Summary
Ein modifiziertes Protokoll zur Ploidie Manipulation verwendet einen Hitzeschock eine Ein-Zyklus-Stall in cytokinesis im frühen Embryo zu induzieren. Dieses Protokoll wird in dem Zebrafisch gezeigt, sondern kann auf andere Arten anwendbar.
Abstract
Manipulation von Ploidie ermöglicht nützliche Umwandlungen, wie Diploide zu tetraploiden oder Haploiden zu diploiden. Im Zebrabärblingen, insbesondere die Erzeugung von homozygot gynogenetischen diploiden ist in der genetischen Analyse nützlich , weil sie die direkte Herstellung von Homozygoten aus einer einzigen heterozygot Mutter erlaubt. Dieser Artikel beschreibt ein modifiziertes Protokoll für die Duplizierung Ploidie basierend auf einem Wärmeimpuls während des ersten Zellzyklus, Heat Shock 2 (HS2). Durch Hemmung der centriole Vervielfältigung führt dieses Verfahren in einer präzisen Zellteilung Stand während des zweiten Zellzyklus. Die genaue Ein-Zyklus-Teilung Stall, gekoppelt unbeeinflusst DNA Vervielfältigung, ergibt sich ganze Genomduplikation. Protokolle mit diesem Verfahren verbunden sind Ei- und Samensammlung, UV - Behandlung von Spermien, in - vitro - Fertilisation und Wärmeimpuls eine Ein-Zellzyklus - Abteilung Verzögerung und Ploidie Doppelarbeit zu verursachen. Eine modifizierte Version dieses Protokolls könnte angewendet werdenPloidie Veränderungen in anderen Tierarten zu induzieren.
Introduction
Dieses Protokoll ermöglicht die Manipulation von Ploidie in Zebrabärbling - Embryonen, beispielsweise bei der Erzeugung von homozygoten gynogenetischen Diploiden von gynogenetischen Haploiden (Abbildung 1) oder die Herstellung von tetraploiden. Dies wird durch Induzieren einer Verzögerung in Zytokinese erreicht genau einem Zellenzyklus entspricht (2A, 2B). Der Schlüssel von einem Zyklus Verzögerung in cytokinesis wird durch Behandlung mit Hitzeschock erreicht. Das Standardprotokoll von Hitzeschock (HS) , wie ursprünglich von Streisinger und Kollegen beteiligt einen Temperaturimpuls während des Zeitraums 13-15 MPF, was zu einer Ein-Zyklus der Zellteilung Strömungsabriß während des ersten Zellzyklus - 1. Die Effizienz dieses Protokolls wurde durch Scannen der frühen Zellzyklen mit einem gleitenden Zeitfenster von Hitzeschockbehandlung vor kurzem verbessert. Dieser Scan einen späteren Zeitpunkt für einen Wärmeschock, noch innerhalb des ersten Zellzyklus (22-24 MPF), die zu einer höheren Rate von embr identifiziertenYos mit einem Zellteilungsströmungsabriß one-Zyklus, der in diesem Fall 2 mit der zweiten Zellzyklus wirkt. Die Beobachtung , dass experimentelle Manipulationen während des ersten Zyklus Zelle mit der Zellteilung in der zweiten Zellzyklus stören und DNA - Gehalt Vervielfältigung verursachen wurde auch bei anderen Fischarten 3,4 berichtet worden. Wir bezeichnen diese modifizierten Protokoll als Heat Shock 2 (HS2 - der Begriff "2" anzeigt, dass der Wärmeimpuls zu einem späteren Zeitpunkt erfolgt als die Standard HS-Methode, und dass der Zellzyklus-Verzögerung durch HS2 tritt während der zweiten Zellzyklus ). Diese Studien zeigten, dass die Grundlage für die Cytokinese Verhaftung nach Hitzeschock ist die Hemmung der centriole Duplizierung während des Wärmeimpulses, der Spindelbildung und Furche Induktions in der folgenden Zellzyklus wirkt. HS2 Ergebnisse in Ausbeuten von Arrest des Zellzyklus 100% nähert, und die Sätze der Ploidie Vervielfältigung bis zu 4 - mal höher als Standard HS 2.
Die Embryonen behandelt Witzha Hitzeschock während Blastomere Zellzyklus viele schädliche Wirkungen zeigen, was darauf hindeutet , dass die Hitzeschock wirkt sich für die Zellteilung 2 mehrere Prozesse erforderlich. Auf der anderen Seite, wenn die Hitzeschock vor der Einleitung des Zellzyklus (Zeitraum 0-30 MPF) angewendet wird, scheint es , Auswirkungen im Einklang mit spezifischen Störungen centriole Doppelarbeit zu haben und scheint nicht andere wesentliche Zellprozesse 2 zu beeinflussen . Diese Studien zeigten, dass die Zeit vor dem Beginn der Blastomere Teilung wird eine Entwicklungsperiode zugänglich Verwendung Heat Shock als Werkzeug zu sein, um spezifisch Ploidie durch centriole Hemmung manipulieren. Die zugrunde liegende Ursache der scheinbaren Selektivität für Hitzeschock auf centriole Vervielfältigung ist nicht bekannt, kann aber auf einen selektiven Abbau von Zentrosomen Substrukturen beobachtet unter Hitzestress in bestimmten Zelltypen, wie beispielsweise Leukozyten 5 bezogen werden.
Die zeitliche Synchronisation der embryonalen dewicklung wird durch In-vitro-Fertilisation (IVF) erreicht. Verwendung von unbehandeltem Sperma bei der Befruchtung führt zu diploiden Embryonen, die auf einem Zyklus cytokinesis Stall werden tetraploiden HS2-induziert. Die Verwendung von UV-behandelten Spermien, die Vernetzungen trägt, die ihre DNA zu inaktivieren, die Ergebnisse in gynogenetischen haploiden Embryonen 6, die auf einem Zyklus cytokinesis Stall gynogenetischen diploiden 2 werden-HSII induziert. Aufgrund der daraus resultierenden ganze Genomduplikation sind die letzteren gynogenetischen diploiden über das Genom in jedem einzelnen Locus homozygot. Für Prägnanz verweisen wir haploiden Embryonen als "Haploiden", und homozygote gynogenetischen diploiden Embryonen als "homozygot diploiden" zu gynogenetischen. Wenn lebensfähige und fruchtbare können homozygot diploiden verwendet werden steril und tödlich freien Linien zu initiieren. Direkte homozygosity induziert durch HS2 sollte auch leicht in die genetische Analyse oder genetischen Screens eingebaut werden, da homozygot diploiden von Weibchen, die heterozygote Träger von mut sindtionen zeigen Raten von Homozygotie bei hohen und festen (50%) -Verhältnisse 2.
Das folgende Protokoll beschreibt Schritte HS2 auszuführen und Ploidie Vervielfältigung mit voller homozygosity induzieren. Für tetraploiden Produktion sollte Spermien Lösung unbehandelt sein. Für homozygote diploiden Produktion, Sperma sollte durch UV-Behandlung inaktiviert werden. Darüber hinaus können auch Identifizierung von homozygoten diploiden verwendet werden, wie in der Diskussion, sichtbaren Pigmentmarkern beschrieben zu erleichtern. Zebrabärbling Kumpel in erster Linie während der ersten 3 Stunden nach Einleitung ihrer Licht - Zyklus 7 und Erwachsene und Eier sind empfindlich auf zirkadianen Rhythmen 8, so dass für die besten Ergebnisse der IVF - Verfahren innerhalb dieser Frist erfolgen soll.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden nach University of Wisconsin durchgeführt - Madison und Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) Richtlinien (University of Wisconsin - Madison Assurance Anzahl A3368-01).
1. Auswahl Frauen für Eiersammlung über Interrupted Mating
HINWEIS: IVF-basierte Protokolle stützen sich auf die Extrusion von reifen Eizellen von Frauen durch manuellen Druck 9. Vorherige Protokolle haben Frauen direkt aus den Tanks oder in Paar Paarungen ohne die Weibchen unterziehen Ei Freisetzungsverhalten verwendet, aber nur ein kleiner Bruchteil dieser Frauen (etwa 20% oder weniger, abhängig von der Zebrabärbling Linie) ergeben extrudiert und kompetente Eier auf manuellen Druck. In einem verbesserten Verfahren, sind Frauen vorsortiert zur Eiablage durch direkte visuelle Beobachtung, durch sofortige Unterbrechung der Paarung gefolgt. Dieses Verfahren ist sehr effektiv, da fast alle Frauen dieser unterbrochenen Paarung Schritt Ausbeute extrudiert und kompetente Eier vorgewählten durchbei manueller Druck.
- Am Nachmittag vor dem Experiment, Paarung Paare des gewünschten Zebrabärbling-Stamm in Standard Zebrabärbling Paarungs Boxen eingerichtet. Halten Männchen in der gleichen Kammer wie Weibchen noch physisch von ihnen getrennt, entweder durch einen Gegenfeld Teilung oder durch das männliche unter einer Eiablage Einsatz platzieren und das weibliche Inneren des Einsatzes.
- Der Morgen des Experiments, entfernen Sie die physischen Partition, sowohl die männlichen und weiblichen innerhalb der gleichen Eiablageeinsatz platzieren, so dass Paarung beginnt.
- Sichtprüfung Tanks Paarung-Paaren Extrusion von Eiern während der natürlichen Paarung zu erkennen. Bei den ersten Anzeichen von Eier Extrusionen, getrennte männliche und weibliche unterbrochen Zucht. Nach der Trennung von Männern, halten die vorgewählten Weibchen entweder einzeln oder im gleichen Behälter gepoolt. Verwenden Sie mehrere Weibchen in Abhängigkeit von der Anzahl der Embryonen gewünscht (in der Regel 50 bis 150 Eier / weiblich).
2. Vorbereiten einer Sperma-Lösung
HINWEIS: IVF rElies über die Exposition von reifen Eizellen zu einer Samen Lösung. Diese Lösung kann unbehandelt sein diploiden Zygoten zu erzeugen (was auf HS2 Behandlung werden tetraploiden Embryonen) oder UV-behandelt, haploid Zygoten zu erzeugen (die bei der HS2 Behandlung homozygot diploiden Embryonen werden). Vorherige Spermien Vorbereitungsprotokollen schlug die Verwendung von Kapillarrohren milt aus dem Analbereich von lebenden Männchen zu sammeln, aber dies war ein unwirksames Verfahren , da nur ein kleiner Bruchteil der Männchen milt 9 ergab. Das Protokoll unten dargestellt stützt sich stattdessen auf die Spermienvorbereitung von geschert seziert Hoden, die zuverlässigere Ergebnisse liefert.
- Bereiten Hank-Lösung vor der Zeit als Vormischung Lösung von Hank, umfassend alle Komponenten (Lösungen 1, 2, 4 und 5) mit Ausnahme des Natriumbicarbonat-Lösung (Lösung 6). Bereiten Lösung 6 frische und fügen Sie zu der Vormischung den Morgen des Experiments (Tabelle 1). Um Hanks 'Lösung (endgültige Lösung machen, bereiten Morgen desIVF-Verfahren), kombinieren 990 ul Hanks Premix und 10 ul der frisch 6 hergestellten Lösung.
- Euthanize Männchen durch Überbelichtung als 0,016% ige Lösung in Wasser konditioniert zu Tricaine.
- Bereiten Sie Tricaine als 0,2% Stammlösung in Wasser (Puffer auf pH 7,0 mit 1 M Tris pH 9,0) und halten bei 4 ° C. In 8 ml Tricaine Stammlösung pro 100 ml Wasser in einem Becher, und ein Netz verwenden, um die Männer zu der Tricaine Lösung zu übertragen.
- Verwenden das Äquivalent von Hoden für ein Männchen pro Gelege benötigt in einem Volumen von Hank-Lösung befruchtet werden entsprechend 100 & mgr; l pro Männchen (zB Hoden von 10 Männern in 1 ml Hanks-Lösung gesammelt, 10 Kupplungen mit 100 ul / Kupplungs zu befruchten).
- Bestätigen Sie die Euthanasie durch die Einstellung der Kiemenbewegungen für 15 Minuten. Nach Euthanasie, entfernen Sie die Männchen aus dem Becher mit einem Löffel. Spülen Sie die Männchen kurz mit klimatisiertem Wasser und trocknen Sie sie leicht, indem sie kurz an verschiedenen Standorten eines platzierenPapierhandtuch.
- Zum Entfernen der Hoden, erste decapitate eingeschläfert Männchen mit Dissektionsscheren oder einer Rasierklinge und einen Längsschnitt machen entlang der Bauch mit Sezieren scissors.Under ein Binokular mit einer reflektierten Lichtquelle, entfernen Sie die inneren Organe mit Pinzette. Ziehen Sie jede der Hoden Massen aus mit einer Pinzette und legen Sie sie in der Mikrozentrifugenröhrchen Hank-Lösung enthält.
HINWEIS: Testes kann als jede der zwei länglichen Strukturen aus durchscheinendem Aussehen neben den Körperwänden und die in der Nähe der Kloake konvergieren gefunden identifiziert werden. Testes kann 2-3 min auf einer Petri-Plattenoberfläche nach der Sektion bleiben und vor ihnen in der Hank-Lösung setzt. - Lassen Sie die Spermien in die Lösung durch Scherung der Hoden mit einem schmalen Spachtel und / oder vorsichtiges Pipettieren nach oben und unten 5-6 mal die Hoden in Lösung mit einem 1000 ul-Spitze Mikro, während der Luftblasenbildung zu vermeiden. Lassen Sie die Hoden Trümmer siedeln.
- Lagern Sie die Samenlösung in Eis, wo er seine Potenz für bis zu 2-3 Stunden zu halten. Wenn Sie fortfahren, um UV-Behandlung von Spermien Lösung wird die Lösung in eine saubere Mikrozentrifugenröhrchen hinter die Stücke von Hoden verlassen.
3. UV-Behandlung
HINWEIS: UV-Behandlung wird verwendet, Sperma-DNA, um zu vernetzen sie inaktiv im Embryo zu machen. Dieser Schritt wird nur verwendet, wenn gynogenetischen haploid oder homozygot gynogenetischen diploiden Embryonen zu erzeugen. Sperm Lösung für UV-Behandlung sollte aus Stücken von Hoden (Schritt 2.4), als große Stücke können die Spermien von der UV-Behandlung getrennt werden abzuschirmen.
- Übertragen Sie die Spermienlösung auf eine saubere, trockene und einer Vertiefung Glasplatte auf einem Eis Bett sitzen (zB Eis in einer Petrischale). Verwenden Sie bis zu 1 ml Spermienlösung pro Glasplatte gut.
- Setzen Sie die Samenlösung UV durch die Vertiefung Glasplatte unter einer UV-Lampe auf dem Eis Bett platzieren. Behandeln Sie die Samenlösung für 90 Sekunden mit einem 115 V (60 Hz, 0.68A) UV-Lampe bei einem 19 cm (7,5 Zoll) Abstand. Mit dem Ende einer Pipettenspitze, vorsichtig mischen die Lösung alle 30 Sekunden während der UV-Behandlung (eine saubere Pipettenspitze alle 30 sec verwenden).
- Mit einem sauberen Pipettenspitze und Mikropipette, übertragen Sie die behandelten Samen Lösung auf ein neues Reaktionsgefäß. Lagern auf Eis, bis sie benötigt für die IVF (nicht mehr als 2-3 Stunden von der Extraktion).
4. Manuelle Extrusion von reifen Eizellen
HINWEIS: Frauen durch Unterbrechung der natürlichen Paarungen erhalten werden leicht Eier unter Narkose und manuellen Druck nachgeben. Während dieses Verfahrens Tricaine Behandlung sorgfältig gesteuert werden sollte, Überbelichtungen zu vermeiden, die Wiederherstellung der Weibchen zu verhindern.
- Anesthetize Weibchen durch Lichteinwirkung zu Tricaine Lösung: Transfer Frauen mit einer Netto-Lösung in klimatisiertem Wasser zu Tricaine (hergestellt durch Zugabe von 8 ml Tricaine 0,2% Stammlösung zu 100 ml konditionierten Fischwasser) für ca. 2-5 min, bis der Fisch Anschlag Kiemenbewegung. <li> Sobald eine weibliche Kiemenbewegung stoppt, verwenden Sie einen Löffel zu sammeln und sie kurz in klimatisiertem Wasser spülen. Immer noch mit dem Löffel, um den Fisch zu bewegen, trocknen Sie es leicht, indem sie es kurz und wiederholt an mehreren Stellen eines Papiertuch legen, ist es dann trocken mit 10 cm Durchmesser Petrischale auf einem sauberen, übertragen. Nähern Sie sich dem Fisch mit dem Löffel in der von vorne nach hinten Richtung, um zu verhindern möglicherweise die Kiemen operculum zu beschädigen.
- Verwenden Labortücher oder Weichgewebe, um sanft weiter die Afterflosse Bereich trocknen, keine Freigabe Eier zu verhindern, vorzeitig durch Wasser aktiviert wird. Dämpfende die Finger leicht mit Wasser (zu vermeiden, dass sie zu Fischschuppen kleben), legen Sie einen Finger einer Hand auf dem Rücken des weiblichen als Unterstützung, und mit einem Finger der anderen Hand mit leichtem Druck entlang der Bauch der Frau, bis Eier extrudiert werden.
- Verwenden Sie einen schmalen Spachtel, um die Eier weg von den weiblichen Körper. Legen Sie die Frauen zurück in einen Tank mit klimatisiertem Wasser für die Wiederherstellung.
- Aktivieren (mit Wasser Exposition) und befruchten (mit Sperma Lösung zusätzlich) Eier gleichzeitig und innerhalb von 90 Sekunden nach der Extrusion (siehe Abschnitt 5).
5. In - vitro - Fertilisation
HINWEIS: Zebrabärbling Befruchtung in natürlichen Kreuze ist extern, abhängig von der gleichzeitigen Freisetzung und Aktivierung durch Wasser von Eizellen und Spermien während der Paarung. In-vitro-Fertilisation Mimetika dieser Prozess durch die Eier zu Spermienlösung in Anwesenheit von Wasser ausgesetzt wird. Wasservolumen ist ursprünglich klein (1 ml), um die effektive Spermienkonzentration zu erhöhen. Von Spermien Bindung erfolgt innerhalb von 15-20 sec 10 <sup />, und Wassermenge kann dann erhöht werden. Chorion Heben trägt weiter dazu die enge Synchronisation der Kupplung durch das Fenster für die Kompetenzbegrenzung für die Spermien 11,12 Bindung. Die daraus resultierenden Embryonen weisen daher weitgehend gleichzeitige Zellteilung Zyklen während der frühen Furchungsstadien.
- 100 l Spermienlösung (entsprechend dem Äquivalent von Hoden von einem männlichen - siehe Teil 2) auf die Kupplung von extrudierten Eier auf einer Petrischale. Vorsichtig schwenken verwendet, um die Pipettenspitze die Spermien-Lösung unter die Eier hinzufügen zusammen, um die Spermien und Eier zu mischen, sicher die Spitze von der Oberfläche der Petrischale nicht heben sein Ei Schäden zu vermeiden.
- Sofort die Eier aktivieren durch Zugabe von 1 ml embryonalen Medium (E3) Lösung (konditioniertes Wasser ist auch akzeptabel, als Ersatz für die E3 in Teile 5 bis 7) und wieder sanft Eier und Sperma mit der Pipettenspitze durch vorsichtiges Schwenken mischen. Starten Sie eine Timer-Timing in Bezug auf die Befruchtung zu initiieren. Bei 1 MPF im Volumen von 1 ml, überfluten die Platte mit E3. Bevor wir fortfahren, lassen Sie ungestört bis 10-12 MPF Eiaktivierung zu ermöglichen, einschließlich der vollständigen Chorion Expansion.
6. Hitzeschockbehandlung
HINWEIS: Ein Hitzeschock im frühen Embryo angewendet hemmt centriole Vervielfältigung, was zu einer unvollständigen Ergänzung Centriolen während der anschließenden Zellzyklus 2 Spindelbildung zu fahren. Das Fehlen von Spindel wiederum zu der fehlenden Bildung Furche 13.
- Nach der Expansion der Chorion (10-12 MPF), gießen Sie die Embryonen aus der Petrischale in ein Teesieb. Spülen Sie die Petrischale mit einer Waschflasche mit E3, um unter Verwendung irgendwelcher restlichen Embryonen im Teesieb zu sammeln.
- Setzen Sie den Teesieb mit den Embryonen in einem Becherglas in einem vorgeheizten Bad mit E3 bei 28,5 ° C. Pre-äquilibrieren den Becher und E3 in das Wasserbad Temperatur, und stellen Sie sicher, dass genügend E3 ist, so dass alle Embryonen in den TeeSchmutzfänger werden dem Medium ausgesetzt.
- Bei 22 MPF, entfernen Sie das Teesieb aus dem Wasserbad 28,5 ° C, es kurz auslöschen auf ein Papiertuch, um überschüssige Feuchtigkeit zu entfernen, und legen Sie sie in einem ähnlich vorgewärmte E3 Becherglas in einem Wärmebad bei 41.4 ° C.
- Bei 24 MPF, übertragen Sie den Teesieb im Wasserbad auf der E3 zurück bei 28,5 ° C nach kurzer Blotting. Mit 29 MPF, eine Waschflasche mit E3 verwenden, um die Embryonen aus dem Teesieb auf einer 10 cm Petrischale zu übertragen.
7. Auswahl für Embryonen mit einem Ein-Zyklus Cytokinesis Stall
- Während der Zeitperiode 35-45 MPF, unter einem Binokular mit einer Lichtquelle übertragen, wählen Sie jene Embryonen, die symmetrische Spaltung in die 2-Zell-Stadium durchlaufen, und die daher befruchtet werden. Entfernen Embryonen, die keine Zellspaltung durchlaufen.
- Weiterhin die befruchtete Embryonen beobachtet, für die normale Zellteilung während des ersten Zellzyklus ausgewählt und während der Sekundeond Zellzyklus (50-65 MPF).
- Sortier Embryonen gemäß den folgenden Kategorien (2C): 4 - Zellen ( "no Stall", in der 2: 2 - Standard - Anordnung für ein 4-Zellen - Embryo); 3-Zellen ( "partial Stall", in einer abweichenden 2 kleinere Zellen: 1 große Zellenanordnung); und 2-Zellen ( "blockiert", Embryonen zeigen eine Ein-Zellzyklus-Verzögerung in einer 1: 1-Anordnung identisch zu der eines 2-zellige Embryos). Sortieren Sie die ins Stocken geraten Embryonen in eine frische Petrischale.
HINWEIS: In diesem Stadium Embryonen in der 2: 2-Anordnung entsprechen denen weder Blastomere dem während der zweiten Zellzyklus eine Zellteilung Stall unterzogen; Embryonen in aberranter 2 kleinere Zellen: 1 große Zellenanordnung entsprechen denjenigen in dem Hitzeschock eine Zellzyklus-Strömungsabriß während des zweiten Zellzyklus in einer Blastomere verursacht aber nicht die andere; und Embryonen "ins Stocken geraten" in einer 1: 1-Anordnung entsprechen denen, wo während des zweiten Zellzyklus beide Blastomeren die gewünschte Zellteilung unterzogStall. Stalled Embryonen Zellspaltung während der folgenden Zellzyklusperiode (65-80 MPF) wieder aufnehmen. Die Anordnung von Blastomeren kann variabel sein, aufgrund der unvollständigen Hinweise aus der vorherigen Zellzyklus der Spindel 2,14 zu stabilisieren, aber die meisten Embryonen wird ein relativ normales blastula bilden , die normale Entwicklung unterzogen werden kann. - Lassen Embryonen in der Petrischale, mit einem Limit von 80 Embryonen pro 10 cm Platte zu entwickeln. Bei 24 HPF, beachten Sie die Embryonen zu bestimmen , ob sie eine normale Morphologie charakteristisch für diploide oder homozygot diploiden Embryonen 6 (normale Ausmaß der Achse Verlängerung (3A, 3C)) haben, im Gegensatz zu reduzierten Achserweiterung und erhöhte Körperstärke charakteristisch für Haploiden (3B)), und / oder beurteilen Diploidisierung mit genetischen Markern Pigment bei 36 MPF, wie golden oder Albino und andere solche Assays (Abbildung 3 und siehe unten) 2,6,9. Entfernen Sie alle Embryonen, die eine haploide Morphologie zu haben scheinen, oder dass lysiert haben oder andere grob abnormal Mängel aufweisen.
HINWEIS: Falls gewünscht, lassen Embryonen bis 5 Tage nach der Befruchtung zu entwickeln, während sie weiterhin lysiert oder grob abnorme Embryonen auf einer täglichen Basis zu entfernen und Zugabe von frischem E3 das Medium zu aktualisieren. HINWEIS: Die überlebenden Embryonen können auch nach dem Schwimmblase Inflation auf 5 Tage gezüchtet werden, indem man zu einer Brüterei System übertragen und unter Standardbedingungen Fütterung.
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Representative Results
Trotz des Stalles ein Zellzyklus Zytokinese tritt die DNA - Replikation normalerweise in solchen Embryonen, die sich in der Vervielfältigung der DNA - Gehalt des Embryos (Abbildung 1). Das Streisinger Heat Shock - Protokoll (Standard HS) beinhaltet einen Wärmeimpuls während der Zeit von 13 bis 15 Minuten nach der Befruchtung (MPF) und induziert in erster Linie cytokinesis Verhaftung während der ersten embryonalen Zellteilung bei 35 MPF 1,2, während die abgeleitete Methode , die hier beschrieben wird , bezeichnet als Heat Shock 2 (HS2), verwendet in der Zeit von 22 bis 24 MPF einen Hitzeschock und induziert bei 50 MPF während der zweiten embryonale Zellteilung cytokinesis Verhaftung (Abbildung 2; 2,3,4). Bei 24 HPF, Beobachtung der Embryonen ermöglichen festzustellen , ob sie eine normale Morphologie charakteristisch für diploide oder homozygot diploiden Embryonen haben, oder die kürzere und breitere Körperachse Morphologie charakteristisch haploider Embryonen (Abbildung 3)
Abbildung 1: Düngung Typen. (A) Natürliche Paarung. Männliche und weibliche Gameten sind unbehandelt, in einem natürlichen diploiden zur Folge hat. (B) Das Sperma wird mit UV behandelt, was zur Zerstörung der väterlichen DNA und die Produktion von haploiden Zygoten. Wenn sie nicht behandelt, so Haploiden nicht überleben letzten Tag 2-3 der Entwicklung. (C) Die Behandlung von haploiden Zygoten mit Heat Shock 2 (HS2) hemmt ein Zyklus von cytokinesis der Mitose im frühen Embryo. Diese Zellzyklus-Stall, Paard unbeeinflusst DNA-Replikation, erzeugt homozygot Diploide, das lebensfähig und fruchtbar Erwachsene werden kann. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: HS2 fördert ganze Genomduplikation durch den zweiten Zellzyklus Abwürgen. (A) Zellspaltungsmuster eines unbehandelten Embryo während der ersten drei Zellzyklen, entsprechend 2-, 4- und 8-Zellen - Embryos. (B) HS2 Behandlungsergebnisse in einem Ein-Zyklus - Strömungsabriß der Zellteilung in der zweiten Zellzyklus. Während der Stall, kontinuierliche DNA-Synthese wird in Embryonen unterzogen Diploidisierung, entweder haploid diploiden (n -> 2n) oder diploiden zu tetraploiden (2n -> 4 n) (siehe Text). Nach diesem Stall, nimmt der Embryo die Zellteilung, die mit dem neWLY Ploidie erworben. (C) HS2-behandelten Embryonen eine Vielzahl von Blastomeren Anordnungen aufweisen kann , je nachdem ob Blastomeren während der zweiten Zellzyklus eine Zellteilung Verzögerung aufweisen: i) "kein Strömungsabriß": weder Blastomere weist eine Verzögerung, was zu einer 2: 2 - Anordnung charakteristisch 4-Zellen-Stadium Embryonen, ii) "Teil Stall": nur eine von zwei Blastomeren weist eine Verzögerung, in einer abweichenden 2: 1 ergibt Anordnung, und iii) "ins Stocken geraten": beide Blastomeren eine Verzögerung aufweisen, in eine resultierende 1: 1 Anordnung charakteristisch für 2-Zell-Stadium Embryonen. In (A - C), Kerne werden als blaue Kreise dargestellt, mit dem Diploidisierung Ereignis durch eine Erweiterung der Kerngröße dargestellt. Siehe Referenz 2 für ein Diagramm , das centriolar Verhalten als die vorgeschlagene Basis für die Zellteilung Stall. Bitte klicken Sie hier einen größeren versi zu sehenauf dieser Figur.
Abbildung 3: Morphologie der natürlichen Diploide, Haploiden und gynogenotes. (A) Normale embryonale Morphologie eines diploiden durch natürliche Kreuzungen erhalten. (B) haploide Embryonen zeigen eine kürzere und breitere Körperachse. (C) homozygote diploiden haben normale Körpermorphologie. Embry zusätzlich eine rezessive Mutation in dem goldenen Pigmentierung Gen tragen Eltern - DNA - Erbe zu erleichtern Tracking: Mütter homozygote Träger für eine Mutation in golden sind, und Väter Wildtyp für dieses Gen. So natürliche Diploide, für golden heterozygot weisen Wildtyp - Pigmentierung, während beide Haploiden (hemizygous für golden) und homozygot Diploide (homozygot für golden) zeigen Mutante Pigmentierung. Maßstabsbalken = 0,5 mm. Panels von re geändertferenz 2, mit freundlicher Genehmigung abgedruckt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Lösung | Komponenten | Lagerbedingungen |
| Hanks 'Lösung 1 | 8,0 g NaCl, und 0,4 g KCl in 100 ml ddH 2 O | Lagerung bei 4 ° C |
| Hanks 'Lösung 2 | 0,358 g wasserfreies Na 2 HPO 4, und 0,6 g KH 2 PO 4 in 100 ml ddH 2 O | Lagerung bei 4 ° C |
| Hanks 'Lösung 4 | 0,72 g CaCl & sub2; in 50 ml ddH 2 O | Lagerung bei 4 ° C |
| Hanks 'Lösung 5 | 1,23 g MgSO & sub4; 7H & sub2 ; O ∙ in 50 ml ddH 2 O | Lagerung bei 4 ° C |
| Hanks Premix | Fügen Sie in der folgenden Reihenfolge: 10,0 ml Lösung 1, 1,0 ml Lösung 2, 1,0 ml Lösung 4, 86,0 ml ddH 2 O und 1,0 ml Lösung 5 | Lagerung bei 4 ° C |
| Hanks 'Lösung 6 | 0,33 g NaHCO 3 in 10 ml ddH 2 O | Bereiten Sie frisch am Morgen des IVF-Verfahren |
Tabelle 1. Herstellung von Hank-Lösungen.
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Discussion
Kritische Schritte
Es ist wichtig, unter den Bedingungen einer wirksamen in-vitro-Fertilisation zu arbeiten. Um eine gute Versorgung mit reifen Eier (Schritt 1) zu gewährleisten, Frauen setzen für die Paarung sollte nicht wurden in Paarungs Kreuze für mindestens 5 Tage festgelegt und sollte gravide erscheinen. Während Unterbrechung der Zucht, kann ein Beobachter 15-30 Tanks ausreichend für das erste Auftreten von natürlichen Ei Extrusion überwachen. Unterbrechung der Paarung sollte so schnell wie möglich auftreten, wenn die ersten Eier durch natürliche Paarungen freigesetzt werden, um die meisten Eier zu erlauben, innerhalb der Weibchen für die IVF-Verfahren bleiben. Diese Frauen, die jetzt bereit sind, für die manuelle Extrusion von reifen Eizellen können gehalten werden getrennt für bis zu 2 Stunden ohne erkennbare Wirkung auf die nachfolgende Eifreigabe. Um eine effektive Samenlösung (Schritt 2) vorzubereiten, sollten Männer scheinen robust und idealerweise mit einem Rotstich, die aus der Zucht Zebrabärbling Männchen charakteristisch ist. Eine saubere Präparation umfasst in der Regel removing die Darm Spur, indem sie es in Richtung auf den hinteren Teil des Körpers und der Schwimmblase, indem sie es nach vorne ziehen ziehen. Nach dem Entfernen der zentralen inneren Organe, bleiben die Hoden als durchscheinende längliche Massen neben jeder Seite des inneren Körperwand. Vermeiden Sie auch unerwünschte Organe (zB Darm) in die Spermien - Lösung; bei Bedarf trennen diese von Hoden durch auf einer trockenen Petrischale Oberfläche arbeiten, bevor sie in die Lösung des Hank gelegt. Um eine hohe Befruchtungsraten bei IVF (Schritt 4) zu erreichen, ist es wichtig, dass extrudierte Eier kompetent gehalten werden, bis Sperma hinaus. Eier zuständig für die Befruchtung zeigen einen leicht gelben Ton und sind durchscheinend. Vermeiden Sie Eier jeden Kontakt mit Wasser vor der Spermien zusätzlich mit, da Wasser Ei-Aktivierung und eine vorzeitige Aktivierung auslösen wird verhindern Befruchtung. Wasseraktivierung und Befruchtung sollte vom Weibchen innerhalb von 90 Sekunden der Extrusion auftreten, um Dehydratisierung von Eiern zu vermeiden, was wirdführen zu deren Abbau. Bei Bedarf können extrudierte Eier für einen längeren Zeitraum gehalten werden (bis zu 1,5 Stunden oder mehr) in 100-200 ul Hanks-Lösung , ergänzt mit 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) , 17 (wenn der Hank-Lösung für diesen Zweck vorbereitet, bereiten die Vormischung für Wassergehalt zu korrigieren während BSA Ergänzung hinzugefügt). Wenn Eier haben mit Hilfe von Hank-BSA-Lösung kompetent gehalten wurde, entfernen Sie überschüssige Hanks BSA aus den Eiern mit einer Mikropipette und innerhalb von 1 min befruchten.
Ein entscheidender Schritt für den Erfolg von Diploidisierung HS2 mit der Sortierung der ins Stocken geraten Embryonen (Schritt 7). Erste Sortierung von symmetrisch 2-Zellen-Embryonen zu spalten wählt für Embryonen, die befruchtet werden und die Zellteilung (gelegentliche Dispermie während der IVF-Ergebnisse in Embryonen, die Übergang direkt von 1- bis 4-Zellen bei 35-50 MPF - solche Embryonen verworfen werden sollte) beginnen. Zellzyklus erfolgt alle 15 Minuten während dieser frühen embryonalen stAlter (35-50 mpf für den ersten Zellzyklus 50-65 mpf für den zweiten Zellzyklus, und so weiter) versichert, so Sortieren von Embryonen in den ersten 10 min der einzelnen Zellzyklus Spaltung eine Abwesenheit der Überlappung zwischen den Zyklen und genaue Identifizierung einer Zellteilung Stall.
Technische Änderungen und Fehlersuche
Die Stärke der UV - Behandlung in Schritt 3 (zB Belichtungszeit, die Lampenleistung, Abstand zur Lampe) eingestellt werden kann , wenn Raten durch Testen anfänglichen Befruchtung erforderlich sowie die Häufigkeit von Haploiden in Abwesenheit von nachfolgenden HSII Behandlung: die korrekte Menge an UV - Exposition keinen spürbaren Einfluss auf Befruchtungsraten hat , während in 100% der haploiden Embryonen resultierenden (Repräsentative Ergebnisse sehen von diploiden Embryonen zu unterscheiden haploid). Zu viel UV-Strahlung bewirkt eine verminderte Befruchtungsraten vermutlich aufgrund schädliche Wirkungen auf die Spermienfunktion, obwohl nicht genügend UV-Exposition diploiden Embryonen aufgrund t produzierto unvollständige Inaktivierung von Spermien-DNA.
Wenn Embryonen nach Wiederaufnahme der Zelle Spaltung (Schritt 7) Entwicklungsstörungen oder Letalität aufweisen, kann die Hitzeschocktemperatur in Schritt 6 geringfügig reduziert werden (zB auf 41,0 ° C) Embryo Überleben zu erhöhen; Bedingungen, die in etwa gleichen Anteilen von aberrant 3-Zellen und zum Stillstand gekommen 2-zellige Embryos während der zweiten Zellzyklus (und damit in der Nähe Schwelle für eine Wirkung auf centriolar Duplizierung) resultieren in minimal nachfolgenden Entwicklungsstörungen und erhöhte Überlebenszeit nach Wiederaufnahme des Zellzyklus führen .
Die HS2 Methode beinhaltet eine bequeme und innere Mechanismus der Zellteilung Stall (und damit ganze Genomduplikation), da die direkte Beobachtung von Embryonen zu bewerten, wie sie sich entwickeln können, die verschiedenen Zellzyklen zu verfolgen. Die manuelle Auswahl von Embryonen, die eine Eins-Zellzyklus-Division Stall unterzogen wurden, ermöglicht eine einheitliche Population von diploidisierte Embryo zu erzeugens. HS2 kann in jeder Zebrabärbling genetische Belastung (zB AB, Tübingen, WIK) durchgeführt werden, da die Ein-Zellteilungsströmungsabriß wirkt als intrinsische Mechanismus DNA Vervielfältigung zu bestätigen. Zusätzlich sichtbar genetische in den Stamm eingeführt Marker können verwendet werden , um die Identifizierung von diploidisierte Embryonen (Figur 3) zu erleichtern. Zum Beispiel ist die Verwendung von Eiern von Weibchen , die für rezessive Mutationen in Pigmentierung Gene homozygot sind, wie beispielsweise golden oder albino, können mit Sperma von Wildtypstämmen tragenden normalen Allele für die gleiche Pigmentierung Gen abgeleitet kombiniert werden. In dieser Situation, weil UV-behandelten Spermien nicht Wildtyp-Pigment-Allele, haploid und homozygote diploiden Embryonen zeigen die rezessive Pigment Mutation beitragen kann. Darüber hinaus zeigen homozygote diploiden Wildtyp-Morphologie bei 24 HPF, in scharfem Kontrast zu der weniger ausgedehnten haploiden Morphologie. Die Kombination aus dem Aussehen des mütterlichen rezessiv vererbt und insgesamt embryo Morphologie bestätigt die erfolgreiche Ploidie Duplikation. Eine weitere Bestätigung kann durch Chromosomenzahlen von behandelten und unbehandelten Embryonen gewonnen werden.
Die oben beschriebene genetische Markierungssystem, basierend auf rezessive sichtbaren genetischen Markern, ermöglicht auch die Abwesenheit von Sperma stammende DNA in der Nachkommenschaft bestätigt, da die resultierenden Embryonen nur Wildtyp-Pigmentierung aufweisen, wenn Samenzellen nicht vollständig durch die UV-Behandlung inaktiviert worden . In Abwesenheit eines genetischen Markierungssystem, eine Probe von Embryonen kann in Abwesenheit von Hitzeschock zu entwickeln, erlaubt werden, um zu bestätigen, dass alle Embryonen, die haploid Morphologie bei 24 HPF aufweisen und damit die Spermien DNA-Inaktivierung vollständig war. In Verbindung mit vollständig inaktiviert Sperma, das gleiche genetische Markierungssystem ermöglicht auch potentielle spontane Polkörper Versagen zu erkennen. Ein solches Ereignis in dem Auftreten von rezessiv gekennzeichnet Embryonen mit diploid Morphologie ohne Diploidisierung Behandlung führen würde. Spontane polar body Versagen wurde nicht in Zebrabärbling beobachtet , aber in Xenopus tropicalis 18 gemeldet wird. Falls in einem gegebenen System, würde dies spontanes Ereignis müssen für in Ordnung reduziert oder gesteuert werden, um optimal Ploidie manipulation implementieren.
Einschränkungen der Technik
Die Fähigkeit, tragfähige gynogenotes herzustellen beruht auf dem Fehlen von Hintergrund-Gen-Varianten, die als homozygot schädlich sind. Somit Erfolg des Verfahrens wird auf die genetische Belastung variieren je nach verwendeter. Die Auswahl der genetischen Stämme durch mehrere Generationen von Gynogenese wurde 1 Lebensfähigkeit gezeigt zu verbessern.
Die HS2 Verfahren, wenn sie in Verbindung mit unbehandelten Samen verwendet diploiden Embryonen zu produzieren, erlaubt auch die Herstellung von tetraploiden Embryonen mit einer hohen Frequenz. in diesem Fall zu tetraploid zur diploid aufgrund jedoch Transformation, nicht genetische Marker nicht ohne weiteres für die Bestätigung der gesamten genom ermöglichene Vervielfältigung. In diesem Fall Beobachtung des einen Zellzyklus-Stall in synchronisierten Embryonen und die Auswahl von Embryonen ins Stocken geraten sollte tetraploiden Auswahl zu gewährleisten, und Chromosomenzahlen können verwendet werden Ploidie weiter zu bestätigen.
Bedeutung in Bezug auf bestehende / alternative Methoden
Obwohl vor 1 durch Streisinger über 40 Jahren beschrieben, hat die Standard - HS - Methode nicht aufgrund der schlechten Ausbeute weit verbreitet. Stattdessen hat Ploidie Manipulation fast ausschließlich auf die alternative verlassen und relativ effizienteres Verfahren der frühen Druck, der durch die Hemmung der zweiten meiotischen Teilung in Ploidie Vervielfältigung führt. Allerdings Frühe Druckergebnisse in variablen Anteilen von Gen homozygosity 9,19, die seinen Wert als genetisches Werkzeug verringert. Neuere Studien zeigen, dass HS2, eine Modifikation des Standard HS-Protokoll, nämlich die Anwendung des Wärmeimpulses zu einer anderen Zeit während des ersten Zellzyklus (der 22-24MPF Zeitraum in HS2, im Vergleich zu 12-14 MPF in Standard-HS) ergibt sich bis zu 4 mal erhöhte Ausbeute an homozygot diploiden Produktionen.
Die Wirkung der Wärmeimpuls abgeleitet werden kann durch die Hemmung der centriole Duplizierung während der Zeit der Hitzeschock (22-24 MPF, während des ersten Zellzyklus) auftreten, was folglich die richtige Komplement fehlt eine Spindel zu erzeugen und zu vermitteln Zellteilung während der folgenden Zellzyklus (50-65 MPF, zu der zweiten Zellzyklus entspricht). Zentriol Duplikation kann während der nachfolgenden Zellzyklen in der Abwesenheit von Hitzeschock fortzusetzen, Entwicklung ermöglicht nach einer präzisen Einzelzellzyklus Stall zu gelangen. Da centriole Vervielfältigung und DNA - Replikationszyklen voneinander abhängig sind 20, geht die DNA - Replikation normalerweise auch während der ins Stocken geraten Division in der zweiten Zellzyklus. Daraus ergibt sich eine präzise ganze Genomduplikation und vollständige Homozygotie.
Zukünftige Anwendungen
21 erforderlich machen würde.
Ähnliche Ansätze HS2 kann auch auf andere Arten mit externen Befruchtung angewendet werden, auch die derzeit nicht als genetische Systeme verwendet werden. Diese Methodeinsbesondere nutzt einen bestimmten Zeitraum von der Befruchtung durch die Einleitung von Blastomere Radfahren, wo ein Wärmeimpuls centriole Vervielfältigung und erzeugen eine präzise Zellteilung Stall und ganze Genomduplikation ohne Herstellung von schädlichen Auswirkungen auf die Entwicklung auswirken können. Somit kann diese frühe Zeit für Hitzeschock-Empfindlichkeit untersucht werden Ploidie Manipulation basierten genetischen Methoden in anderen tierischen Systemen zu entwickeln.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S3264 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| MgSO4-7H2O | Sigma | 63138 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Tricaine | Western Chemical | Tricaine-D (MS 222) | FDA approved (ANADA 200-226) |
| Tris base | Sigma | 77-86-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| HCl | Sigma | 920-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| Fish net (fine mesh) (4-5 in) | PennPlax | (ThatFishThatPlace # 212370) | available in ThatFishThatPlace |
| Plastic spoon | available in most standard stores | ||
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissecting forceps | Dumont | SS | available from Fine Science Tools |
| Dissecting stereoscope (with transmitted light source) | Nikon | SMZ645 | or equivalent |
| Reflective light source (LED arms) | Fostec | KL1600 LED | or equivalent |
| Petri plates 10 cm diameter | any maker | ||
| Eppendorf tubes 1.5 ml | any maker | ||
| Ice bucket | any maker | ||
| Pipetteman P-1000 | any maker | ||
| Pipette tips 1,000 µl | any maker | ||
| Narrow spatula | Fisher | 14-374 | |
| Depression glass plate | Corning Inc | 722085 (Fisher cat. No 13-748B) | available from Fisher Scientific |
| UV lamp | UVP | Model XX-15 (cat No. UVP18006201) | available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting) |
| UV glasses | any maker | ||
| Paper towels | any maker | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666-11 | available from Fisher Scientific |
| Timer stop watch | any maker | ||
| Wash bottle | Thermo Scientific | 24020500 | available from Fisher Scientific |
| Tea strainer | available in kitchen stores | ||
| beakers, 250 ml (2) | Corning Inc. | 1000250 | available from Fisher Scientific |
| water bath (2) | any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series) | ||
| Hanks’ Solution 1 | see above | see above | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O. Store at 4°C. |
| Hanks’ Solution 2 | see above | see above | 0.358 g Anhydrous Na2HPO4, 0.6 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O. Store at 4 °C. |
| Hanks’ Solution 4 | see above | see above | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O. Store at 4 °C. |
| Hank's Premix | see above | see above | add, in the following order: 10.0 ml Solution 1; 1.0 ml Solution 2; 1.0 ml Solution 4; 86.0 ml ddH2O; 1.0 ml Solution 5. Store at 4 °C |
| Hanks’ Solution 6 | see above | see above | 0.33 g NaHCO3 in 10 ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure. |
| Hank's Solution (final solution) | see above | see above | Combine 990 μl of Hank’s Premix and 10 μl of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution) |
References
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