Ploidiundersøkelse Manipulering av Sebrafisk embryoer med Heat Shock 2 Treatment

Summary

En modifisert protokoll for ploiditet manipulering benytter et varmesjokk for å indusere en en-syklus stall i cytokinese i tidlig embryo. Denne protokollen er demonstrert i sebrafisk, men kan være aktuelt for andre arter.

Abstract

Manipulering av ploidiresultat tillater nyttige transformasjoner, som diploider til tetraploids eller haploids til diploider. I sebrafisk Danio rerio, spesielt generering av homozygote gynogenetic diploider er nyttig i genetisk analyse, fordi den tillater direkte produksjon av homozygote fra en enkelt heterozygot mor. Denne artikkelen beskriver en modifisert protokoll for ploiditet duplisering basert på en varmepuls i løpet av den første cellesyklus, Heat Shock 2 (HS2). Gjennom hemming av centriole duplisering, resulterer denne fremgangsmåte i en nøyaktig celledeling stall i løpet av den andre cellesyklus. Den nøyaktige en syklus divisjon stall, koblet til upåvirket DNA-kopiering, resulterer i hele genomet duplisering. Protokollene som er forbundet med denne metoden inkluderer egg og sperm samling, UV-behandling av sæd in vitro fertilisering og varmepuls for å bevirke en en-cellesyklus divisjon forsinkelse og ploiditet duplisering. En modifisert versjon av denne protokollen kan bli bruktå indusere ploidinummer endringer i andre dyrearter.

Introduction

Denne protokollen tillater manipulering av ploiditeten i sebrafisk embryoer, for eksempel ved generering av homozygote gynogenetic diploider fra gynogenetic haploids (figur 1) eller produksjonen av tetraploids. Dette oppnås ved å fremkalle en forsinkelse i cytokinese svarende til nøyaktig en cellesyklus (figur 2A, 2B). Nøkkelen en syklus forsinkelse i cytokinese oppnås ved behandling med varmesjokk. Den standard protokoll fra Heat Shock (HS) som opprinnelig beskrevet av Streisinger og kolleger involverte en temperatur puls i perioden 13-15 MPF, noe som resulterer i en en-syklus celledeling stall i løpet av den første cellesyklusen ^1. Effektiviteten av denne protokollen har nylig blitt forbedret ved å skanne de tidlige cellesykluser med en glidende tidsmessig vindu av varmesjokkbehandling. Denne skanningen identifisert et senere tidspunkt for et varmesjokk, fremdeles innenfor den første cellesyklusen (22-24 MPF), som resulterer i en høyere rate av embryos med en en-syklus celledeling stall, som i dette tilfelle virker den andre cellesyklus ^2. Den observasjon at eksperimentelle manipulasjoner i løpet av den første cellesyklusen påvirke celledeling under den andre cellesyklusen og forårsaker DNA-innhold duplisering er også blitt rapportert i andre fiskearter ^3,4. Vi viser til denne modifiserte protokollen som Heat Shock 2 (HS2 - begrepet "2" viser at varmepulsen opptrer på et senere tidspunkt enn standard HS-metoden, og at cellesyklus forsinkelsen forårsaket av HS2 skjer i løpet av andre cellesyklus ). Disse studiene viste at grunnlaget for cytokinese rest etter varmesjokk er inhiberingen av centriole duplisering under varmepulsen, noe som påvirker spindeldannelse og fure induksjon i følgende cellesyklusen. HS2 resultater i avkastning av cellesyklus arrest nærmer seg 100%, og priser av ploidiresultat duplisering opptil 4 ganger høyere enn standard HS ^2.

Embryoet behandlet viddha varme sjokk under blastomere celle sykling utviser mange skadelige effekter, noe som tyder på at varmesjokk påvirker flere prosesser som kreves for celledeling ^to. På den annen side, hvis det varmesjokk blir påført før initiering av celle sykling (tidsperiode 0-30 MPF), ser det ut til å ha effekt i samsvar med spesifikk interferens med centriole duplisering og synes ikke å påvirke andre viktige celleprosesser ² . Disse studiene viste at tiden før initiering av blastomere divisjon ser ut til å være en utviklingsperiode mottagelig for hjelp Heat Shock som et verktøy for å spesifikt manipulere ploiditeten gjennom centriole hemming. Den underliggende årsaken til den tilsynelatende selektivitet for varme sjokk på centriole duplisering er ukjent, men kan være relatert til en selektiv nedbrytning av sentrosomen understell observert under varmestress i visse celletyper, for eksempel leukocytter ^5.

