Summary
Модифицированный протокол для плоидности манипуляции использует тепловой шок, чтобы вызвать срыв одного цикла в цитокинеза у ранних эмбрионов. Этот протокол демонстрируется в данио, но могут быть применимы и к другим видам.
Abstract
Манипуляция плоидности позволяет полезных преобразований, таких как диплоидами к тетраплоидов или гаплоидов к диплоидами. В данио Danio rerio, в частности генерация гомозиготных гиногенетических диплоидами полезен для генетического анализа , поскольку он позволяет прямое производство гомозигот из одной гетерозиготной матери. В данной статье описывается модифицированный протокол для дублирования плоидности, основанный на теплового импульса во время первого клеточного цикла, Heat Shock 2 (HS2). Путем ингибирования центриолей дублирования, этот способ приводит к точному стойло деления клеток во время второго клеточного цикла. Точный один цикл деления стойло, в сочетании с дублированием незатронутой ДНК, приводит к дублированию всего генома. Протоколы , связанные с этим способом , включают яйца и сбора спермы, УФ - обработка спермы, оплодотворение и тепловой импульс , чтобы вызвать задержку цикла деления одноклеточного и плоидности дублирования. Модифицированная версия этого протокола может быть примененчтобы вызвать изменения плоидности у других видов животных.
Introduction
Этот протокол позволяет манипулировать плоидности у эмбрионов данио рерио, таких , как в поколении гомозиготных гиногенетических диплоидами из гиногенетических гаплоидов (рисунок 1) или для производства тетраплоидов. Это достигается за счет индукции задержки в цитокинеза , соответствующей точности одного клеточного цикла (фиг 2А, 2В). Ключом задержка в один цикл в цитокинезе достигается путем обработки теплового шока. Стандартный протокол теплового шока (HS), первоначально описанной Streisinger и его коллеги участвуют импульс температуры в течение периода 13-15 МПФ, в результате чего один цикл клеточного деления киоска в течение первого клеточного цикла 1. Эффективность данного протокола была недавно улучшена путем сканирования ранних клеточных циклов с выдвижным временного окна теплового шока лечения. Это сканирование определили более поздний момент времени для теплового шока, до сих пор в течение первого клеточного цикла (22-24 MPF), что приводит к более высокой скорости EMBRYos с деления клетки стойло на один такт, что в данном случае не влияет на вторую клеточный цикл 2. Наблюдение , что экспериментальные манипуляции во время первого клеточного цикла мешают деления клеток во время второго клеточного цикла и привести к ДНК дублирования контента также сообщалось в других видов рыб 3,4. Мы имеем в виду этого модифицированного протокола в качестве теплового шока 2 (HS2 - термин "2" отражает, что тепловой импульс происходит в более поздний момент времени, чем стандартный метод HS, и что задержка клеточного цикла, вызванное HS2 происходит во время второго клеточного цикла ). Эти исследования показали, что основанием для ареста цитотомии после теплового шока является ингибирование центриолей дублирования во время теплового импульса, который влияет на формирование веретена и борозды индукции следующим клеточного цикла. Результаты HS2 с выходом остановки клеточного цикла , приближающиеся 100%, а темпы плоидности дублирования в 4 раза выше , чем стандартные HS 2.
Эмбрионы лечение остроумиега теплового шока во время езды на велосипеде бластомеров клеток обнаруживают много вредных эффектов, предполагая , что тепловой шок влияет на несколько процессов , необходимых для клеточного деления 2. С другой стороны, если тепловой удар наносится до начала клеточного езда на велосипеде (период времени 0-30 MPF), по- видимому, имели эффекты в соответствии с конкретным вмешательством центриолей дублирования и, кажется , не влияют на другие важные процессы в клетке 2 , Эти исследования показали, что время до начала деления бластомеров, как представляется, период развития поддаются с помощью теплового шока в качестве инструмента для специфически манипулировать плоидность через центриолей торможения. Основная причина кажущейся селективности в отношении теплового шока на центриолей дублирования неизвестна, но может быть связано с селективной деградации центросомой субструктур , наблюдаемых при тепловом стрессе в определенных типах клеток, таких как лейкоциты 5.
Временная синхронизация эмбрионального девития достигается путем экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Использование необработанной спермы во время оплодотворения результатов в диплоидных эмбрионов, что при HS2-индуцированных один цикл цитокинез стойло стать тетраплоид. Использование УФ - обработанной спермы, который несет сшивок , которые инактивируют ее ДНК, результаты в гиногенетических гаплоидных эмбрионов 6, который при HSII-индуцированных один цикл цитокинез стойло стал гиногенетических Диплоиды 2. Из-за полученного целого генома дублирования, последний гиногенетических Диплоиды являются гомозиготными в каждом локусе через геном. Для краткости, мы имеем в виду гиногенетических гаплоидные эмбрионы как "гаплоидов", и гомозиготных гиногенетических диплоидных эмбрионов, как "гомозиготных диплоидами". Если жизнеспособной и плодородные, гомозиготные Диплоиды могут быть использованы для инициирования стерильных и летальные свободных линий. Прямой гомозиготность, индуцированный HS2 также должны быть легко включены в генетический анализ или генетических экранов, так как гомозиготных диплоидами от самок, которые являются гетерозиготными носителями Мутations ставки демонстрируют гомозиготности при высоких и фиксированной (50%). пропорции 2
Следующий протокол описывает шаги для выполнения Hs2 и индуцируют плоидности дублирования с полной гомозиготности. Для тетраплоидной производства, решение спермы должно быть не лечить. Для получения гомозиготных диплоидных производства, сперма должна быть инактивированной с помощью УФ-обработки. Кроме того, как описано в дискуссии, видимые маркеры пигмента также могут быть использованы для облегчения идентификации гомозиготных диплоидами. Данио мате в основном в течение первых 3 ч от начала их светового цикла 7, и как взрослым , так и яйца чувствительны к циркадных ритмов 8, так что для достижения наилучших результатов процедура ЭКО должно происходить в течение этого периода времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с университетом штата Висконсин - Мэдисон и Уходу за животными и рекомендациями по использованию комитета (IACUC) (Университет штата Висконсин - Мэдисон Обеспечение номер A3368-01).
