ne peut pas contribuer allèles de pigment de type sauvage, des embryons diploïdes haploïdes et homozygotes présentent la mutation pigmentaire récessive. En outre, les diploïdes homozygotes présentent de type sauvage morphologie à 24 HPF, en contraste frappant avec la morphologie haploïde moins étendue. La combinaison de l'aspect du trait récessif maternelle et embry globaleo la morphologie confirme avec succès la duplication de ploïdie. Une confirmation supplémentaire peut être obtenue par comptage des chromosomes d'embryons traités et non traités.

Le système de marquage génétique décrit ci-dessus, sur la base des marqueurs génétiques visibles récessifs, permet également de confirmer l'absence d'ADN de sperme provenant de la descendance, étant donné que les embryons résultants présentent de type sauvage de la pigmentation que si le sperme n'a pas été totalement inactivé par le traitement UV . En l'absence d'un système de marquage génétique, un échantillon d'embryons peut être autorisé à se développer en l'absence de choc thermique pour confirmer que tous les embryons présentent la morphologie haploïde à 24 HPF, et donc que l'ADN de sperme inactivation était complète. En conjonction avec le sperme complètement inactivé, ce même système de marquage génétique permet également la détection polaire défaillance du corps spontané potentiel. Un tel événement se traduirait par l'apparition d'embryons récessive marqués avec la morphologie diploïde sans traitement diploïdisation. bo polaire spontanéel' échec dy n'a pas été observé chez le poisson zèbre , mais est rapporté dans Xenopus tropicalis ^18. Si elle est présente dans un système donné, cet événement spontané devrait être réduite ou contrôlée dans le but de mettre en œuvre de manière optimale la manipulation ploïdie.

Limites de la technique

La capacité à produire gynogenotes viables repose sur l'absence de variants du gène d'arrière-plan qui, lorsqu'ils sont homozygotes sont délétères. Ainsi, le succès de la procédure varie en fonction de la souche génétique utilisée. La sélection des souches génétiques à travers plusieurs générations de gynogenèse a été montré pour améliorer la viabilité ^1.

La méthode HS2, lorsqu'il est utilisé en conjonction avec le sperme non traité pour produire des embryons diploïdes, permet également la production d'embryons tétraploïdes à une fréquence élevée. Cependant, dans ce cas, en raison de la diploïde à la transformation tétraploïde, marqueurs génétiques ne permettent pas facilement pour la confirmation de genom ensemblee duplication. Dans ce cas, l'observation de la stalle de cycle de cellules dans des embryons synchronisés et la sélection des embryons bloqués devraient assurer la sélection tétraploïde, et le nombre de chromosomes peuvent être utilisés pour confirmer davantage ploïdie.

Importance par rapport à d'autres méthodes existantes /

Bien que décrit par Streisinger il y a plus de 40 ans ^1, la méthode de HS norme n'a pas été largement utilisé en raison de mauvais rendement. Au lieu de cela, la manipulation ploïdie a presque exclusivement fondé sur la méthode alternative et relativement plus efficace de pression précoce, qui se traduit par la duplication ploïdie par l'inhibition de la seconde division méiotique. Cependant, les résultats de pression précoce dans des proportions variables de gène homozygotie ^9,19, ce qui diminue sa valeur comme outil génétique. Des études récentes montrent que HS2, une modification du protocole de la norme HS, à savoir l'application de l'impulsion de chaleur à un autre moment au cours du premier cycle cellulaire (22-24 lepériode mpf en HS2, comparativement à 12-14 mpf en HS standard) résulte jusqu'à 4 fois l'augmentation du rendement des productions diploïdes homozygotes.