Temporal synkronisering av embryonale deling oppnås ved in vitro fertilisering (IVF). Bruk av ubehandlet sperm under befruktning resultater i diploide embryoer at ved HS2-indusert en syklus cytokinese stall blir tetraploid. Bruk av UV-behandlet sperm, som bærer tverrbindinger som inaktiverer sitt DNA, resulterer i gynogenetic haploide embryo ^6, som ved HSII-indusert en syklus cytokinese stall blitt gynogenetic diploider ^2. På grunn av den resulterende hele genomet duplisering, de sistnevnte gynogenetic diploidene er homozygote på hver enkelt locus på tvers av genomet. For knapphet, henviser vi til gynogenetic haploide embryoer som "haploids", og homozygot gynogenetic diploide embryoer som "homozygot diploider". Dersom levedyktig og fruktbar, kan homozygot diploider brukes til å initiere sterile og dødelige frie linjer. Direkte homozygositet indusert ved HS2 bør også lett inkorporeres i genetisk analyse eller genetiske skjermer, ettersom homozygot diploider fra hunner som er heterozygote bærere av mutasjon utstillingen priser av homozygosity ved høye og faste (50%) forholdstall ^2.

Følgende protokoll beskriver trinn for å utføre HS2 og induserer ploiditet duplisering med full homozygosity. For tetraploid produksjon, bør sperm løsningen være ubehandlet. For homozygot diploid produksjon, bør sperm inaktiveres ved UV-behandling. I tillegg, som beskrevet i diskusjonen, synlige pigment markører kan også benyttes for å lette identifikasjon av homozygote diploider. Sebrafisk kompis primært i løpet av første 3 timer fra oppstart av sitt lys syklus ^7, og både voksne og egg er følsomme for døgnrytme ^8, så for best resultat IVF prosedyren skal skje innen denne tidsperioden.

Protocol

Alle dyreforsøk ble gjennomført i henhold til University of Wisconsin - Madison and Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) retningslinjer (University of Wisconsin - Madison Assurance nummer A3368-01).

1. Velge Kvinner for Egg Collection via Interrupted Mating

MERK: IVF-baserte protokoller stole på ekstrudering av modne egg fra kvinner gjennom manuelt trykk ^9. Tidligere protokoller har brukt hunner direkte fra tanker eller i par parringer uten hunnene som gjennomgår egg utgivelsen oppførsel, men bare en liten brøkdel av disse kvinner (ca 20% eller mindre, avhengig av sebrafisk linje) gir ekstruderte og kompetente egg på manuelt trykk. I en forbedret fremgangsmåte, hunner er forhåndssortert for egglegging ved direkte visuell observasjon, etterfulgt av umiddelbar avbrytelse av parring. Denne fremgangsmåten er meget effektiv, da nesten alle hunner forhåndsvalgt gjennom denne avbrutte parr trinn-utbytte ekstruderte og vedkommende eggved manuelt trykk.

1. Ettermiddagen før forsøket, satt opp parring par ønsket sebrafisk belastning i standard sebrafisk parring bokser. Hold hanner i samme kammer som kvinner ennå fysisk atskilt fra dem, enten gjennom en parring boks divisjon eller ved å plassere den mannlige under en egg-legging innsatsen og kvinnelige inne innsatsen.
2. Morgenen av forsøket, fjerne den fysiske partisjonen, plassere både mannlige og kvinnelige innenfor samme eggleggingen innsats, slik at parring begynner.
3. Inspiser visuelt tanker som inneholder paring par for å oppdage ekstrudering av egg i løpet av naturlig paring. Ved første tegn på egg profiler, separate mannlige og kvinnelige å avbryte avl. Etter separasjon fra menn, holder de forhåndsvalgte kvinner enten separat eller sammenslåtte i samme tank. Bruk flere hunner avhengig av antall embryoer ønskede (typisk 50-150 egg / kvinne).

2. Forbereder en Sperm Solution

MERK: IVF rElies på eksponering av modne egg til en sperm løsning. Denne løsningen kan være ubehandlet, for å generere diploide zygotes (som ved HS2 behandling blir tetraploide embryoer) eller UV-behandles, for å generere haploide zygotes (som ved HS2 behandling blir homozygote diploide embryoer). Tidligere sperm forberedelse protokoller foreslått bruk av kapillærrør å samle melke fra anal regionen av levende menn, men dette var en ineffektiv prosess som bare en liten brøkdel av menn ga melke ^9. Protokollen som presenteres nedenfor er avhengig stedet på sperm forberedelse fra skåret dissekert testiklene, noe som gir mer pålitelige resultater.

1. Fremstille Hanks oppløsning på forhånd som en forblanding Hanks oppløsning, som består av alle komponentene (Solutions 1, 2, 4 og 5) med unntak av natriumbikarbonat-oppløsning (oppløsning 6). Forbered Løsning 6 friske og legger til premix morgenen av forsøket (tabell 1). For å gjøre Hanks 'løsning (endelig løsning, forberede morgenen avIVF prosedyre), kombinere 990 ul av Hanks Premiks og 10 mL av rykende Løsning 6.
2. Avlive hanner av overeksponering til Tricaine som en 0,016% løsning i kondisjonerte vann.
   1. Forbered Tricaine som en 0,2% stamløsning i vann (buffer til pH 7,0 med 1 M Tris pH 9,0) og holde ved 4 ° C. Tilsett 8 ml Tricaine stamløsning pr 100 ml vann i et begerglass, og bruke et nett for å overføre hanner til Tricaine løsning.
   2. Bruk det tilsvarende av prøvene for en mann pr clutch som trengs for å bli befruktet i et volum av Hanks oppløsning svarende til 100 pl pr hann (f.eks testikler fra 10 menn som er samlet i 1 ml Hanks oppløsning, for å gjødsle 10 clutcher med 100 ul / clutch).
   3. Bekreft aktiv dødshjelp ved opphør av gjelle bevegelser i 15 minutter. Etter dødshjelp, fjerne hannene fra begeret med en skje. Skyll hannene kort med kondisjonert vann og tørk dem lett ved å plassere dem kort på flere steder av entørkepapir.
3. For å fjerne testiklene, først halshogge avlives menn bruker dissekere saks eller et barberblad, og lag et langsgående snitt langs buken med dissekere scissors.Under en dissekere mikroskop med en reflektert lyskilde, fjerne indre organer med dissekere tang. Trekk ut hver av testiklene massene med pinsett og plassere dem inne i mikro røret som inneholder Hanks oppløsning.
   MERK: Testikler kan identifiseres som hver av to langstrakte strukturer av gjennomsiktig utseende funnet langs kroppen vegger og som konvergerer nær Cloaca. Testes kan bo 2-3 min på en petriskål overflaten etter disseksjon og før du legger dem i Hanks oppløsning.
4. Slipp sperm inn i løsningen ved klipping testiklene med en smal slikkepott og / eller forsiktig pipettering opp og ned 5-6 ganger testiklene i løsning med en 1000 mL-tip mikropipette, og samtidig unngå luftbobledannelse. La testiklene rusk bosette.
5. Oppbevar sperm oppløsningen i is, hvor det kan beholde sin styrke i opp til 2-3 timer. Hvis du fortsetter å UV-behandling av sæd løsning, overføre løsningen i en ren mikrosentrifugerør forlater biter av testiklene bak.

3. UV Behandling

MERK: UV-behandling anvendes for å kryssbinde sperm-DNA for å gjengi den inaktive i embryo. Dette trinnet er bare brukes ved produksjon gynogenetic haploide eller homozygot gynogenetic diploide embryoer. Sperm løsning for UV-behandling bør skilles fra deler av testiklene (trinn 2.4), som store stykker kan skjerme sperm fra UV-behandling.

1. Overfør sperm løsning på en ren, tørr brønn i en depresjon glass plate sitter på en is seng (f.eks is inne i en petriskål). Bruk opptil 1 ml av sperm løsning per glass plate også.
2. Expose sperm løsning for UV ved å plassere depresjon glassplaten på isen seng under en UV-lampe. Behandle sperm løsning i 90 sekunder med en 115 V (60 Hz, 0.68A) UV-lampe på en 19 cm (7,5 inches) avstand. Med enden av en pipettespiss, forsiktig blande løsningen hvert 30. sekund under UV-behandling (bruke en ren pipettespiss hvert 30 sek).
3. Ved hjelp av en ren pipettespiss og mikropipette, overføre den behandlede sperm løsning i et nytt mikrosentrifugerør. Oppbevar på is inntil nødvendig for IVF (ikke lenger enn 2-3 timer fra utvinning).

4. Manuell Ekstrudering av modne egg

MERK: Kvinner som oppnås ved avbrudd av naturlige parringer vil lett gi egg under narkose og manuelt trykk. Under denne prosedyren, bør Tricaine behandling kontrolleres nøye for å unngå overeksponering som kan hindre gjenvinning av hunnene.

1. Anesthetize hunner av lyseksponering til Tricaine løsning: overføring kvinner med et nett for å Tricaine løsning i kondisjonert vann (laget ved å tilsette 8 ml Tricaine 0,2% stamløsning til 100 ml klimaanlegg fisk vann) i ca 2-5 min, før fisken stopper gill bevegelse.
<li> Så snart en kvinne stopper gill bevegelse, bruk en skje til å samle det og kort skyll den i kondisjonert vann. Likevel bruker skjeen til å flytte fisken, tørk den lett ved å plassere det kort og gjentatte ganger på flere steder av et papirhåndkle, og deretter overføre det til en ren, tørr 10 cm diameter petriskål. Approach fisken med skjeen i fremre til bakre retning, for å unngå potensielt skadelige gjelle operculum.
2. Bruk lab våtservietter eller mykt vev å tørke gattfinnen området forsiktig videre, for å forhindre eventuelle utgitt egg fra tidlig blir aktivert av vann. Dempe fingrene lett med vann (for å unngå dem stikke til fiskeskjell), setter en finger på en hånd på kvinnens tilbake som støtte, og med en finger på den andre hånden legge litt press langs kvinnens underliv før eggene blir ekstrudert.
3. Bruk en smal spatel for å bevege eggene bort fra kvinnens kropp. Plasser den kvinnelige tilbake inn i en tank med kondisjonert vann for utvinning.
   
4. Aktiver (med vann eksponering) og gjødsle (med sperm løsning tillegg) egg samtidig og innen 90 sekunder etter ekstrudering (se kapittel 5).

5. I Vitro befruktning

MERK: Sebrafisk befruktning i naturlige kors er ekstern, avhengig av samtidige lanseringen og aktivering av vann av egg og sperm under parring. In vitro fertilisering ligner denne prosessen ved å utsette eggene til sæd oppløsning i nærvær av vann. Vannmengden er opprinnelig liten (1 ml) for å øke den effektive spermiekonsentrasjon. Binding av sæd skjer innen 15-20 sek ^{10 <}/ Sup>, og vannmengde kan deretter økes. Chorion løfte ytterligere bidrar til tett synkronisering av clutch ved å begrense vinduet for kompetanse for sperm bindende ^11,12. De resulterende embryoene utviser derfor i stor grad samtidige celledeling sykluser i de tidlige cleavage stadier.

1. Tilsett 100 ul av sperm-løsning (tilsvarende til det som tilsvarer testiklene fra en mannlig - se del 2) til koplingen av ekstruderte egg på en petriskål. Forsiktig virvel pipettespissen brukes til å legge sperm løsning mellom de egg for å blande sperm og egg sammen, være sikker på å ikke løfte tips fra overflaten av petriskål for å unngå egg skade.
2. Umiddelbart aktivere eggene ved å tilsette 1 ml av embryonale medium (E3) løsning (betinget vann er også akseptabelt som en erstatning for E3 i del 5 til 7) og igjen forsiktig blande egg og sædceller ved å forsiktig virvling med pipettespissen. Start en tidtaker for å starte timing i forhold til befruktning. På en MPF ​​i en ml volum, oversvømme plate med E3. Før du fortsetter, la uforstyrret inntil 10-12 MPF å tillate egg aktivisering, inkludert full chorion ekspansjon.

6. Heat Shock Treatment

MERK: En varmesjokk brukes i tidlig embryo hemmer centriole dobbeltarbeid, noe som resulterer i en ufullstendig bemanning av Sentrioler å kjøre spindel formasjon under den påfølgende cellesyklus ^2. Fraværet av spindelen igjen resulterer i manglende fure formasjon ^13.

1. Etter utvidelsen av chorions (10-12 MPF), hell embryoene fra petriskål til en te sil. Skyll petri plate ved hjelp av en vaskeflaske med E3 for å samle eventuelle gjenværende embryoer i te sil.
2. Plasser te sil med embryoene inne et beger i en forvarmet bad med E3 ved 28,5 ° C. Pre-likevekt begeret og E3 til vannbad temperatur, og sørge for at det er nok E3 slik at alle fostre i tesil er utsatt for mediet.
3. På 22 MPF, fjerne te sil fra 28,5 ° C vannbad, kort utslette den på et papir håndkle for å fjerne overflødig fuktighet, og plassere den i en tilsvarende forvarmet E3 beger i en varme bad ved 41,4 ° C.
4. Ved 24 MPF, overføre tesil tilbake til E3 i vannbad ved 28,5 ° C etter kort blotting. På 29 MPF, bruke en vaskeflaske med E3 å overføre embryoene fra te sil til en 10 cm Petri plate.

7. Utvalg for embryoer med en One-syklus cytokinese Stall

1. I løpet av tidsperioden 35-45 MPF, under et disseksjonsmikroskop med et gjennomfallende lys kilde, velge ut de embryoer som er under spalting symmetrisk i 2-cellestadiet, og som derfor er befruktet. Fjern embryoer som ikke gjennomgår celle cleavage.
2. Fortsett å observere befruktede embryoer, valgt for normal celledeling i løpet av den første cellen syklus, og i løpet av sekunderond cellesyklusen (50-65 MPF).
3. Sorter embryoer i henhold til følgende kategorier (figur 2C): 4-celler ( "no stall", i to: 2 ordning standard for 4-celle embryo); 3 celler ( "delvis stall", i en avvikende 2 mindre celler: en stor celle arrangement); og 2-celler ( "stoppet", embryoer som oppviser en en-cellesyklus forsinkelse i et 1: 1 arrangement identisk med den for en 2-celle embryo). Sortere de fastlåste embryo i en fersk petriskål.
   MERK: På dette stadiet, embryoer i 2: 2 ordning samsvarer med de der i løpet av andre cellesyklusen verken blastomere gikk en celledeling stall; embryo i en avvikende 2 mindre celler: en stor celle arrangement svarer til de hvor varmesjokk forårsaket en cellesyklus stall i løpet av den andre cellesyklus i en blastomere men ikke den andre; og embryoer "stoppet" i et 1: 1 arrangement svarer til de hvor det i den andre cellesyklus begge blastomeres gjennomgikk den ønskede celledelingenstall. Stall embryo skal gjenopptas celle cleavage under følgende cellesyklusen periode (65-80 MPF). Arrangementet av blastomeres kan være variabel, på grunn av den ufullstendige signaler fra den foregående cellesyklus for å stabilisere spindelen ^2,14, men de fleste embryoer vil danne en forholdsvis normal blastula som kan gjennomgå normal utvikling.
4. Tillat embryoer å utvikle seg i Petri plate, med en grense på 80 embryoer per 10 cm plate. På 24 HPF, observere embryoene å avgjøre om de har en normal morfologi karakteristisk for diploide eller homozygot diploide embryoer ⁶ (normal grad av aksen forlengelse (figur 3A, 3C)), i motsetning til redusert akse forlengelse og økt kropps tykkelse karakteristisk for haploids (figur 3B)), og / eller vurdere diploidisering ved hjelp av genetiske markører pigment ved 36 MPF, slik som gull eller albino og andre slike analyser (figur 3 og se nedenfor) ^2,6,9. Fjern eventuelle embryo som synes å ha en haploid morfologi, eller som har lysert eller vise andre grovt unormale defekter.
   MERK: Hvis du vil, la embryo for å utvikle inntil 5 dager etter befruktning, mens du fortsetter å fjerne lysert eller grovt unormale embryoer på daglig basis, og legger frisk E3 for å oppdatere medium. MERK: Overlevende embryoer kan også dyrkes etter swimbladder inflasjon på dag 5 ved å overføre til et klekkeri system og fôring under standardbetingelser.