1. Выбор самок для откладки коллекции с помощью Прерванная Спаривание
Примечание: IVF на основе протоколов полагаются на выдавливании зрелых яиц из самок с помощью ручного давления 9. Предыдущие протоколы использовали самок непосредственно из цистерн или в парных скрещиваний без женщин, проходящих поведение высвобождения яйца, но лишь малая часть из этих женщин (около 20% или меньше, в зависимости от данио линии) дают экструдированный и компетентные яйца при ручном давлении. В усовершенствованную процедуру, самки предварительно отсортированные для яйцекладки путем непосредственного визуального наблюдения, с последующим немедленным прерыванием спариванию. Эта процедура очень эффективна, так как почти все самки предварительно выбраны через этот прерванного сопрягаемой стадии выходом экструдированные и компетентные яйцапри ручном давлении.
- Во второй половине дня до начала эксперимента установить брачные пары желаемого данио штамма в стандартных данио сопрягаемыми коробки. Хранить мужчин в той же камере, что женщины еще физически отделены от них, либо через спаривание коробки разделения или путем размещения самца под вставкой яйцекладки и самку внутри вкладыша.
- Утром эксперимента, удалите физический раздел, помещая как мужского и женского пола в той же яйцекладки вставки, так что начинается спаривание.
- Осмотреть емкостей, содержащих пары спаривание для обнаружения экструзию яиц при естественном спаривании. При первых признаках яичных выдавливания, отдельный самец и самка, чтобы прервать размножение. После отделения от самцов, держать заранее выбранных самок либо отдельно, либо объединенных в одном танке. Использование нескольких самок в зависимости от количества эмбрионов желаемых (обычно 50-150 яиц / женщины).
2. Подготовка спермы Solution
Примечание: IVF гElies при воздействии зрелых яиц в раствор спермы. Это решение может быть необработанной, чтобы произвести диплоидные зиготы (который при обработке HS2 становятся тетраплоидные эмбрионы) или УФ обработке, чтобы произвести гаплоидные зиготы (который при обработке HS2 становятся гомозиготные диплоидные эмбрионы). Предыдущие протоколы подготовки спермы предложил использовать капиллярные трубки для сбора молок из анальной области живых самцов, но это было неэффективным процесс , как только небольшая часть самцов дали молоки 9. Протокол, представленные ниже полагается, а не на подготовку спермы из стригли расчлененный семенников, что дает более надежные результаты.
- Готовят раствор Хенкса раньше времени как раствор предварительного смешивания Хенкса, состоящий из всех компонентов (Растворы 1, 2, 4 и 5), за исключением раствора бикарбоната натрия (раствор 6). Приготовьте раствор 6 свежих и добавить к предварительной смеси утром в день эксперимента (таблица 1). Для того, чтобы раствор Хэнкса (окончательное решение, подготовить утром в деньПроцедура ЭКО), смешайте 990 мкл премикса Хэнкса и 10 мкл свежеприготовленного раствора 6.
- Эвтаназии самцов передержки к Tricaine как 0,016% раствора в кондиционированной воды.
- Готовят Tricaine как 0,2% исходного раствора в воде (буфер до рН 7,0 с помощью 1 М Трис, рН 9,0), и держать при температуре 4 ° С. Добавить 8 мл Tricaine маточного раствора на 100 мл воды в химическом стакане, а также использовать сеть для передачи самцов в раствор Tricaine.
- Используйте эквивалент семенников для одного самца в кладке необходимо было оплодотворенной в объеме раствора Хэнкса , соответствующий 100 мкл на самца (например , семенники из 10 самцов , собранных в 1 мл раствора Хенкса, к оплодотворению 10 муфтами с 100 мкл / сцепления).
- Подтверждение эвтаназии путем прекращения движений жабр в течение 15 минут. После эвтаназии, удалите мужчин из стакана с ложкой. Промыть самцов кратко кондиционированной водой и высушить их слегка, помещая их на короткое время на несколько мест расположениябумажное полотенце.
- Чтобы удалить семенники, первые обезглавить умерщвлены самцы с помощью рассекает ножницы или лезвие бритвы, и сделать продольный разрез вдоль живота с рассечения scissors.Under рассекает микроскоп с отраженным источником света, удалить внутренние органы с рассекающих щипцов. Вытащите каждый из семенников масс с пинцетом и поместить их внутрь микроцентрифужных пробирку, содержащую раствор Хенкса.