L'action de l'impulsion de chaleur peut être déduite de se produire en raison de l'inhibition de la duplication centriole pendant le temps de choc thermique (22-24 mpf, au cours du premier cycle cellulaire), qui manque par conséquent le complément approprié pour générer une broche et la médiation la division cellulaire au cours du cycle suivant de cellules (50-65 MPF, ce qui correspond au deuxième cycle cellulaire). duplication Centriole peut reprendre en l'absence de choc thermique pendant les cycles cellulaires ultérieures, permettant le développement de procéder après un décrochage de cycle d'une cellule précise. Parce que les cycles de duplication centriole et de réplication de l' ADN sont interdépendants ^20, la réplication de l' ADN procède normalement , même pendant la division au point mort dans le deuxième cycle cellulaire. Il en résulte précise duplication du génome entier et homozygotie complète.

Les applications futures

21.

Des approches similaires à HS2 peut être appliqué à d'autres espèces à fécondation externe, même ceux ne sont pas actuellement utilisés comme systèmes génétiques. Cette méthodeen particulier, qui profite d'une période de temps de la fécondation grâce à l'initiation de blastomère vélo où une impulsion de chaleur peut affecter la duplication centriole et générer un décrochage de la division cellulaire précise et la duplication du génome entier sans produire d'effets délétères de développement. Ainsi, cette période précoce peut être exploré pour la sensibilité au choc thermique pour développer des méthodes génétiques ploïdie base manipulation-dans d'autres systèmes animaux.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zebrafish mating boxes	Aqua Schwarz	SpawningBox1
NaCl	Sigma	S5886
KCl	Sigma	P5405
Na2HPO4	Sigma	S3264
KH2PO4	Sigma	P9791
CaCl2	Sigma	C7902
MgSO4-7H2O	Sigma	63138
NaHCO3	Sigma	S5761
Tricaine	Western Chemical	Tricaine-D (MS 222)	FDA approved (ANADA 200-226)
Tris base	Sigma	77-86-1	to prepare 1 M Tris pH 9.0
HCl	Sigma	920-1	to prepare 1 M Tris pH 9.0
Fish net (fine mesh) (4-5 in)	PennPlax	(ThatFishThatPlace # 212370)	available in ThatFishThatPlace
Plastic spoon			available in most standard stores
Dissecting scissors	Fine Science Tools	14091-09
Dissecting forceps	Dumont	SS	available from Fine Science Tools
Dissecting stereoscope (with transmitted light source)	Nikon	SMZ645	or equivalent
Reflective light source (LED arms)	Fostec	KL1600 LED	or equivalent
Petri plates 10 cm diameter			any maker
Eppendorf tubes 1.5 ml			any maker
Ice bucket			any maker
Pipetteman P-1000			any maker
Pipette tips 1,000 µl			any maker
Narrow spatula	Fisher	14-374
Depression glass plate	Corning Inc	722085 (Fisher cat. No 13-748B)	available from Fisher Scientific
UV lamp	UVP	Model XX-15 (cat No. UVP18006201)	available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting)
UV glasses			any maker
Paper towels			any maker
Kimwipes	Kimberly-Clark	06-666-11	available from Fisher Scientific
Timer stop watch			any maker
Wash bottle	Thermo Scientific	24020500	available from Fisher Scientific
Tea strainer			available in kitchen stores
beakers, 250 ml (2)	Corning Inc.	1000250	available from Fisher Scientific
water bath (2)			any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series)
Hanks’ Solution 1	see above	see above	8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 2	see above	see above	0.358 g Anhydrous Na2HPO4, 0.6 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O. Store at 4 °C.
Hanks’ Solution 4	see above	see above	0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O. Store at 4 °C.
Hank's Premix	see above	see above	add, in the following order: 10.0 ml Solution 1;  1.0 ml Solution 2;  1.0 ml Solution 4;  86.0 ml ddH2O;  1.0 ml Solution 5. Store at 4 °C
Hanks’ Solution 6	see above	see above	0.33 g NaHCO3 in 10 ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure.
Hank's Solution (final solution)	see above	see above	Combine 990 μl of Hank’s Premix and 10 μl of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution)