Summary
En modifierad protokoll för ploidi manipulation använder en värmechock för att inducera en cykel stall i cytokines i det tidiga embryot. Detta protokoll demonstreras i zebrafisk, men kan tillämpas på andra arter.
Abstract
Manipulering av ploiditet möjliggör användbara transformationer, såsom diploider till tetraploids eller haploider till diploider. I zebrafisk Danio rerio, generering av homozygota gynogenetic diploider är speciellt användbar i genetisk analys, eftersom det gör det möjligt att direkt framställning av homozygoter från en enda heterozygot mor. I artikeln beskrivs ett modifierat protokoll för ploidi dubbel baserad på en värmepuls under den första cellcykeln, Heat Shock 2 (HS2). Genom hämning av centriol dubbel, resulterar detta på ett korrekt celldelning stall under andra cellcykeln. Den exakta en cykel division stall, kopplad till opåverkad DNA dubbelresulterar i hela genomet dubblering. Protokoll i samband med denna metod inkluderar ägg och insamling sperma, UV-behandling av sperma, in vitro fertilisering och värmepuls för att orsaka en en cellcykel division fördröjning och ploidi dubbelarbete. En modifierad version av detta protokoll kan tillämpasatt inducera ploiditet förändringar i andra djurarter.
Introduction
Detta protokoll möjliggör manipulering av ploiditeten i zebrafiskembryon, såsom i genereringen av homozygota gynogenetic diploider från gynogenetic haploider (Figur 1) eller produktion av tetraploids. Detta uppnås genom att framkalla en fördröjning av cytokines som motsvarar exakt en cellcykel (figur 2A, 2B). Nyckeln en-cykel fördröjning i cytokines uppnås genom behandling med värmechock. Standardprotokollet för värmechock (HS) såsom ursprungligen beskrivits av Streisinger och kollegor involverade en temperaturpuls under perioden 13-15 MPF, vilket resulterar i en en-cykel celldelning stall under den första cellcykeln 1. Effektiviteten av detta protokoll har nyligen förbättrats genom att scanna de tidiga cellcykler med en glidande tidsfönster värmechockbehandling. Detta scan identifierat en senare tidpunkt för en värmechock, fortfarande inom den första cellcykeln (22-24 MPF), som resulterar i en högre EMBRyos med en-cykel celldelning stall, som i detta fall påverkar den andra cellcykeln 2. Observationen att experimentella manipulationer under det första cellcykeln stör celldelningen under den andra cellcykeln och orsaka DNA-innehåll duplicering har även rapporterats i andra fiskarter 3,4. Vi hänvisar till denna modifierade protokoll som Heat Shock 2 (HS2 - termen "2" speglar att värmepulsen uppträder vid en senare tidpunkt än standard HS-metoden, och att cellcykelfördröjning orsakad av HS2 inträffar under den andra cellcykeln ). Dessa studier visade att grunden för cytokines rest efter värmechock är hämningen av centriol dubblering under värmepulsen, vilket påverkar spindelbildning och fåra induktion i följande cellcykeln. HS2 resulterar i utbyten av cellcykelstopp närmar 100%, och andelen ploiditeten dubbel upp till 4 gånger högre än standard HS 2.
Embryon behandlade witha värmechock under blastomere cellcykel uppvisar många skadliga effekter, vilket tyder på att värmechock påverkar flera processer som krävs för celldelning 2. Å andra sidan, om värmechock appliceras före initieringen av cellcykel (tidsperiod 0-30 MPF), verkar det ha effekter av specifika störningar med centriol dubbelarbete och verkar inte påverka andra viktiga cellprocesser 2 . Dessa studier visade att den tid före inledningen av blastomere division verkar vara en utvecklande period mottaglig för att använda värmechock som ett verktyg för att specifikt manipulera ploiditet genom centriol inhibition. Den underliggande orsaken till den uppenbara selektivitet för värmechock på centriol dubblering är okänd, men kan relateras till en selektiv nedbrytning av centrosom substrukturer som observerats under värmepåfrestning i vissa celltyper, såsom leukocyter 5.
Temporal synkronisering av embryonala deling åstadkommes genom in vitro-fertilisering (IVF). Användning av obehandlat spermier under gödslingsresulterar i diploida embryon som på HS2-inducerade en cykel cytokines stall blir tetraploid. Användning av UV-behandlade spermier, som bär tvärbindningar som inaktiverar dess DNA, resulterar i gynogenetic haploida embryon 6, som vid HSII-inducerade en cykel cytokines stall blir gynogenetic diploider 2. På grund av den resulterande hela genomet dubblering, de senare gynogenetic diploider är homozygot vid varje locus över genomet. För koncisa, hänvisar vi till gynogenetic haploida embryon som "haploider", och homozygota gynogenetic diploida embryon som "homozygota diploider". Om livskraftig och bördig, kan homozygota diploider användas för att initiera sterila och dödliga fria linjer. Direkt homozygoti inducerad av HS2 bör också lätt införlivas i genetisk analys eller genetiska skärmar, eftersom homozygota diploider från hondjur som är heterozygota bärare av mutheten uppvisar andelen homozygositet vid höga och fasta (50%) förhållanden 2.