Примечание: Семенники могут быть идентифицированы как каждый из двух удлиненных структур полупрозрачный внешний вид, найденных вдоль стен тела и сходящихся вблизи клоаки. Яичники могут остановиться 2-3 мин на чашках поверхности пластины после рассечения и перед помещением их в растворе в Хэнкса. - Отпустите сперму в раствор стрижкой семенники с узким шпателем и / или осторожно пипеткой вверх и вниз 5-6 раз семенники в растворе с 1000 мкл кончика микропипетки а, во избежание образования пузырьков воздуха. Пусть семенники мусора отстояться.
- Хранить раствор спермы в лед, где он может сохранить свою активность в течение до 2-3 часов. Если перейти к УФ-обработки раствора спермы, Переносят раствор в чистую центрифужную пробирку, оставляя кусочки семенников позади.
3. УФ Лечение
Примечание: УФ обработка используется сшивать ДНК спермы для того, чтобы сделать его неактивным в зародыше. Этот шаг используется только при производстве гиногенетических гаплоидных или гомозиготные гиногенетических диплоидных эмбрионов. Сперматозоиды раствор для УФ-обработки должны быть отделены от кусочков семенников (этап 2.4), так как крупные куски могут защитить сперму от УФ-обработки.
- Переносят раствор спермы на чистую, сухую лунку депрессии стеклянной пластины , сидя на ледяной кровати (например , со льдом внутри чашку Петри). Использовать до 1 мл раствора спермы на стеклянную пластину так.
- Выставляют раствор спермы к УФ, помещая стеклянную пластину разрежения на ледяной кровати под УФ-лампой. Обрабатывают раствор спермы в течение 90 сек с 115 В (60 Гц, 0.68A) УФ-лампа на 19-см (7,5 дюйма) расстояние. С конца наконечника пипетки, аккуратно перемешать раствор каждые 30 секунд во время УФ-терапии (используйте чистую пипетку каждые 30 сек).
- С помощью чистого наконечника пипетки и микропипетки, передача обработанного раствора спермы в новую пробирку микроцентрифужных. Храните на льду, пока это необходимо для проведения ЭКО (не более 2-3 ч от добычи).
4. Ручная Экструзия зрелых яиц
Примечание: Женщины, полученные при прерывании естественных скрещиваний будет легко получить яйца под наркозом и ручным давлением. Во время этой процедуры, лечение Tricaine следует тщательно контролировать, чтобы избежать чрезмерного воздействия, которые могут предотвратить восстановление самок.
- Обезболить самок от воздействия света на Tricaine раствора: Передача самок с сеткой для Tricaine раствора в кондиционированной воды (получали добавлением 8 мл Tricaine 0,2% раствора до 100 мл кондиционированной рыбы воды) в течение примерно 2-5 минут, пока рыба остановки жаберных движение. <li> Как только самка прекращает движение жабр, используйте ложку, чтобы собрать его и кратко промыть его в кондиционированной воды. Тем не менее, используя ложку, чтобы переместить рыбу, высушить его слегка, поместив его на короткое время и неоднократно на нескольких местах бумажным полотенцем, а затем перенести его на чистую, сухую 10 см чашках диаметром пластины. Подход рыбы с ложкой в передней к задней направлении, чтобы избежать потенциально повредить жаберные крышечки.
- Используйте лабораторные салфетки или мягкую ткань, чтобы мягко дополнительно высушить области анального плавника, чтобы предотвратить любые выпущенные яйца от преждевременного активироваться водой. Увлажнение пальцы слегка с водой (чтобы избежать их прилипания к рыбьей чешуи), поместите один палец одной руки на спине самки в качестве поддержки, и пальцем другой руки приложите небольшое давление вдоль живота самки, пока яйца не станут экструдированный.
- Используйте узкую лопаточку, чтобы переместить яйца подальше от тела самки. Поместите самку обратно в резервуар с водой кондиционированной для восстановления.
- Активировать (с воздействием воды) и оплодотворить (с добавлением раствора спермы) яйца одновременно и в течение 90 секунд после экструзии (см раздел 5).
5. Экстракорпоральное оплодотворение
Примечание: Zebrafish оплодотворение в естественных скрещиваний является внешним, зависит от одновременного выпуска и активации воды яиц и спермы во время спаривания. Экстракорпоральное оплодотворение имитирует этот процесс, подвергая яйца в раствор спермы в присутствии воды. Объем воды изначально небольшой (1 мл) с целью повышения эффективной концентрации сперматозоидов. Связывание сперматозоидом происходит в течение 15-20 сек 10 </ SUP>, и объем воды, а затем может быть увеличена. Хорион подъема также вносит свой вклад в тесной синхронизации муфты, ограничивая окно компетенции для спермы связывания 11,12. Таким образом, в результате эмбрионы обнаруживают в основном одновременно циклов деление клеток на ранних стадиях дробления.
- Добавляют 100 мкл раствора спермы (соответствующий эквивалент семенников от одного самца - см Часть 2) к муфте экструдированных яиц на чашку Петри. Аккуратно вихревой наконечник пипетки используется для добавления раствора спермы среди яиц смешать сперму и яйца вместе, будучи уверенным, чтобы не поднимать кончик от поверхности чашку Петри, чтобы избежать повреждения яиц.
- Немедленно активировать яйца путем добавления 1 мл раствора эмбриональной среды (E3) (кондиционер воды также является приемлемым в качестве замены для Е3 в Части 5 до 7) и снова аккуратно перемешать яйца и спермы, осторожно закрученных с кончика пипетки. Запустить таймер для инициирования синхронизации по отношению к оплодотворению. На 1 МПФ в объеме 1 мл, залить плиту с Е3. Перед тем как продолжить, не оставляют в покое до 10-12 МПФ, чтобы позволить активацию яйца, в том числе полное расширение хориона.