Representative Results

På tross av en cellesyklus cytokinese stall, DNA-replikasjon forekommer normalt i slike embryo, noe som resulterer i duplisering av DNA-innhold av embryoet (figur 1). Den Streisinger Heat Shock-protokollen (standard HS) innebærer en varmepuls i perioden 13-15 minutter etter befruktning (MPF) og induserer hovedsakelig cytokinese arrest i løpet av første embryonale celledelingen på 35 MPF ^1,2, mens utledet metoden beskrevet her, referert til som Heat Shock 2 (HS2), bruker en varmesjokk i perioden 22-24 MPF og induserer cytokinese arrest i løpet av andre embryonale celledelingen på 50 MPF (figur 2, ^2,3,4). Ved 24 HPF, observasjon av embryoene tillate å bestemme om de har en normal morfologi som er karakteristisk for diploide eller homozygote diploide embryoer, eller den kortere og bredere legeme akse morfologi som er karakteristisk for haploide embryoer (figur 3) 2. Utvalg av linjer ved forplantning gjennom gynogenetic fremgangsmåter har vist seg å øke utbyttet av homozygot diploid produksjon ^1. Bekreftelse av den nøyaktige hele genomet duplisering ventet fra inhibering av en mitotisk syklus kan oppnås ved kromosomtellinger ^2,3,4,15 eller kvantifisering av atomdiameter ^3,4. Normal utvikling i sebrafisk som andre dyr er meget følsomme for kromosomantall feil ^16, og den observasjon at homozygote diploider blir viable og frukt voksne ^1,2,9 gir ytterligere bevis for vellykket diploidisering. Ploidiundersøkelse i sebrafisk embryo kan også vurderes ved hjelp av molekylære metoder som fluorescerende in situ hybridisering (FISH) av kjernefysisk genet teller og fluorescerende-aktivert celle sortering (FACS) å kvantifisere DNA innhold ^16.

Figur 1: Befruktning typer. (A) Natural parring. Mannlige og kvinnelige kjønnsceller er ubehandlet, noe som resulterer i en naturlig diploid. (B) Sperm behandles med UV, noe som resulterer i ødeleggelsen av fars DNA og fremstilling av haploide zygoter. Hvis ubehandlet, ikke slike haploids ikke overleve siste dag 2-3 av utvikling. (C) Behandling av haploide zygotes med Heat Shock 2 (HS2) hemmer en syklus av cytokinese av mitose i tidlig embryo. Denne cellesyklusen stall, pard til upåvirket DNA replikasjon, genererer homozygot diploider som kan bli levedyktige og frukt voksne. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: HS2 fremmer hele genomet duplisering av stal andre cellesyklusen. (A) Celle spalting mønster av en ubehandlet embryo i løpet av de første tre cellesykluser, tilsvarende 2-, 4- og 8-celle-embryoer. (B) HS2 behandling resulterer i en en-syklus stall av celledeling i den andre cellesyklus. Under stall, pågående DNA syntese resultater i embryoer under diploidisering, enten fra haploid til diploid (n -> 2n) eller diploid til tetraploid (2n -> 4n) (se tekst). Etter dette stall, fortsetter embryo celledeling, med neWLY ervervet ploidiresultat. (C) HS2-behandlede embryoer kan oppvise en rekke blastomere arrangementer, avhengig hvorvidt blastomeres oppviser en celledeling forsinkelse i løpet av den andre cellesyklusen: i) "no stall": verken blastomere oppviser en forsinkelse, noe som resulterer i et 2: 2-ordning er karakteristisk for 4-celle-trinns embryoer, ii) "delvis stall": bare en av to blastomeres oppviser en forsinkelse, noe som resulterer i en avvikende 2: 1 arrangement, og iii) "stoppet": begge blastomeres oppvise en forsinkelse, noe som resulterer i et 1: 1 ordning er karakteristisk for to-celle-trinns embryoer. I (A - C), er kjerner representert som blå sirkler, med den diploidisering arrangementet representert ved en utvidelse av kjernefysisk størrelse. Se referanse ² for et diagram som viser centriolar atferd som foreslått grunnlaget for celledeling stall. Klikk her for å se et større Versipå denne figuren.

Figur 3: Morfologi av naturlige diploider, haploids og gynogenotes. (A) Normal embryonale morfologi av en diploid oppnås gjennom naturlige kors. (B) Haploid embryoer viser en kortere og bredere kropp aksen. (C) Homozygote diploider ha normal kropps morfologi. Embryoet tillegg gjennomføre en recessiv mutasjon i pigmentering genet gylden til rette for sporing av foreldrenes DNA arv: mødre er homozygot bærere for en mutasjon i gyllen og fedre villtype for dette genet. Dermed naturlige diploider, heterozygote for golden, stille ut villtype pigmentering, mens begge haploids (hemizygous for golden) og homozygot diploider (homozygote for golden) utviser mutant pigmentering. Scale bar = 0,5 mm. Paneler endret fra reskjellen ^2, gjengitt med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Løsning	komponenter	lagrings~~POS=TRUNC
Hanks Løsning 1	8,0 g NaCl, og 0,4 g KCl i 100 ml DDH 2 O	Oppbevar ved 4 o C
Hanks Løsning 2	0,358 g Vannfritt Na2SC HPO 4, og 0,6 g KH 2 PO 4 i 100 ml DDH 2 O	Oppbevar ved 4 o C
Hanks Løsning 4	0,72 g CaCl2 i 50 ml DDH 2 O	Oppbevar ved 4 o C
Hanks Løsning 5	1,23 g MgSO4 ∙ 7H 2 O i 50 ml DDH 2 O	Oppbevar ved 4 o C
Hank Premix	Legg til, i følgende rekkefølge: 10,0 ml Løsning 1, 1,0 ml Løsning 2, 1,0 ml Løsning 4, 86,0 ml ddH2O, og 1,0 ml Løsning 5	Oppbevar ved 4 o C
Hanks Løsning 6	0,33 g NaHCO3 i 10 ml DDH 2 O	Forbered frisk morgenen av IVF prosedyre

Tabell 1. Fremstilling av Hank 's løsninger.

Discussion

kritiske trinn

Det er viktig å arbeide under forhold med effektive in vitro fertilisering. For å sikre en god tilførsel av modne egg (trinn 1), kvinner satt opp for parring bør ikke har blitt satt opp i parrings kors i minst 5 dager, og skal vises gravid. Under avbrudd i avl, kan en observatør overvåke 15-30 stridsvogner tilstrekkelig for den første visningen av naturlig egg ekstrudering. Avbrudd av parring bør skje så snart som mulig når de første eggene blir sluppet gjennom naturlige parringer, for å tillate de fleste egg for å forbli inne i hunn for IVF-prosedyren. Disse kvinner, som nå er klar for manuell ekstrudering av modne egg, kan holdes atskilt inntil 2 timer uten en åpenbar effekt på etterfølgende egg utgivelse. For å fremstille et sperm effektiv løsning (trinn 2), bør menn vises robust og ideelt sett med en rødlig nyanse, noe som er karakteristisk for avl sebrafisk hanner. En ren disseksjon innebærer vanligvis remotreråvare tarm spor ved å trekke den mot den bakre av kroppen, og svømmeblæren ved å trekke den anteriorly. Etter fjerning av sentrale indre organer, testiklene være som gjennomskinnelige langstrakte massene ved siden av hver side av det indre legemet veggen. Unngå inkludert uønskede organer (for eksempel tarmen) inn i sperm løsning; Hvis det er nødvendig å skille disse fra testiklene ved å arbeide på en tørr petriskål overflaten før den ble plassert inn i Hanks oppløsning. For å oppnå høy befruktning priser under IVF (trinn 4), er det viktig at ekstruderte egg opprettholdes kompetent til sperm tillegg. Egg kompetente for befruktning utstillings en litt gul tone og er gjennomsiktig. Unngå egg som har kontakt med vann før sperm tillegg, siden vannet vil utløse egg aktivering og for tidlig aktivering vil være til hinder for befruktning. Vann aktivering og gjødsling skal skje innen 90 sekunder etter ekstrudering fra hunn for å unngå dehydrering av egg, som vilføre til deres degradering. Om nødvendig kan ekstruderte egg holdes i lengre tid (opp til 1,5 timer eller mer) i 100-200 ul av Hanks løsning supplert med 0,5% bovint serumalbumin (BSA) ¹⁷ (ved fremstilling av Hanks oppløsning for dette formålet, forberede forblandingen for å korrigere for vanninnhold tilsatt i løpet av BSA tilskudd). Hvis eggene har blitt holdt kompetent med hjelp av Hanks BSA løsning, fjerne overflødig Hanks BSA fra eggene ved hjelp av en mikropipette og gjødsle innen 1 min.

Et kritisk punkt for å lykkes med diploidisering hjelp HS2 er sorteringen av fastlåste embryoer (trinn 7). Initial sortering av symmetrisk spalte 2-celle embryoer velger for embryo som blir befruktet og begynner celledeling (sporadisk dispermy under IVF resultater i embryoer som overgang direkte fra 1- til 4-celler ved 35-50 MPF - slike embryoer skal kastes). Cell sykling skjer hvert 15. minutt i løpet av disse tidlig embryo staldre (35-50 MPF for den første cellesyklus, 50-65 MPF for den andre cellesyklus, og så videre), slik at sortering av spalte embryoene i løpet av de første 10 min av hver cellesyklus sikrer et fravær av overlapping mellom sykluser og nøyaktige identifikasjon av en celledeling stall.