Följande protokoll beskriver åtgärder för att utföra HS2 och inducerar ploidi dubblering med full homozygoti. För tetraploid produktionen bör spermie lösning vara obehandlade. För homozygot diploid produktion, bör spermier inaktiveras genom UV-behandling. Dessutom, som beskrivs i diskussionen, synliga pigment markörer kan också användas för att underlätta identifiering av homozygota diploider. Zebrafisk mate främst under tre första hr om inledandet av deras ljus cykel 7, och både vuxna och ägg är känsliga för dygnsrytmen 8, så för bästa resultat IVF förfarande bör ske inom denna tidsperiod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes enligt University of Wisconsin - Madison och Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) riktlinjer (University of Wisconsin - Madison Assurance nummer A3368-01).
1. Val av Honor för insamling av ägg via avbruten Parning
OBS: IVF-baserade protokoll förlitar sig på extrudering av mogna ägg från kvinnor genom manuellt tryck 9. Tidigare protokoll har använt honor direkt från tankar eller i par parningar utan honorna som genomgår ägg frigör beteende, men bara en liten del av dessa kvinnor (ca 20% eller mindre, beroende på zebrafisk linjen) ger extruderade och kompetenta ägg på manuellt tryck. I ett förbättrat förfarande, honor är försorterade för äggläggning genom direkt visuell observation, följt av omedelbart avbrytas parning. Detta förfarande är mycket effektivt, eftersom nästan alla kvinnor förvalda genom denna avbrutna parning stegutbyte extruderade och kompetenta äggvid manuellt tryck.
- Eftermiddagen före försöket, inrätta parning par av den önskade zebrafisk stammen i standardzebrafisk parning lådor. Håll män i samma kammare som honor ännu fysiskt separerade från dem, antingen genom en passande låda division eller genom att placera den manliga under en äggläggande insatsen och kvinnliga i insatsen.
- Morgonen experimentet bort den fysiska partition, placera både manliga och kvinnliga i samma äggläggande insats, så att parning börjar.
- Inspektera tankar som innehåller passande par att upptäcka extrudering av ägg under naturlig parning. Vid de första tecknen på ägg profiler, separata manliga och kvinnliga avbryta avel. Efter separation från män, hålla förvalda honor antingen separat eller sammanslagna i samma tank. Använd flera honor beroende på antalet embryon önskade (typiskt 50-150 ägg / hona).
2. Förbered en Sperm Lösning
OBS: IVF rElies på exponering av mogna ägg till en spermie lösning. Denna lösning kan vara obehandlade, för att generera diploida zygoter (som vid HS2 behandling blir tetraploida embryon) eller UV-behandlade, för att generera haploida zygoter (vilken vid HS2 behandling blir homozygota diploida embryon). Tidigare spermaberedningsprotokoll föreslagit användningen av kapillärrör för att samla in Milt från anal region av levande hanar, men detta var en ineffektiv process eftersom endast en liten fraktion av hanar gav Milt 9. Protokollet presenteras nedan bygger istället på förberedelser spermier från klippta dissekerade testiklar, som ger mer tillförlitliga resultat.
- Förbereda Hanks lösning i förväg som en Hanks förblandningslösning, bestående av alla komponenter (Lösningar 1, 2, 4 och 5) förutom den natriumbikarbonatlösning (Lösning 6). Förbereda Lösning 6 färska och tillsätt till förblandningen morgonen av experimentet (tabell 1). Att göra Hanks lösning (slutlig lösning, förbereda morgonen denIVF förfarande), kombinera 990 ul av Hanks Foder och 10 pl av den nyligen gjorda Lösning 6.
- Avliva män av överexponering för tricaine som en 0,016% lösning i rade vatten.
- Förbereda tricaine som en 0,2% stamlösning i vatten (buffert till pH 7,0 med 1 M Tris pH 9,0) och hålls vid 4 ° C. Tillsätt 8 ml tricaine stamlösning per 100 ml vatten i en bägare, och använda ett nät för att överföra hanarna till tricaine lösning.
- Använd motsvarande av testiklarna för en hane per kopplingen som behövs för att befruktas i en volym av Hanks lösning som motsvarar 100 ul per hane (t.ex. testiklar från 10 hanar uppsamlade i 1 ml Hanks lösning, att befrukta 10 kopplingar med 100 | j, l / koppling).
- Bekräfta dödshjälp genom upphörande av gäl rörelser under 15 minuter. Efter dödshjälp, ta hanarna från bägaren med en sked. Skölj hanarna kort med konditionerat vatten och torka dem lätt genom att placera dem i korthet på flera ställen i enpappershandduk.
- För att ta bort testiklarna, första halshugga avlivas män använder dissekera sax eller ett rakblad, och göra ett längsgående snitt längs buken med dissekera scissors.Under ett dissektionsmikroskop med en reflekterad ljuskälla, ta bort inre organ med dissekera pincett. Dra ut var och en av testiklarna massorna med pincett och placera dem i mikrocentrifugrör innehållande Hanks lösning.
OBS: Testiklar kan identifieras som var och en av två långsträckta strukturer av genomskinligt utseende grundar tillsammans kroppen väggar och som konvergerar nära kloaken. Testiklar kan stanna 2-3 min på en petriskål yta efter dissekering och innan de placeras i Hanks lösning. - Frigöra spermier in i lösningen genom skjuvning testiklarna med en smal spatel och / eller att försiktigt pipettera upp och ned 5-6 gånger testiklarna i lösning med en 1000 | j, l-tip mikropipett, samtidigt som man undviker luftbubbelbildning. Låt testiklarna skräp kvitta.
- Lagra den spermielösningen i is, där det kan hålla dess potens i upp till 2-3 timmar. Om du fortsätter med UV-behandling av spermier lösning, överför lösningen till ett rent mikrocentrifugrör lämnar bitar av testiklar bakom.
3. UV-behandling
OBS: UV behandling används för att tvärbinda sperma-DNA i syfte att göra det inaktivt i embryot. Detta steg används endast vid tillverkning gynogenetic haploida eller homozygota gynogenetic diploida embryon. Spermielösning för UV-behandling bör separeras från bitar av testiklar (steg 2,4), stora bitar kan skydda sperma från UV-behandling.
- Överför sperma lösning till en ren, torr brunn i en depression glasskiva sitter på en is säng (t.ex. is inuti en petriskål). Använd upp till 1 ml sperma lösning per glasskiva också.
- Exponera spermielösning för UV genom att placera fördjupningen glasplatta på isen sängen under en UV-lampa. Behandla spermielösning under 90 sekunder med en 115 V (60 Hz, 0.68A) UV-lampa på en 19 cm (7,5 inches) avstånd. Med slutet av en pipettspets, blanda försiktigt lösningen var 30: e sekund under UV-behandling (använd en ren pipettspets varje 30 sek).
- Med användning av en ren pipettspetsen och mikropipett, överföra den behandlade spermielösningen i ett annat mikrocentrifugrör. Förvara på is tills det behövs för IVF (längre än 2-3 timmar från utvinning).
4. Manuell extrudering av mogna ägg
OBS: Kvinnor som erhållits genom avbrott i naturliga parningar kommer lätt att ge ägg under narkos och manuellt tryck. Under detta förfarande bör tricaine behandling styras noggrant för att undvika överexponering som kan förhindra återvinning av honorna.
- Söva honor av ljusexponering till tricaine lösning: överförings honor med ett nät för att tricaine lösning i konditionerat vatten (gjord genom att tillsätta 8 ml Tricaine 0,2% stamlösning till 100 ml rade fisk vatten) i ca 2-5 minuter, tills fisken sluta gill rörelse. <li> Så snart en hona stannar gill rörelse, använd en sked för att samla in det och kortvarigt det i konditionerat vatten. Fortfarande använder sked för att flytta fisken, torka den lätt genom att placera den helt kort upprepade gånger på flera ställen i en pappershandduk och sedan överföra det till en ren, torr 10 cm petri diameter platta. Närma fisken med sked i den främre till bakre riktning, för att undvika potentiellt skadliga gäl gällocket.
- Använd labb våtservetter eller mjuk vävnad för att försiktigt ytterligare torka analfenan området, för att förhindra eventuella frigjorda ägg från tidigt aktiveras av vatten. Dämpande fingrarna lätt med vatten (för att undvika dem att hålla sig till fiskfjäll), placera ett finger på en hand på honans rygg som stöd, och med ett finger på den andra handen anbringa ett lätt tryck längs honans buken tills äggen blir extruderad.
- Använd en smal spatel att flytta äggen bort från den kvinnliga kroppen. Placera honan tillbaka till en tank med konditionerat vatten för återvinning.
- Aktivera (med vatten exponering) och gödsla (med sperma lösning tillägg) ägg samtidigt och inom 90 sekunder efter strängsprutning (se avsnitt 5).
5. In vitro fertilisering
OBS: Zebrafish befruktning i naturliga korsningar är extern, beroende på samtidig övergång och aktivering av vatten av ägg och spermier under parning. Provrörsbefruktning härmar denna process genom att exponera ägg till spermielösningen i närvaro av vatten. Vattenvolymen är ursprungligen liten (1 ml) i syfte att öka den effektiva koncentrationen spermier. Bindning av sperma sker inom 15-20 sek 10 </ Sup>, och vattenvolym kan därefter ökas. Chorion lyfta bidrar ytterligare till nära synkronisering av kopplingen genom att begränsa fönster för kompetens för spermier bindning 11,12. De resulterande embryona uppvisar därför i stort sett samtidiga celldelningscykler under de tidiga klyvningsstegen.
- Tillsätt 100 | il spermielösning (motsvarande till motsvarande testiklar från en manlig - se del 2) till kopplingen av strängsprutade ägg på en petriplatta. Snurra försiktigt pipettspetsen används för att lägga spermier lösning bland äggen att blanda spermier och ägg tillsammans, att se till att inte lyfta spetsen från ytan av petriskål att undvika ägg skador.
- Omedelbart aktivera äggen genom att tillsätta 1 ml embryonala medium (E3) lösning (rade vatten är också acceptabel som ett substitut för E3 i del 5 till 7) och återigen försiktigt blanda ägg och spermier genom att försiktigt snurra med pipettspetsen. Starta en timer för att initiera tids förhållande till befruktning. Vid en MPF i en ml volym, översvämma plattan med E3. Innan vi fortsätter, lämna orörd tills 10-12 MPF att tillåta ägg aktivering, inklusive full chorion expansion.
6. Värmechockbehandling
ANMÄRKNING: En värmechock appliceras i det tidiga embryot inhiberar centriol dubblering, vilket resulterar i en ofullständig komplement av centrioler att driva spindelbildning under den efterföljande cellcykeln 2. Frånvaro av spindeln i sin tur resulterar i avsaknaden av fåran bildning 13.
- Efter expansion av de chorions (10-12 MPF), häll embryona från petriplattan i en te sil. Skölj petriskål med användning av en tvättflaska med E3 för att samla in eventuella kvarvarande embryon i tesil.
- Placera tesil med embryona inuti en bägare i en förvärmd bad med E3 vid 28,5 ° C. Pre-jämvikt bägaren och E3 till vattenbadets temperatur, och se till att det finns tillräckligt med E3 så att alla embryon i tesil är utsatta för mediet.
- Vid 22 MPF, ta bort te sil från 28,5 ° C vattenbad, kort blot den på en pappershandduk för att avlägsna fukt, och placera den i en liknande förvärmd E3 bägare i ett värmebad vid 41,4 ° C.
- Vid 24 MPF, överföra tesil tillbaka till E3 i vattenbad vid 28,5 ° C efter kort blotting. Vid 29 MPF, använda en tvättflaska med E3 att överföra embryon från tesil till en 10 cm Petri platta.
7. Val av embryon med en One-cykel cytokines Stall
- Under tidsperioden 35-45 MPF, under ett dissektionsmikroskop med en överförd ljuskälla, välja de embryon som genomgår symmetrisk klyvning i två-cellstadiet, och som därför befruktas. Ta bort embryon som inte genomgår cell klyvning.
- Fortsätt att observera befruktade embryon, som valts ut för normal celldelning under första cellcykeln, och under sekOND cellcykeln (50-65 MPF).
- Sortera embryon enligt följande kategorier (Figur 2C): 4 celler ( "ingen stall", i 2: 2 arrangemang standard för en 4-cells embryo); 3-celler ( "partiell stall", i en avvikande 2 mindre celler: en stor cellarrangemang); och 2-celler ( "kört fast", embryon som uppvisar en ett-cellcykelfördröjning i en 1: 1 arrangemang identisk med den hos en 2-cell embryo). Sortera de strandade embryon till en ny petriskål.
OBS: I detta skede embryon i 2: 2 arrangemang motsvarar de där under andra cellcykeln varken blastomere genomgick en celldelning stall; embryon i en avvikande 2 mindre celler: en stor cell arrangemang motsvarar de där värmechock orsakade en cellcykel stall under andra cellcykeln i en blastomere men inte den andra, och embryon "strandade" i en 1: 1 arrangemang motsvarar dem där under andra cellcykeln båda blastomeres gick den önskade celldelninguppehåll. Strandade embryon ska återupptas cell klyvning under följande cellcykelperioden (65-80 MPF). Arrangemanget av blastomerer kan vara variabel, på grund av de ofullständiga signaler från den föregående cellcykeln för att stabilisera spindeln 2,14, men de flesta embryona kommer att bilda en relativt normal blastula som kan genomgå normal utveckling. - Låt embryon att utvecklas i Petri plattan, med en gräns på 80 embryon per 10 cm platta. Vid 24 HPF, observera embryon för att avgöra om de har en normal morfologi karakteristisk för diploida eller homozygota diploida embryon 6 (normal omfattning axel förlängning (Figur 3A, 3C)), i motsats till minskad axel förlängning och ökad kroppstjocklek kännetecknande för haploider (figur 3B)), och / eller bedöma diploidization använda genetiska pigmentmarkörer vid 36 MPF, såsom guld- eller albino och andra sådana analyser (Figur 3 och se nedan) 2,6,9. Ta bort alla embryon som verkar ha en haploid morfologi, eller som har lyserade eller uppvisar andra grovt onormala defekter.
OBS: Om så önskas, tillåter embryon att utvecklas fram till 5 dagar efter befruktningen, samtidigt som man fortsätter att avlägsna lyserade eller grovt onormala embryon på en daglig basis och tillsätta färsk E3 att uppdatera mediet. OBS: Överlevande embryon kan också odlas efter simblåsan inflation på dag 5 genom överföring till ett kläckeri systemet och utfodring under standardbetingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Trots en-cellcykel cytokines stall sker DNA-replikation normalt i sådana embryon, vilket resulterar i en dubblering av DNA-innehållet i embryot (Figur 1). Den Streisinger Heat Shock protokoll (standard HS) innebär en värmepuls under perioden 13-15 minuter efter befruktning (MPF) och inducerar primärt cytokines stillestånd under första embryonala celldelning vid 35 MPF 1,2, medan den härledda metoden som beskrivs här, benämnd Heat Shock 2 (HS2), använder en värmechock under perioden 22-24 MPF och inducerar cytokines stillestånd under andra embryonala celldelning vid 50 MPF (Figur 2, 2,3,4). Vid 24 HPF, observation av embryon tillåter att avgöra om de har en normal morfologi karakteristisk för diploida eller homozygota diploida embryon, eller kortare och bredare kroppsaxeln morfologi karakteristisk för haploida embryon (Figur 3)
Figur 1: Befruktning typer. (A) naturlig parning. Manliga och kvinnliga könsceller är obehandlade, vilket resulterar i en naturlig diploid. (B) Spermierna behandlas med UV, vilket resulterar i förstörelsen av faderns DNA och produktion av haploida zygoter. Om den inte behandlas, inte sådana haploider inte överleva förbi dag 2-3 av utvecklingen. (C) Behandling av haploida zygoter med Heat Shock 2 (HS2) hämmar en cykel av cytokines av mitos i det tidiga embryot. Denna cellcykelstall, pard till opåverkad DNA-replikation, genererar homozygota diploider som kan bli livskraftiga och fertila vuxna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: HS2 främjar hela genomet dubblering genom att maska den andra cellcykeln. (A) Cell klyvningsmönster för en obehandlad embryo under de första tre cellcykler, vilket motsvarar embryon 2-, 4-, och 8-cells. (B) HS2 behandling resulterar i en en-cykel stall av celldelning under andra cellcykeln. Under stall, pågående DNA-syntesresulterar i embryon genomgår diploidization, antingen haploida till diploida (n -> 2n) eller diploida att tetraploida (2n -> 4n) (se text). Efter detta stall, återupptar embryot celldelning, med newly förvärvad ploiditet. (C) HS2-behandlade embryon kan uppvisa en mängd olika blastomere arrangemang beroende huruvida blastomerer uppvisa en celldelning fördröjning under det andra cellcykeln: i) "no stall": varken blastomere uppvisar en försening, vilket resulterar i ett 2: 2 arrangemanget karakteristiskt för 4-cellstadiet embryon, ii) "partiell stall": endast en av två blastomeres uppvisar en fördröjning, vilket resulterar i en avvikande 2: 1 arrangemang, och iii) "kört fast": båda blastomeres uppvisar en fördröjning, vilket resulterar i en 1: 1 arrangemanget karakteristiskt för två-cellstadiet embryon. I (A - C), är kärnor representerade som blå cirklar, med diploidization händelse representeras av en utbyggnad av kärnstorleken. Se ett diagram som visar centriolar beteende som den föreslagna grunden för celldelning stall referens 2. Klicka här för att se en större versipå denna siffra.
Figur 3: Morfologi av natur diploider, haploider och gynogenotes. (A) Normal embryonala morfologi av en diploid erhållits genom naturliga kors. (B) Haploid embryon uppvisar en kortare och bredare kroppsaxeln. (C) Homozygota diploider har normal kropps morfologi. Embryon dessutom bär en recessiv mutation i pigmente genen gyllene för att underlätta spårning föräldrarnas DNA arv: mödrar är homozygota bärare för en mutation i gyllene och fäder vildtyp för denna gen. Således, naturliga diploider, heterozygota för golden, uppvisar vildtyp pigmentering, medan båda haploider (hemizygota för golden) och homozygota diploider (homozygota för golden) uppvisar mutant pigmentering. Skalstreck = 0,5 mm. Paneler modifierad från rekonferensen 2, återges med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Lösning | Komponenter | Förvaringsförhållanden |
| Hanks lösning 1 | 8,0 g NaCl, och 0,4 g KCl i 100 ml DDH 2 O | Förvaras vid 4 ° C |
| Hanks lösning 2 | 0,358 g Vattenfri Na 2 HPO 4, och 0,6 g KH 2 PO 4 i 100 ml DDH 2 O | Förvaras vid 4 ° C |
| Hanks lösning 4 | 0,72 g CaCl2 i 50 ml DDH 2 O | Förvaras vid 4 ° C |
| Hanks lösning 5 | 1,23 g MgSO 4 ∙ 7H 2 O i 50 ml DDH 2 O | Förvaras vid 4 ° C |
| Hanks Förblandning | Tillsätt i följande ordning: 10,0 ml Lösning 1, 1,0 ml Lösning 2, 1,0 ml Lösning 4, 86,0 ml ddH2O, och 1,0 ml Lösning 5 | Förvaras vid 4 ° C |
| Hanks lösning 6 | 0,33 g NaHCOs 3 i 10 ml DDH 2 O | Bered en färsk morgonen IVF förfarandet |
Tabell 1. Framställning av Hanks lösningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
kritiska stegen
Det är kritiskt att arbeta under betingelser för en effektiv in vitro fertilisering. För att tillförsäkra en god tillgång på mogna ägg (steg 1), kvinnor som inrättats för parning inte borde ha ställts in i parning kors i minst 5 dagar och bör finnas gravid. Under avbrott i avel, kan en observatör övervaka 15-30 tankar adekvat för den första förekomsten av naturliga ägg extrudering. Avbrott i parning bör ske så snart som möjligt när de första äggen frigörs genom naturliga parningar, så att de flesta ägg kvar i honorna för IVF förfarande. Dessa kvinnor, som är nu klar för manuell extrudering av mogna ägg, kan hållas åtskilda för upp till två timmar utan en märkbar effekt på efterföljande ägg release. För att förbereda en effektiv spermielösning (steg 2), bör män verkar robust och helst med en rödaktig nyans, som är kännetecknande för avel zebrafisk män. En ren dissektion innebär normalt removing tarm spår genom att dra den mot den bakre delen av kroppen, och simblåsan genom att dra den anteriort. Efter avlägsnande av centrala inre organ, testiklarna kvar som genomskinliga långsträckta massorna vid sidan vardera sidan av den inre kroppsväggen. Undvik inklusive oönskade organ (t.ex. tarmar) i spermier lösning; om det behövs skilja dessa från testiklar genom att arbeta på en torr petriskål yta innan den placeras i Hanks lösning. För att uppnå en hög befruktnings priser under IVF (steg 4), är det viktigt att extruderade ägg bibehålls kompetent tills sperma tillägg. Ägg behöriga för befruktning uppvisar en svagt gul ton och är genomskinliga. Undvika ägg som har någon kontakt med vatten före spermier Dessutom, eftersom vatten kommer att utlösa ägg aktivering och för tidig aktivering kommer att förhindra befruktning. Vattenaktivering och gödsling bör ske inom 90 sek för strängsprutning från honan för att undvika uttorkning av ägg, som kommer attleda till deras nedbrytning. Vid behov kan extruderade äggen förvaras under längre perioder (upp till 1,5 timmar eller mer) i 100-200 pl Hanks lösning kompletterad med 0,5% bovinserumalbumin (BSA) 17 (vid upprättandet av Hanks lösning för detta specifika ändamål, förbereda förblandningen för att korrigera för vattenhalt tillsätts under BSA tillskott). Om äggen har hållits kompetent med hjälp av Hanks BSA-lösning, avlägsna överskott Hanks BSA från äggen med hjälp av en mikropipett och befrukta inom en minut.
Ett kritiskt steg för att lyckas med diploidization använder HS2 är sortering av strandade embryon (steg 7). Inledande sortering av symmetriskt klyva embryon 2-cell väljer för embryon som blir befruktade och börja celldelning (tillfällig dispermy under IVF leder till embryon som övergång direkt från 1- till 4-celler vid 35-50 MPF - sådana embryon skall kasseras). Cellcyklisering inträffar vart 15 min under dessa tidiga embryonala ståldrar (35-50 MPF för första cellcykeln, 50-65 MPF för andra cellcykeln, och så vidare), så sortering av klyva embryon under de första 10 min av varje cellcykeln säkerställer en frånvaro av överlappning mellan cykler och korrekt identifiering av en celldelning stall.
Ändringar och felsökning
Styrkan i UV-behandlingen i steg 3 (t.ex. exponeringstid, lampeffekt, avstånd till lampan) kan justeras vid behov genom att testa initiala befruktning priser samt frekvensen av haploider i frånvaro av efterföljande HSII behandling: rätt mängd av UV-exponering har ingen märkbar effekt på befruktningstakt medan resulterade i 100% av haploida embryon (se Representativa resultat att skilja haploida från diploida embryon). För mycket UV-exponering orsakar reducerad gödsling priser förmodligen på grund av skadliga effekter på spermiefunktion, medan otillräcklig UV-exponering ger diploida embryon på grund av to ofullständig inaktivering av sperma DNA.
Om embryon uppvisar utvecklingsdefekter eller letalitet efter återupptagande av cell klyvning (steg 7), kan värmechockstemperaturen i steg 6 att minskas något (t ex till 41,0 ° C) för att öka embryots överlevnad; förhållanden som resulterar i ungefär lika stora fraktioner av avvikande tre-cell och strandade embryon 2-cell under andra cellcykeln (och är därför nära tröskeln för en effekt på centriolar dubblering) resulterar i minimala efterföljande utvecklingsdefekter och ökad överlevnad efter återupptagandet av cellcykel .
HS2 Metoden innehåller en bekväm och inneboende mekanism för att bedöma celldelning stall (och därmed hela genomet dubblering), eftersom direkt observation av embryon som de utvecklar det möjligt att spåra de olika cellcykler. Manuellt val av embryon som har genomgått en enda cellcykel division stall tillåter generering av en enhetlig population av diploidized embryos. HS2 kan utföras i någon zebrafisk genetiska stam (t.ex. AB, Tübingen, WIK), eftersom en-celldelning stall fungerar som en inneboende mekanism för att bekräfta DNA-duplicering. Dessutom kan synliga genetiska markörer som förs in i stammen användas för att underlätta identifieringen av diploidized embryon (Figur 3). Till exempel, användningen av ägg från honor som är homozygota för recessiva mutationer i pigmente gener, såsom guld- eller albino, kan kombineras med sperma som härrör från vildtyp-stammar som bär normala alleler för samma pigmente genen. I denna situation, eftersom UV-behandlade spermier inte kan bidra vildtyp pigment alleler, haploida och homozygota diploida embryon uppvisar den recessiva pigment mutation. Dessutom homozygota diploider uppvisar vildtyp morfologi vid 24 HPF, i skarp kontrast till den mindre förlängda haploida morfologi. Kombinationen av utseendet av moderns recessiv egenskap och övergripande embryo morfologi bekräftar framgångsrik ploidi dubbelarbete. Ytterligare bekräftelse kan erhållas genom kromosomantal av behandlade och obehandlade embryon.
Det ovan beskrivna genetiska märkningssystem, baserat på recessiva synliga genetiska markörer, gör det också möjligt att bekräfta frånvaron av spermier-härledda DNA i avkomman, eftersom de resulterande embryona uppvisar vildtyp pigmente endast om spermier inte till fullo har inaktiverats genom UV-behandling . I avsaknad av en genetisk märksystem kan ett prov av embryon få utvecklas i frånvaro av värmechock för att bekräfta att alla embryon uppvisar den haploida morfologi vid 24 HPF, och således att sperma-DNA inaktivering var fullständig. I samband med helt inaktiv spermier, även samma genetiska märkningssystemet tillåter att upptäcka potentiella spontan polära kroppen misslyckande. En sådan händelse skulle resultera i uppkomsten av recessivt märkta embryon med diploid morfologi utan diploidization behandling. Spontan polär body fel har inte observerats i zebrafisk, men redovisas i Xenopus tropic 18. Om det finns i ett givet system, skulle detta spontan händelse måste sänkas eller kontrolleras i syfte att optimalt genomföra ploiditet manipulation.
Begränsningar av tekniken
Förmågan att producera livskraftiga gynogenotes förlitar sig på frånvaron av bakgrunds genvarianter som när homozygot är skadliga. Således kommer framgången av förfarandet variera beroende på den genetiska stam som används. Val av genetiska stammar genom flera generationer av gynogenesis har visat sig förbättra lönsamheten 1.
HS2-metoden, när den används tillsammans med obehandlade spermier att producera diploida embryon, medger också produktion av tetraploida embryon vid en hög frekvens. Men i detta fall, på grund av att den diploida till tetraploid transformation, genetiska markörer inte lätt medger bekräftelse av hela GENOMe dubbelarbete. I detta fall bör observation av en cellcykel stall i synkroniserade embryon och urval av strandade embryon försäkra tetraploid val, och kromosomantal kan användas för att ytterligare bekräfta ploiditet.
Betydelse med hänsyn till befintliga / alternativa metoder
Även beskrivs av Streisinger över 40 år sedan ett, standard HS-metoden har inte använts i stor utsträckning på grund av dålig avkastning. I stället har ploiditet manipulation nästan uteslutande förlitat sig på de alternativa och relativt sett mer effektiv metod för tidig tryck, vilket resulterar i ploidi duplicering genom hämning av den andra meiotiska delningen. Men Tidiga Tryckresulterar i varierande proportioner av genen homozygoti 9,19, vilket minskar dess värde som en genetisk verktyg. Färska studier visar att HS2, en modifiering av den standard HS-protokollet, nämligen tillämpningen av värmepulsen vid en annan tidpunkt under den första cellcykeln (den 22-24MPF period i HS2, jämfört med 12-14 MPF i standard HS) resulterar i upp till fyra gånger ökat utbyte av homozygota diploida produktioner.
kan utläsas inverkan av värmepulsen att inträffa på grund av hämningen av centriol dubblering under tiden för värmechock (22-24 MPF, under den första cellcykeln), som följaktligen saknar den korrekta komplementet för att generera en spindel och medierar celldelning under den följande cellcykeln (50-65 MPF, motsvarande den andra cellcykeln). Centriol duplicering kan återupptas i frånvaro av värmechock under efterföljande cellcykler, vilket gör att utvecklingen kan fortsätta efter en exakt ett-cellcykel stall. Eftersom centriol dubbel och DNA-replikationscykler är beroende av varandra 20, fortsätter DNA-replikation normalt även under den avstannade divisionen i den andra cellcykeln. Detta resulterar i exakt hela genomet dubbelarbete och fullständig homozygoter.
framtida tillämpningar
21.
Tillvägagångssätt liknar HS2 kan tillämpas på andra arter med yttre befruktning, även dem som inte för närvarande används som genetiska system. denna metodi synnerhet utnyttjar en tidsperiod från befruktning genom initiering av blastomere cykling där en värmepuls kan påverka centriol dubbelarbete och skapa en exakt celldelnings stall och hela genomet dubblering utan att producera skadliga utvecklingseffekter. Således kan denna tidiga tidsperiod undersökas för värmechock känslighet för att utveckla ploiditet manipulation baserade genetiska metoder i andra djursystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S3264 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| MgSO4-7H2O | Sigma | 63138 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Tricaine | Western Chemical | Tricaine-D (MS 222) | FDA approved (ANADA 200-226) |
| Tris base | Sigma | 77-86-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| HCl | Sigma | 920-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| Fish net (fine mesh) (4-5 in) | PennPlax | (ThatFishThatPlace # 212370) | available in ThatFishThatPlace |
| Plastic spoon | available in most standard stores | ||
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissecting forceps | Dumont | SS | available from Fine Science Tools |
| Dissecting stereoscope (with transmitted light source) | Nikon | SMZ645 | or equivalent |
| Reflective light source (LED arms) | Fostec | KL1600 LED | or equivalent |
| Petri plates 10 cm diameter | any maker | ||
| Eppendorf tubes 1.5 ml | any maker | ||
| Ice bucket | any maker | ||
| Pipetteman P-1000 | any maker | ||
| Pipette tips 1,000 µl | any maker | ||
| Narrow spatula | Fisher | 14-374 | |
| Depression glass plate | Corning Inc | 722085 (Fisher cat. No 13-748B) | available from Fisher Scientific |
| UV lamp | UVP | Model XX-15 (cat No. UVP18006201) | available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting) |
| UV glasses | any maker | ||
| Paper towels | any maker | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666-11 | available from Fisher Scientific |
| Timer stop watch | any maker | ||
| Wash bottle | Thermo Scientific | 24020500 | available from Fisher Scientific |
| Tea strainer | available in kitchen stores | ||
| beakers, 250 ml (2) | Corning Inc. | 1000250 | available from Fisher Scientific |
| water bath (2) | any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series) | ||
| Hanks’ Solution 1 | see above | see above | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O. Store at 4°C. |
| Hanks’ Solution 2 | see above | see above | 0.358 g Anhydrous Na2HPO4, 0.6 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O. Store at 4 °C. |
| Hanks’ Solution 4 | see above | see above | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O. Store at 4 °C. |
| Hank's Premix | see above | see above | add, in the following order: 10.0 ml Solution 1; 1.0 ml Solution 2; 1.0 ml Solution 4; 86.0 ml ddH2O; 1.0 ml Solution 5. Store at 4 °C |
| Hanks’ Solution 6 | see above | see above | 0.33 g NaHCO3 in 10 ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure. |
| Hank's Solution (final solution) | see above | see above | Combine 990 μl of Hank’s Premix and 10 μl of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution) |
References
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
- Heier, J., Takle, K., Hasley, A., Pelegri, F. Ploidy manipulation and induction of alternate clevage patterns through inhibition of centrosome duplication in the early zebrafish embryo. Dev. Dyn. 244, 1300-1312 (2015).
- Zhang, X., Onozato, H. Hydrostatic pressure treatment during the first mitosis does not suppress the first cleavage but the second one. Aquaculture. 240, 101-113 (2004).
- Zhu, X. P., You, F., Zhang, P. J., Xu, J. H., Sun, W. Effects of hydrostatic pressure on microtubule organization and cell cycle in gynogenetically activated eggs of olive flounder (Paralichthys olivaceus). Theriogenology. 68, 873-881 (2007).
- Vertii, A., Zimmerman, W., Ivshina, M., Doxsey, S. Centrosome-intrinsic mechanisms modulate centrosome integrity during fever. Mol. Biol. Cell. 26, 3451-3463 (2015).
- Walker, C. The zebrafish: Genetics and genomics. Vol. 60 Methods in Cell Biology. Detrich, W. H., Westerfield, M., Zon, L. I. , Academic Press. 43-70 (1999).
- Blanco-Vives, B., Sánchez-Vázquez, F. J. Synchronisation to light and feeding time of circadian rhythms of spawning and locomotor activity in zebrafish. Physiol. Behav. 98, 268-275 (2009).
- Dekens, M. P. S., et al. Light regulates the cell cycle in zebrafish. Curr. Biol. 13, 2051-2057 (2003).
- Pelegri, F., Schulte-Merker, S. The Zebrafish: Genetics and Genomics Vol. 60 Methods in Cell Biology. Detrich, W., Zon, L. I., Westerfield, M. , Academic Press. 1-20 (1999).
- Hart, N. H., Becker, K. A., Wolenski, J. S. The sperm entry site during fertilization of the zebrafish egg: localization of actin. Mol. Reprod. Dev. 32, 217-228 (1992).
- Tsaadon, A., Eliyahu, E., Shtraizent, N., Shalgi, R. When a sperm meets an egg: block to polyspermy. Mol. Cell. Endocrinol. 252, 107-114 (2006).
- Wong, J. L., Wessel, G. M. Defending the zygote: search for the ancestral animal block to polyspermy. Curr. Top. Dev. Biol. 72, 1-151 (2006).
- Rappaport, R., Rappaport, B. N. Establishment of cleavage furrows by the mitotic spindle. J. Exp. Zool. 189, 189-196 (1974).
- Wühr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W. I., Mitchinson, T. J. A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos. Curr. Biol. 20, 2040-2045 (2010).
- Yabe, T., Ge, X., Pelegri, F. The zebrafish maternal-effect gene cellular atoll encodes the centriolar component Sas-6 and defects in its paternal function promote whole genome duplication. Dev. Biol. 312, 44-60 (2007).
- Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes Dev. 18, 1527-1532 (2004).
- Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank's saline containing bovine serum albumin. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 6, 84-87 (1997).
- Roco, A. S., Olmstead, A. W., Degitz, S. J., Amano, T., Zimmerman, L. B., Bullejos, M. Coexistence of Y, W, and Z sex chromosomes in Xenopus tropicalis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, 4752-4761 (2015).
- Streisinger, G., Singer, F., Walker, C., Knauber, D., Dower, N. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112, 311-319 (1986).
- Dekens, M. P. S., Pelegri, F. J., Maischein, H. -M., Nüsslein-Volhard, C. The maternal-effect gene futile cycle.is essential for pronuclear congression and mitotic spindle assembly in the zebrafish zygote. Development. 130, 3907-3916 (2003).
- Pelegri, F., Mullins, M. Met. Cell Biol. Vol. 104. Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. , 83-120 (2011).