6. Лечение теплового шока
Примечание: Тепловой шок применяется в ранних эмбрионов ингибирует дублирования центриоля, что приводит к неполному состав центриолями для привода формирование веретена во время последующего клеточного цикла 2. Отсутствие шпинделя в свою очередь , приводит к отсутствию бороздам формации 13.
- После расширения хорионов (10-12 MPF), влить эмбрионов из чашку Петри в ситечко. Ополосните чашку Петри с помощью промывочного бутылку с Е3 для того, чтобы собрать все оставшиеся эмбрионы в ситечко.
- Поместите ситечко с эмбрионами внутри химический стакан в предварительно нагретую ванну с Е3 при 28,5 ° С. Предварительно уравновешивания мензурку и E3 до температуры водяной бани, и убедитесь, что там достаточно E3, так что все эмбрионы в чаеСетчатый фильтр подвергаются среды.
- На 22 МПФ, удалите ситечко из водяной бане в 28,5 ° C, кратковременно промокните его на бумажное полотенце, чтобы удалить лишнюю влагу, и поместить его внутри аналогично предварительно нагретую E3 стакане в тепловой бане при температуре 41,4 ° С.
- На 24-й МПФ, передать ситечко обратно на E3 в водяной бане при температуре 28,5 ° С, после краткого блоттинга. На 29 МПФ, используйте промывочный бутылку с E3 для передачи эмбрионов из ситечко до 10 см чашку Петри.
7. Выбор для Эмбрионы с одним циклом Цитокинез Stall
- В течение периода времени 35-45 МПФ, под микроскопом рассекает с переданным источником света, выберите те эмбрионы, которые осуществляют симметричное расщепление на стадии 2-х клеток, и которые, следовательно, оплодотворены. Удалить эмбрионов, которые не претерпевают расщепление клеток.
- Продолжайте наблюдать оплодотворенного эмбрионов, отобранных для нормального деления клеток во время первого клеточного цикла, и в течение секундЗонд клеточного цикла (50-65 MPF).
- Сортировка эмбрионов по следующим категориям (рис 2С): 4 ячейки ( "нет стойло", в 2: 2 стандарта переложение для 4-клеточного эмбриона); 3 клетки ( "частичный срыв", в аномальным 2 небольших клеток: 1 большая расположение клеток); и 2 клетки ( "застопорился", эмбрионы экспонирование задержку цикла одноклеточного в объемном соотношении 1: 1, расположение идентичен 2-клеточного эмбриона). Сортировка приостановленных эмбрионов в свежую чашку Петри.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе эмбрионы в 2: расположение 2 соответствуют тем, в которых во время второго клеточного цикла ни бластомер подвергся стойло клеточного деления; эмбрионов в аномальным 2 небольших клеток: 1 большая расположение клеток соответствуют тем, где тепловой шок вызвало остановку клеточного цикла срыв во время второго клеточного цикла в одном бластомере, но не другой; и эмбрионы "застряла" в отношении 1: 1, расположение соответствуют тем, где во время второго клеточного цикла оба бластомеры прошли желаемое клеточное делениестойло. Застрявшие эмбрионов должны возобновить расщепление клеток в течение следующего периода клеточного цикла (65-80 MPF). Расположение бластомеров может быть переменной, из - за неполной сигналы от предыдущего клеточного цикла , чтобы стабилизировать шпиндель 2,14, но большинство эмбрионов будут образовывать относительно нормальную бластуле, подверженное нормальному развитию. - Разрешить эмбрионов развиваться в чашки Петри, с лимитом 80 эмбрионов на 10 см пластины. На 24 -й ФВЧ, наблюдать эмбрионов , чтобы определить , имеют ли они нормальную морфологию характеристику диплоидных или гомозиготных диплоидных эмбрионов 6 (нормальной степени расширения оси (рис 3A, 3C)), в отличие от уменьшенной расширения оси и увеличение тела толщина характеристика гаплоидов (фигура 3В)), и / или оценки диплоидизации с использованием генетических маркеров , пигментных на 36 МПФ, такие как золотой или альбиноса и других таких анализов (рис 3 и ниже) 2,6,9. Удалите все эмбрионы, которые появляются, чтобы иметь гаплоидный морфологии, или которые лизируют или проявляют другие грубо ненормальные дефекты.
Примечание: При желании, позволяют эмбрионы разработать до 5 дней после оплодотворения, продолжая при этом для удаления лизированных или грубо ненормальные эмбрионы на ежедневной основе, и добавления свежей E3, чтобы обновить среду. Примечание: Выживание эмбрионов также можно выращивать после плавательного пузыря инфляции на 5-й день путем передачи в системе инкубаторий и кормления в стандартных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Несмотря на один клеточного цикла цитокинеза стойло, репликация ДНК происходит обычно в таких эмбрионов, что приводит к дублированию содержания ДНК эмбриона (рисунок 1). Протокол Streisinger теплового шока (стандарт HS) включает в себя тепловой импульс в течение периода 13-15 минут после оплодотворения (МПФ) и вызывает в первую очередь цитокинез арест во время первого деления клеток эмбриона на 35 MPF 1,2, в то время как полученный метод , описанный здесь, упоминается как Heat Shock 2 (HS2), использует теплового шока в течение периода 22-24 МПФ и индуцирует цитокинез арест во время второго эмбрионального деления клеток при 50 МПФ (рисунок 2; 2,3,4). В 24 часов после оплодотворения, наблюдение эмбрионов позволяет определить , имеют ли они нормальную морфологию характеристику диплоидных или гомозиготных диплоидных эмбрионов, или короче и шире тела оси морфологии характеристики гаплоидных эмбрионов (Рисунок 3)
Рисунок 1: Типы оплодотворению. (A) Естественное спаривание. Мужские и женские половые клетки не получают лечения, что приводит к естественному диплоидной. (В) Сперма обрабатывают УФ, что приводит к разрушению отцовской ДНК и производства гаплоидных зиготы. При отсутствии лечения, такие гаплоидов не выживают прошедшие сутки 2-3 развития. (C) Лечение гаплоидных зиготы с тепловым Shock 2 (HS2) ингибирует один цикл цитокинезе митоза в ранних эмбрионов. Этот клеточный цикл стойло, параd для репликации ДНК незатронутой, генерирует гомозиготных диплоидами, которые могут стать жизнеспособными и половозрелых взрослых особей. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: ТГ2 способствует целый дублирования генома, задерживая второй клеточный цикл. (А) Сотовый расщепления образец необработанного эмбриона в течение первых трех клеточных циклов, что соответствует 2-, 4-, и 8-клеточных эмбрионов. Результаты лечения (B) HS2 в стойло на один цикл клеточного деления во время второго клеточного цикла. В киоске, продолжающиеся результаты синтеза ДНК в эмбрионы подвергаются диплоидизации, либо из гаплоидный в диплоидных (п -> 2n) или диплоидных к тетраплоид (2n -> 4N) (см текст). После этого киоска, эмбрион возобновляет деление клеток, с пеwly приобрела плоидность. (С) ТГ2 обработанных эмбрионов могут проявлять различные бластомеров механизмы не в зависимости от того бластомеры обнаруживают задержку клеточного деления во время второго клеточного цикла: I) "нет стойло": ни бластомеров проявляет задержку, в результате 2: 2 СХЕМЫ характеристика эмбрионы 4-клеточной стадии, II) "частичный срыв": только один из двух бластомеров показывает задержку, что приводит к аномальным 2: 1 компоновке и III) "застопорился": оба бластомеры демонстрируют задержку, в результате чего в соотношении 1: 1 расположение характерно для эмбрионов стадии 2-х клеток. В (А - С), ядра представляются в виде синих кругов, с событием диплоидизации в лице расширения размера ядра. См ссылку 2 для диаграммы , изображающие центриолярных поведение в качестве предлагаемой основы для стойла клеточного деления. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенное Versiна этой фигуре.
Рисунок 3: Морфология естественных диплоидами, гаплоидов и gynogenotes. (A) Нормальная морфология эмбриональных диплоидного , полученного в результате естественных скрещиваний. (В) гаплоидных эмбрионы обнаруживают короче и шире оси тела. (C) Гомозиготных Диплоиды имеют нормальную морфологию тела. Эмбрионы дополнительно несут рецессивный мутации в гене пигментации золотой для облегчения отслеживания наследования родительского ДНК: матери являются гомозиготными носителями мутации в золотой и отцы дикого типа для этого гена. Таким образом, природные Диплоиды, гетерозиготные для золотистого цвета, проявляют дикого типа пигментации, в то время как гаплоидов (гемизиготной для золотой) и гомозиготные диплоидами (гомозиготные золотой) обладают мутантный пигментацию. Шкала бар = 0,5 мм. Панели редактировался повторногоFerence 2, перепечатано с разрешения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Решение | Компоненты | Условия хранения |
| Хэнкса Решение 1 | 8,0 г NaCl, и 0,4 г хлорида калия на 100 мл DDH 2 O | Хранить при температуре 4 ° С |
| Хэнкса Решение 2 | 0,358 г Безводный Na 2 HPO 4, и 0,6 г KH 2 PO 4 в 100 мл DDH 2 O | Хранить при температуре 4 ° С |
| Хэнкса Решение 4 | 0,72 г CaCl 2 в 50 мл DDH 2 O | Хранить при температуре 4 ° С |
| Хэнкса Решение 5 | 1,23 г MgSO 4 ∙ 7H 2 O в 50 мл DDH 2 O | Хранить при температуре 4 ° С |
| Премикс Хэнка | Добавить, в следующем порядке: 10,0 мл раствора 1, 1,0 мл раствора 2, 1,0 мл раствора 4, 86,0 мл ddH2O, и 1,0 мл раствора 5 | Хранить при температуре 4 ° С |
| Хэнкса Решение 6 | 0,33 г NaHCO 3 в 10 мл DDH 2 O | Подготовить свежие утром процедуры искусственного оплодотворения |
Таблица 1. Приготовление растворов Хэнка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги
Крайне важно, чтобы работать в условиях эффективной экстракорпорального оплодотворения. Для того, чтобы обеспечить хороший запас зрелых яиц (этап 1), самки установить для вязки не должны были быть созданы в брачных крестов, по крайней мере, 5 дней и должен появиться Gravid. Во время перерыва в разведении, наблюдатель может контролировать 15-30 танков адекватно для первого появления естественной экструзии яйца. Прерывание спаривание должно происходить как можно быстрее, когда первые яйца высвобождаются через естественные спариваний, с тем чтобы большинство яиц, чтобы оставаться внутри самок для процедуры искусственного оплодотворения. Эти женщины, которые теперь готовы к ручному экструзии зрелых яиц, может храниться в течение отделенный до 2 часов без очевидного эффекта на последующее высвобождение яиц. Для получения эффективного решения спермы (этап 2), самцы должны появиться прочный и идеально с красноватым оттенком, что характерно для разведения данио самцов. Чистый рассечение обычно включает RemoВинг кишечника дорожки, потянув ее по направлению к задней части тела, и плавательного пузыря, потянув его вперед. После удаления центральных внутренних органов, семенники остаются полупрозрачные удлиненные массы вдоль каждой стороны внутренней стенки тела. Избегайте в том числе нежелательных органов (например , кишечника) в раствор спермы; если необходимо отделить их от семенников, работая на сухой поверхности пластины чашках перед помещением в раствор в Хэнкса. Для достижения высоких показателей во время оплодотворения IVF (этап 4), необходимо, чтобы экструдированные яйца поддерживаются компетентны до того спермы. Яйца компетентные для оплодотворения демонстрируют слегка желтого тона и полупрозрачные. Избегайте яйца, имеющие какой-либо контакт с водой перед добавлением спермы, так как вода будет вызывать активацию яиц и преждевременной активации будет препятствовать оплодотворению. Активация воды и оплодотворение должно происходить в течение 90 сек экструзии из самки с тем, чтобы избежать обезвоживания яиц, который будетприводят к их деградации. При необходимости, экструдированные яйца можно хранить в течение длительного периода (до 1,5 ч и более) в 100-200 мкл раствора Хенкса с добавлением 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) 17 (при приготовлении раствора в Хэнка для этой конкретной цели, подготовить премикс для корректировки содержания воды, добавленной во время БСА добавок). Если яйца были сохранены компетентным с помощью раствора БСА Хэнка, удалить избыток БСА Хэнка из яиц с помощью микропипетки и удобрять в течение 1 мин.
Важным шагом для успеха диплоидизации с использованием Hs2 является сортировка остановленных эмбрионов (этап 7). Первичная сортировка симметрично расщепляющие эмбрионов 2-клеточных эмбрионов выбирает для, которые становятся оплодотворяется и начинают деление клеток (иногда диспермия во время результатов ЭКО у эмбрионов, что переход непосредственно от 1- до 4-х клеток на 35-50 МПФ - такие эмбрионы должны быть отбрасываются). Ячейка езда на велосипеде происходит каждые 15 мин в течение этих ранних стадиях эмбрионального говозраста (35-50 MPF для первого клеточного цикла, 50-65 MPF для второго клеточного цикла, и так далее), так что сортировочные расщеплять эмбрионов в течение первых 10 мин каждой клеточного цикла обеспечивает отсутствие перекрытия между циклами и точным идентификация стойло клеточного деления.
Модификации и устранение неисправностей
Сила УФ - обработки на стадии 3 (например , время экспозиции, мощность лампы, расстояние до лампы) можно отрегулировать при необходимости путем тестирования начальных скоростей оплодотворения, а также частоту гаплоидов при отсутствии последующей обработки HSII: правильное количество УФ - облучение не оказывает заметного влияния на показатели оплодотворения в то время как в результате 100% гаплоидных эмбрионов (см Представитель Результаты отличать гаплоидных от диплоидных эмбрионов). Слишком много УФ-облучение вызывает снижение скорости оплодотворения предположительно из-за вредного воздействия на функцию сперматозоидов, в то время как недостаточная ультрафиолетовое облучение производит диплоидных эмбрионов из-за то неполной инактивации ДНК спермы.
Если эмбрионы обнаруживают дефекты развития или летальность после возобновления клеточного расщепления (этап 7), температура теплового шока на шаге 6 может быть несколько снижена (например , до 41,0 ° C) , чтобы увеличить выживаемость эмбрионов; условия, которые приводят к примерно равные доли аберрантных 3-элементная и застопорились эмбрионов 2-клеток во время второго клеточного цикла (и поэтому вблизи порога для влияния на центриолей дублирования) приводит к минимальным последующих дефектов развития и увеличение выживаемости после возобновления клеток езды на велосипеде ,
Метод ТГ2 включает в себя удобный и присущую механизм для оценки клеточного деления стойло (и, следовательно, весь дублирования генома), так как непосредственного наблюдения эмбрионов, как они развиваются позволяет отслеживать различные циклы клеток. Ручной выбор эмбрионов, которые подверглись ларьке цикл деления одной ячейки позволяет сформировать однородную популяцию diploidized эмбрионаs. ТГ2 можно проводить в любом данио генетической деформации (например , АВ, Тюбинген, WIK), как одно деление клетки стойло действует как собственного механизма подтверждения дублирования ДНК. Кроме того, видимые генетические маркеры , вводимые в штамм может быть использован для облегчения идентификации diploidized эмбрионов (Рисунок 3). Например, использование яиц от самок, гомозиготные по рецессивным мутации в генах пигментации, таких как золотой или альбиноса, могут быть объединены со спермой , полученной из штаммов дикого типа , несущих нормальные аллели для того же самого гена пигментации. В этой ситуации, так как УФ-лечение сперма не может способствовать пигментные аллели дикого типа гаплоидных и гомозиготные диплоидные зародыши демонстрируют рецессивной мутации пигмента. Кроме того, гомозиготные Диплоиды проявляют дикого типа морфологии в 24 часов после оплодотворения, в резком контрасте с менее расширенной гаплоидный морфологии. Сочетание внешнего вида материнской рецессивному и общей Embryо морфологии подтверждает успешное дублирование плоидности. Дальнейшее подтверждение того, может быть получена с помощью хромосомных эпизодам обработанных и необработанных эмбрионов.
