Summary
Un protocollo modificato per la manipolazione ploidia utilizza uno shock termico per indurre una stalla di un ciclo in cytokinesis in embrione precoce. Questo protocollo è illustrato nel zebrafish, ma può essere applicabile ad altre specie.
Abstract
Manipolazione di ploidia permette trasformazioni utili, come diploidi a tetraploidi, o aploidi a diploidi. Nella rerio Danio zebrafish, in particolare la generazione di diploidi gynogenetic omozigoti è utile in analisi genetica perché permette la produzione diretta di omozigoti da un'unica madre eterozigote. Questo articolo descrive un protocollo modificato per la duplicazione di ploidia base ad un impulso di calore durante il primo ciclo cellulare, Heat Shock 2 (HS2). Attraverso l'inibizione della duplicazione centriole, questo metodo si traduce in una precisa stalla divisione cellulare durante il secondo ciclo cellulare. La precisione di un ciclo di divisione stallo, accoppiato ad inalterato duplicazione del DNA, si traduce in tutta la duplicazione del genoma. Protocolli associati a questo metodo includono uovo e la raccolta dello sperma, il trattamento UV di sperma, la fecondazione in vitro e impulso di calore per provocare una sola cella di ritardo divisione del ciclo e la duplicazione di ploidia. potrebbe essere applicata una versione modificata di questo protocolloper indurre cambiamenti di ploidia in altre specie animali.
Introduction
Questo protocollo permette la manipolazione di ploidia in embrioni di zebrafish, come ad esempio la generazione di diploidi omozigoti gynogenetic da aploidi gynogenetic (Figura 1) o la produzione di tetraploidi. Questo risultato è ottenuto inducendo un ritardo nella citochinesi corrispondente precisamente a un ciclo cellulare (Figura 2A, 2B). La chiave di ritardo di un ciclo in citocinesi è ottenuta mediante trattamento con shock termico. Il protocollo standard di shock termico (HS) come originariamente descritto da Streisinger e colleghi coinvolto un impulso temperatura durante il periodo di 13-15 MPF, risultando in un unico ciclo di divisione cellulare stallo durante il primo ciclo cellulare 1. L'efficienza di questo protocollo è stato recentemente migliorato dalla scansione dei primi cicli cellulari con una finestra temporale scorrevole di trattamento shock termico. Questa scansione individuato un punto secondo momento per una scossa di calore, ancora all'interno del primo ciclo cellulare (22-24 MPF), che si traduce in un più alto tasso di embryo con un ciclo di divisione cellulare di stallo, che in questo caso riguarda il secondo ciclo cellulare 2. L'osservazione che le manipolazioni sperimentali durante il primo ciclo cellulare interferiscono con la divisione cellulare durante il secondo ciclo cellulare e provocano DNA duplicazione di contenuti è stata riportata anche in altre specie di pesci 3,4. Ci riferiamo a questo protocollo modificato come Heat Shock 2 (HS2 - il termine "2" indica che l'impulso di calore avviene in un punto temporale entro il metodo HS standard e che il ritardo del ciclo cellulare causata da HS2 si verifica durante il secondo ciclo cellulare ). Questi studi hanno dimostrato che la base di arresto citochinesi dopo shock termico è l'inibizione della duplicazione centriole durante l'impulso di calore, che influenza la formazione del fuso e induzione solco nella seguente ciclo cellulare. Risultati HS2 rendimenti di arresto del ciclo cellulare si avvicinano al 100%, e tassi di ploidia duplicazione fino a 4 volte superiore rispetto HS di serie 2.
ingegno embrioni trattatiha shock termico durante cella ciclismo blastomeri presentano molti effetti deleteri, suggerendo che shock termico colpisce di più processi necessari per la divisione cellulare 2. D'altra parte, se lo shock termico è applicato prima dell'inizio del ciclo cellulare (periodo 0-30 MPF), sembra avere effetti coerenti con interferenza specifico con duplicazione centriolo e non sembra influenzare altri processi cellulari essenziali 2 . Questi studi hanno dimostrato che il tempo prima dell'inizio della divisione blastomere sembra essere un periodo di sviluppo suscettibili di utilizzare shock termico come strumento per manipolare specificamente ploidia attraverso l'inibizione centriolo. La causa di fondo della selettività apparente per shock termico sulla duplicazione centriolo è sconosciuta, ma può essere correlato a una degradazione selettiva delle sottostrutture centrosoma osservati in condizioni di stress termico in alcuni tipi di cellule, come i leucociti 5.
la sincronizzazione temporale di embrionale deluppo è ottenuta tramite fecondazione in vitro (IVF). L'uso di sperma non trattata durante i risultati di fecondazione in embrioni diploide che al momento HS2 indotto un ciclo cytokinesis stallo diventare tetraploide. L'uso di sperma UV-trattati, che porta legami crociati che inattivano il suo DNA, risultati in embrioni aploidi gynogenetic 6, che su HSII indotto un ciclo cytokinesis stallo diventare diploidi gynogenetic 2. A causa del conseguente tutta la duplicazione del genoma, le diploidi gynogenetic ultime siano omozigoti ad ogni singolo locus in tutto il genoma. Per brevità, ci riferiamo a gynogenetic embrioni aploidi come "aploidi", e omozigoti embrioni diploidi gynogenetic come "diploidi omozigoti". Se vitale e fertile, diploidi omozigoti possono essere utilizzate per avviare le linee sterili e letali-libera. omozigosi diretta indotta da HS2 dovrebbe anche essere facilmente incorporato in analisi genetica o schermi genetici, dal momento che diploidi omozigoti dalle femmine che sono portatori eterozigoti di Mutzioni tariffe espositive di omozigosi a (50%) e alti rapporti fissi 2.
Il seguente protocollo descrive passaggi per eseguire HS2 e indurre la duplicazione ploidia con piena omozigosi. Per la produzione tetraploide, soluzione sperma dovrebbe essere trattata. Per la produzione diploide omozigote, lo sperma deve essere inattivato per il trattamento UV. Inoltre, come descritto nella discussione, marcatori pigmento visibili possono anche essere utilizzati per facilitare l'identificazione di diploidi omozigoti. Compagno di Zebrafish principalmente durante i primi 3 hr di inizio del loro ciclo di luce 7, e adulti e le uova sono sensibili ai ritmi circadiani 8, quindi per ottenere i migliori risultati della procedura di fecondazione in vitro dovrebbe avvenire entro questo periodo di tempo.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in base alla University of Wisconsin - Madison e Istituzionale cura degli animali e le linee guida Comitato Usa (IACUC) (University of Wisconsin - Madison numero Assurance A3368-01).
1. Selezione femmine per Raccolta Egg tramite accoppiamento interrotta
NOTA: i protocolli di fecondazione in vitro basati basano su l'estrusione di uova mature dalle femmine tramite pressione manuale 9. protocolli precedenti hanno usato le femmine direttamente dai carri armati o in coppia accoppiamenti senza le femmine in fase di comportamento rilascio di uova, ma solo una piccola parte di queste donne (circa il 20% o meno, a seconda della linea di pesce zebra) produrre uova indurito e competenti che la pressione manuale. In una procedura di miglioramento, le femmine sono pre-ordinati per la deposizione delle uova con l'osservazione visiva diretta, seguita da immediata interruzione di accoppiamento. Questa procedura è molto efficace, come quasi tutte le femmine pre-selezionati attraverso questo interrotto accoppiamento rendimento passo uova indurito e competentisu pressione manuale.
- Il pomeriggio prima dell'esperimento, istituito coppie di accoppiamento del ceppo zebrafish desiderato in scatole di accoppiamento zebrafish standard. Mantenere maschi nella stessa camera come femmine separati ancora fisicamente da loro, sia attraverso una divisione scatola di accoppiamento o mettendo il maschio in un inserto deposizione delle uova e la femmina all'interno dell'inserto.
- La mattina di questo esperimento, rimuovere la partizione fisica, ponendo sia il maschio e la femmina all'interno dello stesso inserto deposizione delle uova, così inizia che l'accoppiamento.
- Visivamente serbatoi contenenti coppie di accoppiamento per rilevare l'estrusione di uova durante l'accoppiamento naturale. Ai primi segni di estrusi a base di uova, separate per uomini e donne di interrompere la riproduzione. Dopo la separazione dai maschi, mantenere le femmine preselezionati separatamente o pool nello stesso serbatoio. Utilizzare più femmine a seconda del numero di embrioni desiderati (tipicamente 50-150 uova / femmina).
2. Preparazione di una soluzione di sperma
NOTA: IVF rElies sull'esposizione di uova mature per una soluzione di sperma. Questa soluzione può essere trattata, per generare zigoti diploidi (che in seguito al trattamento HS2 diventare embrioni tetraploide) o UV-trattati, per generare zigoti aploidi (che in seguito al trattamento HS2 diventano omozigoti embrioni diploidi). Precedente protocolli di preparazione degli spermatozoi hanno suggerito l'uso di tubi capillari per raccogliere milt dalla regione anale dei maschi dal vivo, ma questo era un processo inefficace come solo una piccola frazione dei maschi ha prodotto milt 9. Il protocollo presentato di seguito si basa invece sulla preparazione degli spermatozoi dai testicoli sezionati tranciate, che conduce a risultati più affidabili.
- Preparare la soluzione di Hank anticipo come soluzione per un periodo di un Hank, comprendente tutti i componenti (Solutions 1, 2, 4 e 5), tranne la soluzione di bicarbonato di sodio (soluzione 6). Preparare Soluzione 6 fresca e aggiungere alla premiscela mattino dell'esperimento (Tabella 1). Per rendere la soluzione Hanks '(soluzione finale, preparare la mattina delprocedura di fecondazione in vitro), unire 990 ul di Premix di Hank e 10 ml di appena fatto Soluzione 6.
- Eutanasia maschi da sovraesposizione al tricaine come soluzione 0,016% in acqua condizionata.
- Preparare tricaine come soluzione di riserva di 0,2% in acqua (tampone a pH 7.0 con 1M Tris pH 9,0) e conservare a 4 ° C. Aggiungere 8 ml di soluzione tricaine magazzino per 100 ml di acqua in un bicchiere, e utilizzare una rete per trasferire i maschi alla soluzione tricaine.
- Utilizzare l'equivalente di testicoli per un maschio per innesto doveva essere fecondato in un volume di soluzione di Hank corrispondente a 100 microlitri per maschio (es testicoli da 10 maschi raccolti in 1 ml di soluzione di Hank, concimare 10 innesti con 100 microlitri / frizione).
- Confermare l'eutanasia dalla cessazione dei movimenti branchie per 15 minuti. Dopo l'eutanasia, rimuovere i maschi dal bicchiere con un cucchiaio. Sciacquare i maschi brevemente con acqua condizionata e asciugarle delicatamente mettendo brevemente in diverse sedi di unatovagliolo di carta.
- Per rimuovere i testicoli, primi decapitare eutanasia maschi con le forbici dissezione o una lama di rasoio, e fare un taglio longitudinale lungo l'addome con dissezione scissors.Under un microscopio da dissezione con una sorgente di luce riflessa, rimuovere gli organi interni con dissettore. Estrarre ciascuna delle masse testicoli con una pinza e metterli dentro la provetta contenente la soluzione di Hank.
NOTA: Testes possono essere identificati come ciascuna delle due strutture allungate di aspetto traslucido trovati accanto alle pareti del corpo e che convergono vicino alla cloaca. Testicoli possono rimanere 2-3 minuti su una superficie della piastra di Petri dopo la dissezione e prima di metterli nella soluzione del Hank. - Rilasciare lo sperma nella soluzione per tranciatura testicoli con una spatola stretta e / o leggermente pipettando su e giù per 5-6 volte i testicoli in soluzione con una micropipetta 1.000 microlitri punta, evitando la formazione di bolle d'aria. Lasciare depositare il testicoli detriti.
- Conservare la soluzione sperma in ghiaccio, dove può mantenere la sua potenza fino a 2-3 ore. Se procedere al UV-trattamento della soluzione di sperma, trasferire la soluzione in una provetta pulita lasciando i pezzi di testicoli dietro.
3. Il trattamento UV
NOTA: trattamento UV è utilizzata per reticolare DNA degli spermatozoi in modo da renderla inattiva nell'embrione. Questo passo viene utilizzato solo per la produzione di embrioni gynogenetic diploide gynogenetic aploidi o omozigoti. soluzione di sperma per il trattamento UV deve essere separato da pezzi di testicoli (passo 2,4), come grandi pezzi possono proteggere lo sperma di trattamento UV.
- Trasferire la soluzione sperma di un pozzo asciutto e pulito di una lastra di vetro depressione seduto su un letto di ghiaccio (ad esempio ghiaccio all'interno di una piastra di Petri). Utilizzare un massimo di 1 ml di soluzione di spermatozoi per lastra di vetro pure.
- Esporre la soluzione sperma UV collocando la lastra di vetro depressione sul letto di ghiaccio sotto una lampada UV. Trattare la soluzione sperma per 90 sec con una 115 V (60 Hz, 0.68A) lampada UV ad un 19 cm (7,5 pollici) di distanza. Con la fine di un puntale, mescolare delicatamente la soluzione ogni 30 secondi durante il trattamento UV (utilizzare un puntale pulito ogni 30 sec).
- Usando una punta della pipetta pulita e micropipetta, trasferire la soluzione sperma trattato per una nuova provetta. Conservare in ghiaccio fino al momento della fecondazione in vitro (non più di 2-3 ore dall'estrazione).
4. Estrusione Manuale di uova mature
NOTA: Le femmine ottenuti dalla interruzione della accoppiamenti naturali si trasformano facilmente le uova sotto anestesia e pressione manuale. Durante questa procedura, il trattamento tricaine deve essere attentamente controllato per evitare la sovraesposizione che può impedire il recupero delle femmine.
- Anestetizzare le femmine di esposizione alla luce per soluzione tricaine: femmine di trasferimento con una rete di tricaine soluzione in acqua condizionata (fatta con l'aggiunta di 8 ml di 0,2% soluzione madre Tricaine a 100 ml di acqua pesci condizionata) per circa 2-5 minuti, fino alla fermata di pesce il movimento Gill. <li> Non appena una donna si ferma il movimento Gill, utilizzare un cucchiaio per raccogliere e sciacquare brevemente in acqua condizionata. Sempre con il cucchiaio per spostare il pesce, asciugarla delicatamente mettendo brevemente e ripetutamente su diverse località di un tovagliolo di carta, quindi trasferirla a secco 10 centimetri piatto pulito, del diametro di Petri. Approccio il pesce con il cucchiaio nella anteriori alla direzione posteriori, per evitare potenzialmente danneggiare l'opercolo branchiale.
- Utilizzare salviette di laboratorio o dei tessuti molli per asciugare delicatamente ulteriormente l'area pinna anale, per evitare le uova rilasciate da prematuramente essere attivato da acqua. Smorzare le dita leggermente con acqua (per evitare che si attacchino alle squame di pesce), mettere un dito di una mano sulla schiena del femminile come supporto, e con un dito dell'altra mano applica una leggera pressione lungo l'addome della femmina fino a quando le uova diventano estruso.
- Utilizzare una spatola stretta per spostare le uova dal corpo della femmina. Posizionare la femmina indietro in una vasca con acqua condizionata per il recupero.
- Attivare (con l'esposizione di acqua) e fertilizzare (con lo sperma soluzione aggiunta) uova simultaneamente ed entro 90 secondi dopo l'estrusione (vedi sezione 5).
5. fecondazione in vitro
NOTA: la fecondazione in Zebrafish incroci naturali è esterno, a seconda del rilascio simultaneo e l'attivazione da acqua di uova e sperma durante l'accoppiamento. In imita fecondazione in vitro questo processo esponendo le uova soluzione spermatozoi in presenza di acqua. Volume dell'acqua è originariamente piccola (1 ml) al fine di aumentare la concentrazione di spermatozoi efficace. Binding da parte dello spermatozoo si verifica entro 15-20 secondi 10 </ Sup>, e il volume d'acqua possono essere aumentati. Chorion sollevamento contribuisce ulteriormente alla stretta di sincronizzazione della frizione limitando la finestra per la competenza per l'associazione degli spermatozoi 11,12. Gli embrioni risultanti pertanto mostrano in gran parte simultanee cicli di divisione cellulare durante le fasi di scissione precoce.
- Aggiungere 100 ml di soluzione di spermatozoi (corrispondente alla equivalente di testicoli da un maschio - vedere parte 2) alla frizione delle uova estrusi su una piastra di petri. Agitare delicatamente la punta della pipetta utilizzata per aggiungere la soluzione di sperma tra le uova di mescolare lo sperma e le uova insieme, facendo attenzione a non sollevare la punta dalla superficie della piastra di Petri per evitare danni uova.
- Immediatamente attivare le uova con l'aggiunta di 1 ml di soluzione embrionale medio (E3) (acqua condizionata è anche accettabile come sostituto per l'E3 nelle parti da 5 a 7) e di nuovo mescolare delicatamente le uova e lo sperma agitando delicatamente con la punta della pipetta. Avviare un timer per avviare la tempistica relativa alla fecondazione. A 1 MPF nel volume 1 ml, inondare la piastra con E3. Prima di continuare, lasciare indisturbati fino 10-12 MPF per consentire l'attivazione delle uova, tra cui l'espansione completa chorion.
6. Trattamento shock termico
NOTA: Una scossa di calore applicata in embrione precoce inibisce centriolo la duplicazione, risultando in un complemento incompleta di centrioli per guidare la formazione del fuso durante il successivo ciclo cellulare 2. L'assenza di mandrino a sua volta provoca la mancanza di formazione solco 13.
- Dopo l'espansione dei chorions (10-12 MPF), versare gli embrioni dalla piastra di Petri in un colino da tè. Sciacquare la piastra di Petri con una bottiglia di lavaggio con E3 al fine di raccogliere eventuali rimanenti embrioni nel colino da tè.
- Posizionare il colino da tè con gli embrioni all'interno di un bicchiere in un bagno di pre-riscaldato con E3 a 28,5 ° C. Pre-equilibrare la coppa ed E3 per la temperatura del bagno d'acqua, e assicurarsi che ci sia abbastanza E3 in modo che tutti gli embrioni nel tèsetaccio sono esposti al mezzo.
- Al 22 MPF, rimuovere il colino da tè dal bagnomaria 28,5 ° C, per breve tempo macchia è su un tovagliolo di carta per rimuovere l'umidità in eccesso, e posizionarlo all'interno di un bicchiere E3 simile preriscaldato in un bagno di calore a 41,4 ° C.
- Al 24 MPF, trasferire il colino da tè di nuovo alla E3 nel bagno d'acqua a 28,5 ° C dopo una breve assorbente. Al 29 MPF, utilizzare una bottiglia di lavaggio con E3 per trasferire gli embrioni dal colino del tè di 10 cm Piatto Petri.
7. La selezione per gli embrioni con un One-ciclo Citochinesi Stall
- Durante il periodo di tempo 35-45 MPF, sotto un microscopio da dissezione con una fonte di luce trasmessa, selezionare quegli embrioni che sono in fase di scissione simmetrica nella fase 2-cellule, e che sono quindi fecondati. Rimuovere gli embrioni che non sono sottoposti a scissione delle cellule.
- Continua osservando gli embrioni fecondati, selezionati per la normale divisione cellulare durante il primo ciclo cellulare, e durante il secOND ciclo cellulare (50-65 MPF).
- Ordina gli embrioni in base alle seguenti categorie (Figura 2C): 4 celle ( "no stallo", in 2: Standard Disposizione 2 per un embrione di 4 celle); 3 celle ( "stallo parziale", in un aberranti 2 celle più piccole: 1 grande arrangiamento delle cellule); e 2 celle ( "stallo", embrioni esibendo un ritardo di un ciclo delle cellule in 1: 1 arrangiamento identica a quella di un embrione 2-cell). Ordinare gli embrioni in fase di stallo in un piatto fresco di Petri.
NOTA: In questa fase, gli embrioni in 2: disposizione 2 corrispondono a quelle in cui durante il secondo ciclo cellulare né blastomeri ha subito uno stallo divisione cellulare; embrioni in un aberrante 2 celle più piccole: 1 grande arrangiamento cellulare corrispondono a quelli in cui shock termico provocato uno stallo del ciclo cellulare durante il secondo ciclo cellulare in una blastomeri, ma non l'altro; ed embrioni "stallo" in 1: Disposizione 1 corrispondono a quelli in cui nel secondo ciclo cellulare sia blastomeri sottoposti la divisione cellulare desideratostalla. embrioni in fase di stallo dovrebbero riprendere la scissione delle cellule durante il periodo successivo ciclo cellulare (65-80 MPF). La disposizione di blastomeri può essere variabile, a causa dei segnali incomplete del ciclo cellulare precedente per stabilizzare il mandrino 2,14, ma la maggior parte embrioni formerà un blastula relativamente normale che può subire normale sviluppo. - Lasciare embrioni di sviluppare nella piastra di Petri, con un limite di 80 embrioni per 10 cm piatto. A 24 HPF, osservare gli embrioni per determinare se hanno una normale morfologia caratteristica di embrioni diploidi diploidi o omozigoti 6 (normale misura dell'estensione asse (Figura 3A, 3C)), a differenza di ridotta estensione dell'asse maggiore spessore del corpo caratteristico haploids (Figura 3B)), e / o valutare diploidization utilizzando marcatori genetici pigmento a 36 MPF, come oro o albino e altri tali dosaggi (Figura 3 e si veda sotto) 2,6,9. Rimuovere eventuali embrioni che sembrano avere una morfologia aploidi, o che hanno lisato o esporre altri difetti grossolanamente anormale.
NOTA: Se lo si desidera, consentire gli embrioni di sviluppare fino a 5 giorni dopo la fecondazione, pur continuando a rimuovere gli embrioni lisati o grossolanamente anomali su base giornaliera e l'aggiunta di fresco E3 per aggiornare la media. NOTA: Sopravvivere embrioni possono anche essere coltivate dopo che l'inflazione vescica natatoria il giorno 5 con il trasferimento ad un sistema d'incubazione e l'alimentazione in condizioni standard.
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Representative Results
Nonostante la unicellulare ciclo citochinesi stallo, la replicazione del DNA avviene normalmente in tali embrioni, causando la duplicazione del contenuto di DNA dell'embrione (Figura 1). Il protocollo Streisinger Heat Shock (standard HS) comporta un impulso di calore durante il periodo di 13-15 minuti dopo la fecondazione (MPF) e induce principalmente cytokinesis arresto nel corso della prima divisione cellulare embrionale a 35 MPF 1,2, mentre il metodo derivato qui descritto, denominato Heat Shock 2 (HS2), utilizza uno shock termico durante il periodo 22-24 MPF e induce arresto cytokinesis durante la seconda divisione cellulare embrionale a 50 MPF (figura 2; 2,3,4). A 24 HPF, osservazione degli embrioni permettono determinare se hanno una normale morfologia caratteristica di embrioni diploidi diploidi o omozigoti, o il corpo corta e più larga all'asse morfologia caratteristica di embrioni aploidi (Figura 3)
Figura 1: tipi di fecondazione. (A) di accoppiamento naturale. gameti maschili e femminili sono trattati, con un conseguente diploide naturale. (B) Lo sperma è trattata con UV, con conseguente distruzione del DNA paterno e la produzione di zigoti aploidi. Se non trattata, tali aploidi non sopravvivono giorno passato 2-3 dello sviluppo. (C) Trattamento di zigoti aploidi con Heat Shock 2 (HS2) inibisce un ciclo di cytokinesis della mitosi in embrione precoce. Questo ciclo cellulare stallo, coppied per la replicazione del DNA inalterato, genera diploidi omozigoti che possono diventare adulti vitali e fertili. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: HS2 promuove intero genoma duplicazione stallo il secondo ciclo cellulare. Pattern (A) cellule clivaggio di un embrione non trattato durante i primi tre cicli cellulari, corrispondente embrioni 2, 4, e 8 celle. (B) HS2 risultati del trattamento in una stalla un ciclo di divisione cellulare durante il secondo ciclo cellulare. Durante la stalla, in corso risultati sintesi del DNA in embrioni sottoposti a diploidization, sia da aploidi a diploide (n -> 2n) o diploide a tetraploide (2n -> 4n) (vedi testo). Dopo questo stallo, l'embrione riprende la divisione cellulare, con il nonWLY acquisito ploidia. (C) HS2-trattati gli embrioni possono presentare una varietà di disposizioni blastomero seconda che blastomeri mostrano un ritardo divisione cellulare durante il secondo ciclo cellulare: i) "no stallo": né mostre blastomero un ritardo, con conseguente un 2: 2 caratteristica disposizione di embrioni stadio di 4 cellule, ii) "stallo parziale": uno solo dei due blastomeri esibisce un ritardo, determinando un aberrant 2: 1 arrangiamento, e iii) "stallo": entrambi blastomeri presentano un ritardo, risultando in un 1: 1 caratteristica disposizione degli embrioni fase 2-cellule. In (A - C), nuclei sono rappresentati come cerchi blu, con l'evento diploidization rappresentato da una espansione della dimensione nucleare. Vedi riferimento 2 per un diagramma raffigurante comportamento centriolar come base proposto per lo stallo divisione cellulare. Clicca qui per visualizzare un Versi più grandisu questa figura.
Figura 3: Morfologia del diploidi naturali, aploidi e gynogenotes. (A) morfologia normale embrionale di un diploide ottenuto attraverso incroci naturali. (B) gli embrioni aploidi presentano un asse corpo più corto e più largo. (C) diploidi omozigoti hanno morfologia normale corpo. Gli embrioni inoltre trasportano una mutazione recessiva del gene d'oro pigmentazione per facilitare il monitoraggio dei genitori eredità DNA: le madri sono portatori omozigoti per una mutazione in oro, e padri wild-type per questo gene. Così, diploidi naturali, eterozigoti per oro, mostrano wild-type pigmentazione, mentre entrambi aploidi (emizigote per oro) e diploidi omozigoti (omozigoti per dorata) presentano pigmentazione mutante. Barra di scala = 0,5 mm. Pannelli modificati da reconferenza 2, ristampato con il permesso. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Soluzione | componenti | Condizioni di archiviazione |
| Hanks 'Soluzione 1 | 8,0 g di NaCl, e 0,4 g KCl in 100 ml DDH 2 O | Conservare a 4 ° C |
| Hanks 'Soluzione 2 | 0.358 g anidro Na 2 HPO 4, e 0,6 g KH 2 PO 4 in 100 ml DDH 2 O | Conservare a 4 ° C |
| Hanks 'Soluzione 4 | 0,72 g CaCl 2 in 50 ml DDH 2 O | Conservare a 4 ° C |
| Hanks 'Soluzione 5 | 1,23 g MgSO 4 ∙ 7H 2 O in 50 ml DDH 2 O | Conservare a 4 ° C |
| Premix di Hank | Aggiungere, nel seguente ordine: 10,0 ml Soluzione 1, 1,0 ml di soluzione 2, 1,0 ml di soluzione 4, 86.0 ml ddH2O, e 1,0 ml di soluzione 5 | Conservare a 4 ° C |
| Hanks 'Soluzione 6 | 0,33 g NaHCO 3 in 10 ml di DDH 2 O | Preparare fresco la mattina della procedura di fecondazione in vitro |
Tabella 1. Preparazione delle soluzioni di Hank.
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Discussion
passaggi critici
E 'fondamentale per lavorare in condizioni di effettivo fecondazione in vitro. Per assicurare una buona scorta di uova mature (step 1), le femmine impostati per l'accoppiamento non avrebbe dovuto essere istituito nel croci di accoppiamento per almeno 5 giorni e dovrebbe apparire gravide. Durante l'interruzione di allevamento, un osservatore può monitorare 15-30 carri armati in modo adeguato per la prima apparizione di estrusione uovo naturale. Interruzione di accoppiamento dovrà avvenire il prima possibile quando le prime uova vengono rilasciati attraverso accoppiamenti naturali, per consentire più uova di rimanere all'interno delle femmine per FIV. Queste femmine, che sono ora pronti per l'estrusione manuale di uova mature, possono essere tenuti separati per un massimo di 2 ore senza un apparente effetto sul successivo rilascio di uova. Per preparare una soluzione efficace sperma (fase 2), i maschi devono apparire solida e idealmente con una tinta rossastra, che è caratteristica di allevamento maschi zebrafish. Una dissezione pulito in genere comporta remoVing tratto intestinale tirandola verso il posteriore del corpo, e la vescica natatoria tirandolo anteriormente. Dopo la rimozione degli organi interni centrali, i testicoli rimangono masse allungate come traslucide accanto a ciascun lato della parete interna del corpo. Evitare di includere organi indesiderate (ad esempio intestino) nella soluzione di sperma; se necessario separare questi dalla testicoli, lavorando su una superficie della piastra di Petri asciutta prima di essere immessi nella soluzione del Hank. Per raggiungere elevati tassi di fertilizzazione durante la fecondazione in vitro (fase 4), è essenziale che le uova estrusi vengono mantenute fino competente aggiunta sperma. Uova competenti per la fecondazione mostra un tono un po 'di colore giallo e sono traslucidi. Evitare uova avere alcun contatto con l'acqua prima dell'aggiunta di sperma, in quanto l'acqua si innescherà attivazione uovo e l'attivazione precoce impedisca la fecondazione. attivazione acqua e fertilizzazione devono avvenire entro 90 secondi di estrusione dalla femmina per evitare la disidratazione di uova cheportare alla loro degradazione. Se necessario, le uova estruso possono essere conservati per lunghi periodi (fino a 1,5 ore o più) in 100-200 ml di soluzione di Hank integrato con 0,5% di sieroalbumina bovina (BSA) 17 (quando si prepara la soluzione di Hank per questo scopo specifico, preparare premiscela per correggere per contenuto di acqua aggiunta durante la supplementazione BSA). Se le uova sono state mantenute competente con l'aiuto della soluzione BSA di Hank, rimuovere BSA eccesso di Hank dalle uova utilizzando una micropipetta e fertilizzare entro 1 min.
Un passo fondamentale per il successo di diploidization utilizzando HS2 è l'ordinamento degli embrioni in fase di stallo (passo 7). cernita iniziale di scindere in modo simmetrico embrioni 2-cellule seleziona per gli embrioni che diventano fecondati e iniziano la divisione cellulare (dispermy occasionale durante risultati FIV in embrioni di transizione direttamente da 1 a 4 celle a 35-50 MPF - tali embrioni deve essere eliminata). Cellulare in bicicletta si verifica ogni 15 minuti durante questi primi st embrionalietà (35-50 MPF per il primo ciclo cellulare, 50-65 MPF per il secondo ciclo cellulare, e così via), così smistamento di scindere embrioni nei primi 10 minuti di ogni ciclo cellulare assicura l'assenza di sovrapposizione tra cicli e accurata identificazione di una stalla divisione cellulare.
Modifiche e risoluzione dei problemi
La forza del trattamento UV nel passaggio 3 (ad esempio il tempo di esposizione, potenza della lampada, distanza lampada) può essere regolata se necessario testando tassi di fertilizzazione iniziali così come la frequenza di aploidi in assenza di trattamento successivo HSII: la quantità corretta di esposizione ai raggi UV non ha un notevole effetto sui tassi di fertilizzazione, mentre con conseguente 100% degli embrioni aploidi (vedi Rappresentante dei risultati di distinguere aploidi da embrioni diploidi). esposizione ai raggi UV Troppa provoca una riduzione dei tassi di fecondazione, presumibilmente a causa di effetti deleteri sulla funzione degli spermatozoi, mentre l'esposizione ai raggi UV insufficiente produce embrioni diploidi causa to inattivazione incompleta del DNA dello sperma.
Se gli embrioni presentano difetti di sviluppo o letalità dopo la ripresa di scissione delle cellule (punto 7), la temperatura di shock termico al punto 6 può essere leggermente ridotta (ad esempio, per 41,0 ° C) per aumentare la sopravvivenza degli embrioni; condizioni che portano a approssimativamente uguali frazioni di aberranti a 3 celle e stallo embrioni 2-cellulare durante il secondo ciclo cellulare (e sono quindi in prossimità di soglia per un effetto sulla duplicazione centriolar) comporta minimi successivi difetti di sviluppo e un aumento della sopravvivenza dopo la ripresa del ciclo cellulare .
Il metodo HS2 incorpora un meccanismo di comodo e intrinseca per valutare la divisione cellulare stallo (e quindi tutta la duplicazione del genoma), dal momento che l'osservazione diretta degli embrioni come si sviluppano permette il monitoraggio dei vari cicli cellulari. Selezione manuale di embrioni che hanno subito uno stallo divisione ciclo unico cellulare permette di generare una popolazione omogenea di embrione diploidizedS. HS2 può essere effettuata in qualsiasi ceppo genetico zebrafish (es AB, Tübingen, WIK), gli atti unicellulare divisione stallo come un meccanismo intrinseco per confermare duplicazione del DNA. Inoltre, visibili marcatori genetici introdotti nel ceppo possono essere utilizzati per facilitare l'identificazione degli embrioni diploidized (Figura 3). Ad esempio, l'uso di uova da femmine che sono omozigoti per mutazioni recessive nei geni della pigmentazione, come oro o albino, può essere combinato con sperma derivato da ceppi wild-type trasportano alleli normali per lo stesso gene pigmentazione. In questa situazione, perché sperm UV-trattato non può contribuire wild-type alleli pigmento, gli embrioni diploidi aploidi e omozigoti presentano la mutazione recessiva pigment. Inoltre, diploidi omozigoti mostrano wild-type morfologia a 24 HPF, in netto contrasto con la morfologia aploidi meno estesa. La combinazione della comparsa del carattere recessivo materna e Embry generaleo morfologia conferma con successo la duplicazione ploidia. Un'ulteriore conferma può essere ottenuta tramite conteggi cromosomici di embrioni trattati e non trattati.
Il sistema di marcatura genetica sopra descritto, basato su recessivi marcatori genetici visibili, permette anche confermando l'assenza di DNA di sperma di derivazione nella progenie, poiché gli embrioni risultanti mostrano wild-type pigmentazione solo se spermatozoi non è stata completamente inattivato dal trattamento UV . In mancanza di un sistema di marcatura genetica, un campione di embrioni può essere permesso di svilupparsi in assenza di shock termico per confermare che tutti gli embrioni mostrano la morfologia aploide a 24 HPF, così che l'inattivazione sperma DNA era completa. In concomitanza con lo sperma completamente inattivati, questo stesso sistema di marcatura genetica consente di rilevare anche potenziale fallimento globulo polare spontanea. Un tale evento determinerebbe la comparsa di embrioni recessively contrassegnati con morfologia diploide senza un trattamento diploidization. bo polare spontaneafallimento dy non è stata osservata in zebrafish, ma è riportato in Xenopus tropicalis 18. Se presente in un dato sistema, questo evento spontaneo dovrebbe essere ridotta o controllata al fine di attuare in maniera ottimale manipolazione ploidia.
Limitazioni della tecnica
La capacità di produrre gynogenotes vitali si basa sull'assenza di sfondo varianti del gene che, quando omozigote sono deleteri. Così, il successo della procedura varierà a seconda del ceppo genetico utilizzato. Selezione di ceppi genetici attraverso più generazioni di gynogenesis ha dimostrato di migliorare la redditività 1.
Il metodo HS2, se usato in combinazione con sperma greggia produrre embrioni diploidi, consente anche la produzione di embrioni tetraploidi ad alta frequenza. Tuttavia, in questo caso, a causa della diploide alla trasformazione tetraploide, marcatori genetici non facilmente consentono la conferma di tutta genome la duplicazione. In questo caso, l'osservazione del ciclo di stallo una cella negli embrioni sincronizzati e la selezione degli embrioni in fase di stallo dovrebbero assicurare selezione tetraploide, e conta cromosomiche possono essere utilizzati per confermare ulteriormente ploidia.
Rilevanza rispetto ai metodi esistenti / alternativi
Sebbene descritto da Streisinger oltre 40 anni fa 1, il metodo standard di HS non è stato ampiamente utilizzato a causa di bassa resa. Invece, manipolazione ploidia è affidata quasi esclusivamente sul metodo alternativo e relativamente più efficiente di pressione iniziale, che si traduce in una duplicazione ploidia attraverso l'inibizione della seconda divisione meiotica. Tuttavia, i risultati pressione iniziale in proporzioni variabili del gene omozigosi 9,19, che diminuisce il suo valore come strumento di genetica. Recenti studi dimostrano che HS2, una modifica del protocollo HS standard ossia l'applicazione dell'impulso di calore in un momento diverso durante il primo ciclo cellulare (il 22-24periodo di MPF in HS2, rispetto al 12-14 MPF in HS standard) si traduce in un massimo di 4 volte maggiore resa delle produzioni diploidi omozigoti.
L'azione dell'impulso calore può essere dedotta verificarsi in virtù della inibizione della duplicazione centriole durante il periodo di shock termico (22-24 MPF, durante il primo ciclo cellulare), che manca di conseguenza il corretto complemento per generare un mandrino e mediare divisione cellulare durante il successivo ciclo cellulare (50-65 MPF, corrispondente al secondo ciclo cellulare). duplicazione centriolo può riprendere in assenza di shock termico durante i successivi cicli cellulari, consentendo lo sviluppo di procedere dopo un preciso ciclo di stallo unicellulare. Perché duplicazione centriolo e replicazione del DNA cicli sono interdipendenti 20, la replicazione del DNA avviene normalmente, anche durante la divisione in fase di stallo nel secondo ciclo cellulare. Ciò si traduce in precisione tutta la duplicazione del genoma e completo omozigosi.
Le future applicazioni
21.
Approcci simili a HS2 può essere applicato ad altre specie con fecondazione esterna, anche quelli non attualmente in uso come sistemi genetici. Questo metodoin particolare si avvale di un periodo di tempo dalla fecondazione attraverso l'avvio di blastomeri ciclismo, dove un impulso di calore può influenzare la duplicazione centriolo e generare una precisa stallo divisione cellulare e tutta la duplicazione del genoma senza produrre effetti sullo sviluppo deleteri. Quindi, questo periodo di tempo in anticipo può essere esplorata per il calore sensibilità shock per sviluppare metodi genetici di manipolazione a base di ploidia in altri sistemi animali.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S3264 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| MgSO4-7H2O | Sigma | 63138 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Tricaine | Western Chemical | Tricaine-D (MS 222) | FDA approved (ANADA 200-226) |
| Tris base | Sigma | 77-86-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| HCl | Sigma | 920-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| Fish net (fine mesh) (4-5 in) | PennPlax | (ThatFishThatPlace # 212370) | available in ThatFishThatPlace |
| Plastic spoon | available in most standard stores | ||
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissecting forceps | Dumont | SS | available from Fine Science Tools |
| Dissecting stereoscope (with transmitted light source) | Nikon | SMZ645 | or equivalent |
| Reflective light source (LED arms) | Fostec | KL1600 LED | or equivalent |
| Petri plates 10 cm diameter | any maker | ||
| Eppendorf tubes 1.5 ml | any maker | ||
| Ice bucket | any maker | ||
| Pipetteman P-1000 | any maker | ||
| Pipette tips 1,000 µl | any maker | ||
| Narrow spatula | Fisher | 14-374 | |
| Depression glass plate | Corning Inc | 722085 (Fisher cat. No 13-748B) | available from Fisher Scientific |
| UV lamp | UVP | Model XX-15 (cat No. UVP18006201) | available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting) |
| UV glasses | any maker | ||
| Paper towels | any maker | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666-11 | available from Fisher Scientific |
| Timer stop watch | any maker | ||
| Wash bottle | Thermo Scientific | 24020500 | available from Fisher Scientific |
| Tea strainer | available in kitchen stores | ||
| beakers, 250 ml (2) | Corning Inc. | 1000250 | available from Fisher Scientific |
| water bath (2) | any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series) | ||
| Hanks’ Solution 1 | see above | see above | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O. Store at 4°C. |
| Hanks’ Solution 2 | see above | see above | 0.358 g Anhydrous Na2HPO4, 0.6 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O. Store at 4 °C. |
| Hanks’ Solution 4 | see above | see above | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O. Store at 4 °C. |
| Hank's Premix | see above | see above | add, in the following order: 10.0 ml Solution 1; 1.0 ml Solution 2; 1.0 ml Solution 4; 86.0 ml ddH2O; 1.0 ml Solution 5. Store at 4 °C |
| Hanks’ Solution 6 | see above | see above | 0.33 g NaHCO3 in 10 ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure. |
| Hank's Solution (final solution) | see above | see above | Combine 990 μl of Hank’s Premix and 10 μl of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution) |
References
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