Modifikasjoner og feilsøking

Styrken av UV-behandling i trinn 3 (f.eks eksponeringstid, lampeeffekt, avstand til lampen) kan justeres om nødvendig ved å teste første befruktning priser så vel som frekvensen av haploids i fravær av påfølgende HSII behandling: den korrekte mengden UV-stråling ikke har en merkbar effekt på befruktning priser mens resulterer i 100% av haploide embryoer (se representant Resultater å skille haploid fra diploide embryo). For mye UV-stråling fører til reduserte befruktning prisene antagelig på grunn av skadelige effekter på sperm funksjon, mens utilstrekkelig UV eksponering produserer diploide embryoer grunn to ufullstendig inaktivering av sperm DNA.

Hvis embryoer vise utviklingsmessige defekter eller dødelighet etter gjenopptakelse av celle cleavage (trinn 7), kan varmesjokk temperaturen i trinn 6 reduseres litt (f.eks til 41,0 ° C) for å øke embryo overleve; tilstander som medfører omtrent like fraksjoner av avvikende 3-cellers og fastlåste 2-celle embryoer i løpet av andre cellesyklusen (og er derfor nær terskelen for en effekt på centriolar duplisering) resultere i minimale påfølgende utviklingsdefekter og økt overlevelse etter gjenopptakelse av celle sykling .

Den HS2 metoden har en praktisk og iboende mekanisme for å vurdere celledeling stall (og dermed hele genomet duplisering), siden direkte observasjon av befruktede egg som de utvikler kan spore de ulike cellesykluser. Manuelt valg av befruktede egg som har gjennomgått en en-cellesyklus divisjon stall lar generere en ensartet befolkning på diploidized embryos. HS2 kan utføres i en hvilken som helst sebrafisk genetisk belastning (f.eks AB, Tübingen, WIK), som en-celledeling stall fungerer som en iboende mekanisme for å bekrefte DNA duplisering. I tillegg kan synlige genetiske markører innført i stammen benyttes for å lette identifiseringen av diploidized embryoer (figur 3). For eksempel, bruken av egg fra hunner som er homozygote for recessive mutasjoner i pigmentering gener, slik som gull eller albino, kan kombineres med sperm avledet fra villtype-stammer som bærer normale alleler for den samme pigmentering genet. I denne situasjonen, fordi UV-behandlet sæd ikke kan bidra med villtype-pigment alleler, haploide og diploide homozygote embryoer oppviser den recessive pigment mutasjonen. I tillegg er homozygot diploider oppviser villtype morfologi ved 24 HPF, i skarp kontrast til den mindre utvidede haploide morfologi. Kombinasjonen av utseendet på mors recessiv egenskap og samlet Embryo morfologi bekrefter vellykket ploidiresultat duplisering. Ytterligere bekreftelse kan fås gjennom kromosom tellinger av behandlede og ubehandlede embryoer.

Den ovenfor beskrevne genetisk markeringssystem, på grunnlag av recessive synlige genetiske markører, gjør det også mulig å bekrefte fraværet av sperm-avledet DNA i avkommet, ettersom de resulterende embryo oppviser villtype pigmentering bare hvis sæd ikke har blitt fullstendig inaktivert av UV-behandlingen . I fravær av en genetisk markeringssystem, kan en prøve av embryoer få lov til å utvikle seg i fravær av varmesjokk for å bekrefte at alle embryoer viser den haploide morfologi ved 24 HPF, og således at sperm DNA inaktivering var fullstendig. I forbindelse med fullt inaktivert sperm, den samme genetiske merkesystem også kan oppdage potensielle spontan polar kroppen fiasko. En slik hendelse vil resultere i fremkomsten av recessivt merkede embryoer med diploid morfologi uten en diploidisering behandling. Spontan polar body svikt har ikke blitt observert i sebrafisk, men er rapportert i Xenopus tropic ^18. Hvis til stede i et gitt system, vil denne spontane arrangementet må reduseres eller kontrolleres for for optimalt å gjennomføre ploiditet manipulasjon.

Begrensninger av teknikken

Evnen til å produsere levedyktige gynogenotes er avhengig av fravær av bakgrunns genvarianter som når homozygot er skadelig. Således vil suksessen til fremgangsmåten variere avhengig av den genetiske stammen anvendes. Seleksjon av genetiske stammer gjennom flere generasjoner av gynogenese har vist seg å forbedre levedyktigheten ^1.

Den HS2 metode, når det brukes sammen med ubehandlet sæd for å frembringe diploide embryoer, tillater også produksjon av tetraploide embryoer ved en høy frekvens. Men i dette tilfellet, på grunn av diploid til tetraploid transformasjon, genetiske markører ikke lett tillater bekreftelse av hele genome duplisering. I dette tilfellet bør observasjon av en cellesyklus stall i synkroniserte embryoer og valg av fastlåste embryoer forsikre tetraploid utvalg, og kromosomtellinger kan anvendes for ytterligere å bekrefte ploiditet.