Вышеописанный генетическая система маркировки, основанная на рецессивных видимых генетических маркеров, а также позволяет подтверждать отсутствие ДНК спермы, полученных в потомстве, так как получаемые эмбрионы обнаруживают дикого типа пигментации, только если сперма не была полностью инактивируется УФ-обработкой , При отсутствии генетической системы маркировки, образец эмбрионов может быть позволено развиваться в отсутствие теплового шока, чтобы подтвердить, что все эмбрионы проявляют гаплоидный морфологии в 24 часов после оплодотворения, и, таким образом, что инактивацию ДНК спермы была завершена. В сочетании с полностью инактивированной спермы, это та же система генетической маркировки также позволяет обнаруживать потенциальные спонтанный полярный отказ тела. Такое событие может привести к появлению рецессивным маркированных эмбрионов с диплоидным морфологией без лечебных процедур диплоидизации. Спонтанное полярная Ьоау неисправность не наблюдается в данио , но , как сообщается в Xenopus tropicalis 18. Если он присутствует в данной системе, это спонтанное событие пришлось бы уменьшить или контролировать для того, чтобы оптимальным образом реализовать плоидности манипуляций.
Ограничения метода
Способность производить жизнеспособные gynogenotes полагается на отсутствие фоновых вариантов генов, которые при гомозиготными являются вредными. Таким образом, успех процедуры будет варьироваться в зависимости от генетического используемого штамма. Отбор генетических штаммов через нескольких поколений gynogenesis было показано улучшение жизнеспособности 1.
Метод ТГ2, при использовании в сочетании с необработанной сперме для получения диплоидных эмбрионов, также позволяет производить тетраплоидным эмбрионов на высокой частоте. Тем не менее, в этом случае, из-за диплоидных к тетраплоидном трансформации, генетические маркеры, не легко допускают подтверждение всего геномае дублирование. В этом случае наблюдение стойло цикла одной ячейки в синхронизированных эмбрионов и отбор эмбрионов остановленных должны обеспечить тетраплоидный выбор, и подсчет хромосом могут быть использованы для дальнейшего подтверждения плоидность.
Значение по отношению к существующим / альтернативные методы
Хотя описанный Streisinger более 40 лет назад 1, стандартный метод HS не был широко используется из - за плохого урожая. Вместо этого плоидности манипуляции почти исключительно опиралось на альтернативные и относительно более эффективный метод раннего давления, что приводит к дублированию плоидности путем ингибирования второго деления мейоза. Однако ранние результаты давления в различных пропорциях гена гомозиготности 9,19, что уменьшает его ценность в качестве генетического инструмента. Недавние исследования показали, что ТГ2, модификацией стандартного протокола ГС, а именно применения теплового импульса в разное время в течение первого клеточного цикла (22-24MPF период в HS2, по сравнению с 12-14 МПФ в стандартной ГС) приводит до 4 раз увеличения выхода гомозиготных диплоидных производств.
Действие теплового импульса, можно сделать вывод, чтобы иметь место в силу торможения центриолей дублирования во время теплового шока (22-24 МПФ, во время первого клеточного цикла), который, следовательно, испытывает недостаток в надлежащее дополнение, чтобы генерировать шпиндель и опосредуют деление клеток в течение следующего клеточного цикла (50-65 МПФ, соответствующей второму клеточного цикла). Центриоля дублирование может возобновить в отсутствие теплового шока в течение последующих клеточных циклов, что позволяет развитие на после точного киоске один-клеточного цикла. Поскольку центриоля дублирования и репликации ДНК циклы являются взаимозависимыми 20, репликация ДНК протекает нормально , даже во время остановленного разделения во втором клеточного цикла. Это приводит к точному дублированию целого генома и полной гомозиготности.
Будущие приложения
21.
Подходы, аналогичные HS2 могут быть применены к другим видам с внешним оплодотворением, даже те, в настоящее время не используются в качестве генетических систем. Этот методв частности, использует в течение периода времени от оплодотворения через инициации бластомеров езда на велосипеде, где тепловой импульс может повлиять на центриоля дублирования и генерировать точный срыв клеточного деления и весь дублирования генома, не производя вредных последствий для развития. Таким образом, этот ранний период времени могут быть изучены для теплового шока чувствительности к разработке плоидности манипуляции на основе генетических методов в других системах животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S3264 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| MgSO4-7H2O | Sigma | 63138 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Tricaine | Western Chemical | Tricaine-D (MS 222) | FDA approved (ANADA 200-226) |
| Tris base | Sigma | 77-86-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| HCl | Sigma | 920-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| Fish net (fine mesh) (4-5 in) | PennPlax | (ThatFishThatPlace # 212370) | available in ThatFishThatPlace |
| Plastic spoon | available in most standard stores | ||
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissecting forceps | Dumont | SS | available from Fine Science Tools |
| Dissecting stereoscope (with transmitted light source) | Nikon | SMZ645 | or equivalent |
| Reflective light source (LED arms) | Fostec | KL1600 LED | or equivalent |
| Petri plates 10 cm diameter | any maker | ||
| Eppendorf tubes 1.5 ml | any maker | ||
| Ice bucket | any maker | ||
| Pipetteman P-1000 | any maker | ||
| Pipette tips 1,000 µl | any maker | ||
| Narrow spatula | Fisher | 14-374 | |
| Depression glass plate | Corning Inc | 722085 (Fisher cat. No 13-748B) | available from Fisher Scientific |
| UV lamp | UVP | Model XX-15 (cat No. UVP18006201) | available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting) |
| UV glasses | any maker | ||
| Paper towels | any maker | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666-11 | available from Fisher Scientific |
| Timer stop watch | any maker | ||
| Wash bottle | Thermo Scientific | 24020500 | available from Fisher Scientific |
| Tea strainer | available in kitchen stores | ||
| beakers, 250 ml (2) | Corning Inc. | 1000250 | available from Fisher Scientific |
| water bath (2) | any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series) | ||
| Hanks’ Solution 1 | see above | see above | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O. Store at 4°C. |
| Hanks’ Solution 2 | see above | see above | 0.358 g Anhydrous Na2HPO4, 0.6 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O. Store at 4 °C. |
| Hanks’ Solution 4 | see above | see above | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O. Store at 4 °C. |
| Hank's Premix | see above | see above | add, in the following order: 10.0 ml Solution 1; 1.0 ml Solution 2; 1.0 ml Solution 4; 86.0 ml ddH2O; 1.0 ml Solution 5. Store at 4 °C |
| Hanks’ Solution 6 | see above | see above | 0.33 g NaHCO3 in 10 ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure. |
| Hank's Solution (final solution) | see above | see above | Combine 990 μl of Hank’s Premix and 10 μl of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution) |
References
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
- Heier, J., Takle, K., Hasley, A., Pelegri, F. Ploidy manipulation and induction of alternate clevage patterns through inhibition of centrosome duplication in the early zebrafish embryo. Dev. Dyn. 244, 1300-1312 (2015).
- Zhang, X., Onozato, H. Hydrostatic pressure treatment during the first mitosis does not suppress the first cleavage but the second one. Aquaculture. 240, 101-113 (2004).
- Zhu, X. P., You, F., Zhang, P. J., Xu, J. H., Sun, W. Effects of hydrostatic pressure on microtubule organization and cell cycle in gynogenetically activated eggs of olive flounder (Paralichthys olivaceus). Theriogenology. 68, 873-881 (2007).
- Vertii, A., Zimmerman, W., Ivshina, M., Doxsey, S. Centrosome-intrinsic mechanisms modulate centrosome integrity during fever. Mol. Biol. Cell. 26, 3451-3463 (2015).
- Walker, C. The zebrafish: Genetics and genomics. Vol. 60 Methods in Cell Biology. Detrich, W. H., Westerfield, M., Zon, L. I. , Academic Press. 43-70 (1999).
- Blanco-Vives, B., Sánchez-Vázquez, F. J. Synchronisation to light and feeding time of circadian rhythms of spawning and locomotor activity in zebrafish. Physiol. Behav. 98, 268-275 (2009).
- Dekens, M. P. S., et al. Light regulates the cell cycle in zebrafish. Curr. Biol. 13, 2051-2057 (2003).
- Pelegri, F., Schulte-Merker, S. The Zebrafish: Genetics and Genomics Vol. 60 Methods in Cell Biology. Detrich, W., Zon, L. I., Westerfield, M. , Academic Press. 1-20 (1999).
- Hart, N. H., Becker, K. A., Wolenski, J. S. The sperm entry site during fertilization of the zebrafish egg: localization of actin. Mol. Reprod. Dev. 32, 217-228 (1992).
- Tsaadon, A., Eliyahu, E., Shtraizent, N., Shalgi, R. When a sperm meets an egg: block to polyspermy. Mol. Cell. Endocrinol. 252, 107-114 (2006).
- Wong, J. L., Wessel, G. M. Defending the zygote: search for the ancestral animal block to polyspermy. Curr. Top. Dev. Biol. 72, 1-151 (2006).
- Rappaport, R., Rappaport, B. N. Establishment of cleavage furrows by the mitotic spindle. J. Exp. Zool. 189, 189-196 (1974).
- Wühr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W. I., Mitchinson, T. J. A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos. Curr. Biol. 20, 2040-2045 (2010).
- Yabe, T., Ge, X., Pelegri, F. The zebrafish maternal-effect gene cellular atoll encodes the centriolar component Sas-6 and defects in its paternal function promote whole genome duplication. Dev. Biol. 312, 44-60 (2007).
- Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes Dev. 18, 1527-1532 (2004).
- Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank's saline containing bovine serum albumin. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 6, 84-87 (1997).
- Roco, A. S., Olmstead, A. W., Degitz, S. J., Amano, T., Zimmerman, L. B., Bullejos, M. Coexistence of Y, W, and Z sex chromosomes in Xenopus tropicalis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, 4752-4761 (2015).
- Streisinger, G., Singer, F., Walker, C., Knauber, D., Dower, N. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112, 311-319 (1986).
- Dekens, M. P. S., Pelegri, F. J., Maischein, H. -M., Nüsslein-Volhard, C. The maternal-effect gene futile cycle.is essential for pronuclear congression and mitotic spindle assembly in the zebrafish zygote. Development. 130, 3907-3916 (2003).
- Pelegri, F., Mullins, M. Met. Cell Biol. Vol. 104. Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. , 83-120 (2011).