Betydning med hensyn til eksisterende / alternative metoder

Selv om det er beskrevet av Streisinger over 40 år siden ^1, standard HS metoden har ikke blitt mye brukt på grunn av dårlig utbytte. I stedet har ploiditet manipulering nesten utelukkende avhengig av den alternative og forholdsvis mer effektiv metode for tidlig trykk, noe som resulterer i ploiditet duplisering gjennom hemming av andre meiotisk divisjon. Men Tidlige Trykk resulterer i varierende andeler av genet homozygosity ^9,19, noe som reduserer sin verdi som en genetisk verktøy. Nyere studier viser at HS2, en modifikasjon av standard HS-protokollen, nemlig anvendelsen av varmepulsen på et annet tidspunkt i løpet av den første cellesyklusen (den 22-24MPF periode i HS2, sammenlignet med 12-14 MPF i standard HS) resulterer i opp til fire ganger økt utbyttet av homozygot diploide produksjoner.

Virkningen av varmepulsen kan utledes til å oppstå på grunn av hemmingen av centriole duplisering i løpet av tiden for varmesjokk (22-24 MPF, i løpet av den første cellesyklus), som følgelig mangler de riktige komplement til å generere en spindel og formidle celledeling i løpet av påfølgende cellesyklusen (50-65 MPF, svarende til den andre cellesyklus). Centriole duplisering kan fortsette i fravær av varmesjokk i løpet av de påfølgende cellesyklus, slik at utvikling for å fortsette etter at en nøyaktig ett-cellesyklus stall. Fordi centriole duplisering og DNA replikering sykluser er avhengige av hverandre ^20, fortsetter DNA replikasjon som normalt selv om fastlåste divisjon i andre cellesyklusen. Dette resulterer i presis hele genomet duplisering og fullstendig homozygosis.

fremtidige søknader

21.

Tilnærminger lik HS2 kan anvendes på andre arter med ytre befruktning, selv de som ikke for tiden blir brukt som genetiske systemer. denne metodenSpesielt utnytter en tidsperiode fra befruktning gjennom initiering av blastomere sykling, hvor en varmepuls kan påvirke centriole duplisering og generere en nøyaktig celledeling stall og hele genomet kopiering uten å frembringe skadelige utviklingsmessige effekter. Dermed kan denne tidlige perioden bli utforsket for varme sjokk følsomhet for å utvikle ploidinummer manipulasjon baserte genetiske metoder i andre animalske systemer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zebrafish mating boxes	Aqua Schwarz	SpawningBox1
NaCl	Sigma	S5886
KCl	Sigma	P5405
Na2HPO4	Sigma	S3264
KH2PO4	Sigma	P9791
CaCl2	Sigma	C7902
MgSO4-7H2O	Sigma	63138
NaHCO3	Sigma	S5761
Tricaine	Western Chemical	Tricaine-D (MS 222)	FDA approved (ANADA 200-226)
Tris base	Sigma	77-86-1	to prepare 1 M Tris pH 9.0
HCl	Sigma	920-1	to prepare 1 M Tris pH 9.0
Fish net (fine mesh) (4-5 in)	PennPlax	(ThatFishThatPlace # 212370)	available in ThatFishThatPlace
Plastic spoon			available in most standard stores
Dissecting scissors	Fine Science Tools	14091-09
Dissecting forceps	Dumont	SS	available from Fine Science Tools
Dissecting stereoscope (with transmitted light source)	Nikon	SMZ645	or equivalent
Reflective light source (LED arms)	Fostec	KL1600 LED	or equivalent
Petri plates 10 cm diameter			any maker
Eppendorf tubes 1.5 ml			any maker
Ice bucket			any maker
Pipetteman P-1000			any maker
Pipette tips 1,000 µl			any maker
Narrow spatula	Fisher	14-374
Depression glass plate	Corning Inc	722085 (Fisher cat. No 13-748B)	available from Fisher Scientific
UV lamp	UVP	Model XX-15 (cat No. UVP18006201)	available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting)
UV glasses			any maker
Paper towels			any maker
Kimwipes	Kimberly-Clark	06-666-11	available from Fisher Scientific
Timer stop watch			any maker
Wash bottle	Thermo Scientific	24020500	available from Fisher Scientific
Tea strainer			available in kitchen stores
beakers, 250 ml (2)	Corning Inc.	1000250	available from Fisher Scientific
water bath (2)			any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series)
Hanks’ Solution 1	see above	see above	8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 2	see above	see above	0.358 g Anhydrous Na2HPO4, 0.6 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O. Store at 4 °C.
Hanks’ Solution 4	see above	see above	0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O. Store at 4 °C.
Hank's Premix	see above	see above	add, in the following order: 10.0 ml Solution 1;  1.0 ml Solution 2;  1.0 ml Solution 4;  86.0 ml ddH2O;  1.0 ml Solution 5. Store at 4 °C
Hanks’ Solution 6	see above	see above	0.33 g NaHCO3 in 10 ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure.
Hank's Solution (final solution)	see above	see above	Combine 990 μl of Hank’s Premix and 10 μl of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution)