Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Induzione di acuta muscolo scheletrico Rigenerazione da cardiotossina Injection

doi: 10.3791/54515 Published: January 1, 2017

Summary

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per indurre rigenerazione muscolare acuta nei topi adulti e successive manipolazioni dei muscoli, come dissezione, gelati, taglio, colorazione di routine, e myofiber analisi sezione trasversale.

Abstract

rigenerazione muscolare scheletrico è un processo fisiologico che si verifica nei muscoli scheletrici adulti in risposta a infortunio o malattia. rigenerazione del muscolo scheletrico lesione indotta acuta è un potente sistema modello ampiamente utilizzato per studiare gli eventi coinvolti nella rigenerazione muscolare così come i meccanismi e giocatori diversi. Infatti, una conoscenza dettagliata di questo processo è essenziale per una migliore comprensione delle condizioni patologiche che portano alla degenerazione muscolare scheletrico, e aiuta a identificare nuove strategie terapeutiche mirate. Il presente lavoro descrive un protocollo dettagliato e riproducibile per indurre la rigenerazione del muscolo scheletrico acuta nei topi attraverso una singola iniezione intramuscolare di cardiotossina (CTX). CTX appartiene alla famiglia di serpente tossine veleno e causa miolisi di miofibre, che alla fine scatena gli eventi di rigenerazione. La dinamica della rigenerazione muscolare viene valutata mediante analisi istologica delle sezioni muscolari. Il protocollo ancheillustra le procedure sperimentali per dissezione, gelati, e tagliando il muscolo tibiale anteriore, così come la routine colorazione ematossilina e eosina che è ampiamente usato per la successiva analisi morfologica e morfometrica.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

muscoli scheletrici dei mammiferi adulti sono formate da gruppi di fascicoli di cellule muscolari multinucleate (miofibre) che sono specializzati per la contrazione. Ogni myofiber è un sincizio allungato, circondato dal sarcolemma (membrana plasmatica) e miofibrille contenenti, che sono costituiti da proteine ​​contrattili regolarmente e ripetutamente organizzati (actina e miosina filamenti). Nella vita adulta e, in condizioni di riposo, i muscoli scheletrici hanno un fatturato molto basso di loro mionuclei 1; infatti, le myonuclei, che si trovano alla periferia della myofiber, sotto il sarcolemma, vengono arrestati nella fase G0 del ciclo cellulare e sono in grado di proliferare 1,2.

I muscoli scheletrici hanno la peculiare capacità di rigenerare seguenti danni, raggiungendo l'omeostasi dopo diversi eventi di rimodellamento tissutale che sono strettamente legati gli uni agli altri. Dopo una lesione acuta o un trauma, degenerazione è indotta, seguito da processi di rigenerazioneche coinvolgerà diverse popolazioni di cellule, tra cui una popolazione residente di cellule muscolari, le cellule satellite (SCS). Infatti, in assenza di stimoli ambientali, le cellule satelliti sono in uno stato quiescente e si trovano in una nicchia specializzata tra il sarcolemma e 3,4 lamina basale. A seguito di un infortunio o di malattia, SC si attivano, proliferare, migrare verso le aree danneggiate, e alla fine di differenziare, dando luogo a nuova formazione myofibers 5. SC attivate stabilire cross-talk con diverse popolazioni di cellule, cellule infiammatorie soprattutto, che vengono reclutati nel sito del trauma 6-8. Questo cross-talk permette alle cellule di seguire un paradigma regolamentato attraverso il quale i segnali molecolari che guidano modifiche strutturali, portando infine all'omeostasi 9. Oltre SC, cellule infiammatorie e interstiziali, processi di angiogenesi, e gli eventi ri-innervazione sono anche coinvolti, che agisce in modo coordinato per riparare questo altamente organizzato e sStruttura pecialized.

C'è grande interesse a studiare diversi aspetti della rigenerazione muscolare, non solo di comprendere la fisiologia del muscolo, ma anche per migliorare le strategie terapeutiche che richiedono la conoscenza profonda di tutto il processo. Diversi approcci sperimentali sono attualmente disponibili per studiare l'identità e funzione delle diverse popolazioni cellulari, le vie di segnalazione e dei meccanismi molecolari coinvolti. modelli murini di danno acuto rappresentano un potente strumento per studiare molti aspetti di questo processo. Diverse tecniche comunemente usato per indurre un danno muscolare acuto consentire ai ricercatori di seguire il processo di rigenerazione in vivo, dalle primissime fasi alla fine del processo. Questo protocollo descrive i passi da iniezione intramuscolare di cardiotossina veleno di serpente-derivato (CTX), che induce miolisi e innesca il processo di rigenerazione, fino all'analisi di campioni di tessuto. Dopo l'iniezione CTX, mice può essere sacrificato a tempi diversi a seconda delle esigenze sperimentali, ei muscoli scheletrici può essere sezionato e trattati per ulteriori analisi. Infine, si descrive il protocollo di colorazione delle sezioni di tessuto per effettuare osservazioni morfologiche e analisi quantitative di base. Questo protocollo consente lo studio della rigenerazione muscolare acuta in vivo in modo altamente riproducibile 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in stretta conformità con le linee guida istituzionali per la ricerca degli animali e approvati dal Dipartimento di sanità pubblica, salute degli animali, la nutrizione e la sicurezza alimentare del Ministero della Salute italiano in conformità con la legge sulla sperimentazione animale. procedure dislocazione cervicale possono variare da istituto ad istituto sulla base di IACUC o ai suoi requisiti equivalenti.

1. cardiotossina iniezione nel muscolo tibiale anteriore

  1. Preparare una soluzione di 10 micron cardiotossina (CTX) di lavoro diluendo la soluzione cardiotossina magazzino in sterili fosfato-Buffered Saline (PBS) o in acqua prima di iniziare la procedura.
    Nota: CTX è solubile in acqua a 1 mg / mL. Preparare una soluzione stock 70 micron. Aliquota e conservare a -20 ° C. CTX usato per questo protocollo è una miscela di cardiotoxins aventi un peso molecolare di circa 7.000 Da.
    ATTENZIONE: Si consiglia di indossaredoppi guanti, una mascherina igienica, e occhiali di sicurezza (in alternativa agli occhiali di sicurezza, si raccomanda di lavorare sotto una cappa) e di essere molto attenti per evitare qualsiasi contatto con la soluzione, anche se diluito.
  2. Anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale di ketamina e xilazina (80 mg / kg e 10 mg / kg di massa corporea) o altri anestetici disponibili approvato.
  3. Con il mouse a faccia in su, spruzzare gli arti posteriori con il 70% di etanolo. Per visualizzare la posizione esatta del muscolo tibiale anteriore (TA), con l'aiuto di un bisturi, tagliare via i capelli nella parte anteriore della gamba, sotto il ginocchio.
    Nota: nasce Il muscolo TA dal corpo prossimale della tibia, scendendo lateralmente all'osso e termina alla caviglia. La sua lunga tendine estende nel piede attraverso la caviglia (vedere Figura 1A).
  4. Draw ~ 100 microlitri della soluzione nella siringa tirando indietro lo stantuffo lentamente.
  5. Rimuovere le bolle d'aria, mantenendo la siringa in posizione verticale (con l'ago verso l'alto). Tirare delicatamente lo stantuffo e tocca il lato della siringa per aiutare eventuali bolle d'aria attaccate alla parte interna del tubo vengono verso l'alto. Premere lentamente lo stantuffo per rilasciare grandi bolle d'aria. Alcune gocce di liquido verrà fuori l'ago. A questo punto, fare in modo di raccogliere il liquido di nuovo nel tubo e non disperderla, data la tossicità del cardiotossina.
  6. Prelevare la soluzione nella siringa fino al raggiungimento della dose desiderata. Iniettare 20 ml di soluzione CTX per ogni muscolo TA.
  7. Inserire l'ago nel centro del TA seguendo la posizione dell'osso tibia come guida, il tendine verso il ginocchio. Poiché il TA è un tessuto sottile, effettuare l'iniezione senza andare troppo in profondità (inserire l'ago 2/3 mm di profondità, a circa 10 ° a 20 ° angolo), ed evitare di andare oltre il muscolo stesso (Figura 1A).
  8. Non estrarre l'ago immediatamente dopo l'iniezione, ma attendere 2 - 3 s per prevenire perditeAll'età di CTX scende dal muscolo.
  9. Dopo la procedura, posizionare la gabbia su una piastra riscaldata (a 37 ° C) fino a quando i topi sono svegli, poiché l'anestetico e l'etanolo utilizzato riducono la temperatura del corpo.

Isolamento 2. tibiale anteriore

Nota: I muscoli possono essere isolati in diversi momenti dopo l'iniezione cardiotossina a seconda delle esigenze sperimentali.

  1. Sacrificare il mouse per dislocazione cervicale.
  2. Spruzzare le zampe posteriori con il 70% di etanolo. Durante la procedura, l'animale può essere fissato ad un supporto per tenerlo premuto.
  3. Tagliare la pelle a livello del tendine prossimale (sopra il piede), inserire una delle lame delle forbici sotto la pelle, e tagliare la pelle verso l'alto, in direzione del ginocchio. Con l'aiuto di una pinza, tirare la pelle ed esporre il muscolo del tutto. Rimuovere con cautela tutta la pelle e il pelo dalla zona di interesse.
  4. Eliminare la fascia pizzicando o tagliando lentamente (con °in-tip pinzette o con micro sottili forbici sezionare) all'estrema periferia del muscolo sul lato opposto della tibia (Figura 1B). Una volta rotto, rimuovere delicatamente la fascia con l'aiuto di una pinzetta sottile punta; evitare di danneggiare il muscolo sottostante.
    Nota: Come con altri muscoli e organi, il TA è coperta da fascia (fascia profonda della gamba), un sottile foglio di tessuto connettivo che si trova in profondità sotto la pelle e che deve essere rimosso per isolare facilmente il muscolo sottostante.
  5. Visualizza la distale del tendine TA e il tendine estensore comune delle dita sopra il piede, che sono giustapposti. Il tendine del muscolo estensore lungo delle dita (EDL) si trova leggermente al di sotto del tendine TA. I tendini di topi adulti sono visibili ad occhio nudo.
  6. Rimuovere il muscolo TA seguendo una delle due seguenti tecniche:
    1. Tagliare entrambi i tendini con micro multa dissezione forbici e tirarli verso la parte prossimale, holding i tendini con una pinza. Separate le due tendini, tirandoli delicatamente in direzioni opposte per separare i muscoli.
    2. Con l'aiuto di una pinzetta sottile punta, separare il tendine distale TA dal tendine estensore delle dita facendo passare la punta al di sotto del tendine stesso (Figura 1C, foto in alto). Far scorrere delicatamente le pinzette sotto il TA per separarlo dai muscoli sottostanti (Figura 1C, foto in basso).
    3. Tenere le pinzette sotto il muscolo per tenerlo leggermente sollevata, tagliare il tendine TA, e tirare delicatamente verso l'alto fino a quando solo l'area sotto il ginocchio è collegato (Figura 1D, foto a sinistra). Tagliare il TA di sotto del ginocchio, seguendo il bordo del muscolo con le forbici (Figura 1D, immagine destra).
      Nota: Se il muscolo rimane un po 'attaccato ai lati, utilizzare micro multa dissezione forbici per contribuire a staccarlo.
      Nota: Se la pinza non facilmente si adattano al di sotto del TA,è possibile che la fascia non è stato completamente rimosso, e potrebbe essere ancora visibile sulla parte superiore del muscolo. In questo caso, rimuovere completamente la fascia prima di procedere.

3. Fresh Tecnica muscolare congelato

  1. Mettere una piccola quantità di gomma adragante o un composto adesivo congelamento simili (per esempio, Optimal taglio temperatura (OCT) composto) su una fetta di sughero. Etichettare fetta del sughero sul retro prima del congelamento, se necessario (Figura 2A).
  2. Per ottenere sezioni trasversali del muscolo, affondare la TA nella gomma adragante inserendo il tendine distale e lasciando circa 3/4 del muscolo esterno, assicurandosi di avere il muscolo in posizione perpendicolare rispetto al tappo (Figura 2A).
  3. Riempire una lattina di alluminio (in alternativa, una tazza di metallo o di un bicchiere di vetro), con isopentano. Sospendere la lattina di isopentano in una contenente liqui Deward azoto, non consentendo l'azoto liquido entri nella lattina.
    Nota: Isopentano deve raggiungere la giusta temperatura (da -150 a -160 ° C) per il congelamento ottimale del tessuto. La temperatura corretta è raggiunta quando alcune particelle solide bianche formano sul fondo della lattina e isopentano diventa leggermente viscosa.
    Nota: Non congelare il campione prima della formazione delle particelle solide, in quanto può portare ad artefatti congelamento. D'altra parte, se il isopentano diventa completamente solida, lasciarla a temperatura ambiente fino a quando non viene scongelato, facendo in modo che alcune particelle bianche sono ancora presenti.
  4. Utilizzando pinze MIXTER, rapidamente immergere il tappo di sughero con il muscolo in isopentano, mantenendo il muscolo posizionato verso il basso, e fare in modo di liberare il tappo quando è completamente immerso nel liquido. In questo modo, mentre il campione galleggia, solo il lato opposto del tappo deve essere visibile nel liquido.
  5. Lasciare la sample in isopentano per 1 min.
  6. Utilizzando pinze MIXTER (o pinze simili), prendere il muscolo ed immergerlo in azoto liquido per almeno 2 minuti.
  7. Avvolgere i campioni singolarmente in foglio di alluminio etichettati e subito metterli in ghiaccio secco (-70 ° C), o direttamente memorizzarli in una -80 ° C freezer.
    Nota: Durante la procedura, dai passi 3.4 a 3.7, è estremamente importante mantenere la temperatura corretta e per evitare che i campioni da scongelamento (ad esempio, durante il trasferimento al -80 ° C freezer.). L'aumento dei risultati di temperatura in scongelamento incontrollata e ricongelamento dei microcristalli acqua che sono presenti all'interno del tessuto e alla fine provoca la formazione di artefatti o rottura delle fibre muscolari (visualizzate nelle sezioni di tessuto come grandi buchi bianchi al centro della fibra).

4. Criostato sezionamento di muscoli congelati

  1. Regolare la temperatura della camera t criostatoo da -20 a -22 ° C.
  2. Mettere il stub esemplare, la lama e il campione nella camera di criostato, permettendo loro di equilibrare per almeno 30 min.
  3. Mettere una piccola quantità di composto di congelamento (ad esempio, OCT compound) sulla matrice del campione ed immergere il tappo con il campione prima che i composti solidifica congelamento. Nel frattempo, posizionare la lama nel supporto lama.
  4. Allineare il campione e la lama utilizzando le viti fornite per orientare la porta campione con il portalama (Figura 2B).
  5. Impostare lo spessore della sezione di 10 micron. Procedere per tagliare il tessuto. Per ogni giro della ruota motrice, del portacampioni avanza una distanza controllata verso la lama.
  6. Posizionare le sezioni su un vetrino polarizzato (da 8 a 10 sezione per slide) (Figura 2C).
  7. Dopo il sezionamento, conservare i campioni a -80 ° C.
    Nota: Il campione può essere conservato in un congelatore C -80 ° e riutilizzati per furtheR sezionamento, se adeguatamente manipolato e conservato.

5. routine istologica di colorazione (ematossilina e eosina Macchie)

Nota: Diversi macchie istologiche possono essere eseguite su sezioni muscolari secondo l'analisi. Una macchia istologico di routine per l'analisi morfologica e morfometrica è il Ematossilina e eosina (H & E) macchia bichromic. Il ematossilina colora i nuclei di un viola intenso. colorazione nucleare è di contrasto con eosina (rosa / rosso), che colora strutture eosinofili, come le miofibre nel citoplasma.

  1. Completamente asciugare diapositive congelati con sezioni per 10 - 15 minuti a temperatura ambiente, presentare le diapositive in un vassoio di colorazione, e mettere il vassoio in un trogolo colorazione.
  2. Colorare per 1 min con ematossilina.
  3. Posare il trogolo colorazione sotto un piuttosto debole getto d'acqua di rubinetto per 10 minuti per lavare l'ematossilina.
  4. Immergere i vetrini per 5 min in etanolo al 95%, se verrà utilizzata una soluzione alcolica di eosina (saltare til passo in caso di una soluzione acquosa eosina).
  5. Controcolorare per 1 min con la soluzione eosina.
  6. Risciacquare con acqua per eliminare soluzione eosina eccessivo.
    Nota: tempistica ottimale della colorazione sia con ematossilina eosina o dovrebbe essere definito per ogni nuovo lotto.
  7. Disidratare i campioni in una serie graduata di etanolo: 50% e 70% (alcuni secondi ciascuno). Rapidamente immergere in 95% etanolo, seguito da 2 variazioni 100% di etanolo, 5 min ciascuna.
  8. Pioggia in 2 cambi di xilene, ogni 5 minuti o più. Questa operazione deve essere effettuata sotto una cappa chimica.
  9. Montare i vetrini con un mezzo di montaggio xilene a base, applicando alcune gocce di mezzo di montaggio sul vetrino e coprire con coprioggetto. Il mezzo di montaggio può essere applicato anche al coprioggetto e il vetrino messo sul vetrino.
    1. Evitare la formazione di bolle d'aria tra il vetrino e il vetrino. Per eliminare le bolle d'aria, mantenere la slitta verticale (dopo il montaggio) e spremere l'eccesso momedia unting e bolle d'aria premendo leggermente sul vetrino con una pinza smussato (o uno strumento simile smussata).
  10. Mantenere i vetrini sotto il cofano per alcune ore o durante la notte per lasciare che il xilene evaporare completamente prima di procedere all'analisi.
  11. Eseguire l'analisi morfologica e morfometrica delle sezioni muscolari rigeneranti H & E-colorati utilizzando immagini seriali non sovrapposte di almeno una intera sezione del muscolo per il mouse. Catturare immagini con un microscopio in campo chiaro, con 20X di ingrandimento.
    Nota: Si consiglia un numero minimo di 5 topi per ottenere significatività statistica delle misurazioni.
    Nota: il software di analisi immagine è disponibile per questo scopo, come ad esempio il download gratuito del software ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

H & E colorazione permette la valutazione della morfologia del processo di rigenerazione in punti temporali specifici durante la rigenerazione del muscolo scheletrico. La Figura 3 mostra l'analisi andamento temporale effettuata su muscoli TA feriti di topi wild type. Muscoli sono stati isolati a 3, 7, 15, e 30 giorni dopo l'iniezione CTX, come schematizzato in Figura 3A. Immagini rappresentativi di sezioni trasversali H & E-colorate mostrano le dinamiche di riparazione del muscolo scheletrico nel tempo (Figura 3B-E). Al giorno 3 dopo la lesione, l'architettura strutturale del muscolo è completamente distrutto, e sia degenerata miofibre (area necrotica) e mononucleate cellule sono chiaramente visibili (Figura 3B). Questo gruppo eterogeneo di cellule consiste principalmente di cellule transitori amplificazione satellitari (mioblasti), cellule infiammatorie reclutati dal sangue 11 e interstiziale e cellule endoteliali che partipare al processo di rigenerazione, che viene attivato nel sito di lesione. In questo contesto, nuove miofibre rigeneranti sono generati per fusione e differenziazione dei mioblasti. La caratteristica principale della zona rigenerante è la presenza di piccole miofibre basofili con nuclei centrali e un citoplasma tinto scuro (Figura 3C). In questa fase, infiammazione è ancora visibile, anche se diminuisce progressivamente. La dimensione di miofibre rigeneranti aumenta nel tempo, dando luogo ad eosinofili rigenerata miofibre caratterizzati da nuclei centrali (Figura 3D, E). Le miofibre rigenerate sono visibili nelle fasi successive di rigenerazione e fino alla fine del processo. Le miofibre sani risultano fortemente organizzata e vicini tra loro, con un citoplasma rosa e con i nuclei poste alla periferia delle fibre, sotto il sarcolemma. Queste miofibre sono di solito presenti lontano dal sito di iniezione CTX e lesioni, e sono più rarely rappresentano aree in cui la rigenerazione è definitivamente completato. Infatti, fibre rigenerate sono caratterizzati dalla presenza di nuclei centrali che si muovono verso la periferia solo diversi mesi dopo la lesione.

Le immagini digitali delle sezioni muscolari colorate vengono catturati aggiungendo le barre di scala per la calibrazione spaziale, che è necessario misurare con precisione le zone di interesse delineando i contorni delle zone interessate. La misurazione della sezione trasversale myofiber (CSA) è un'analisi morfometrica affidabile, che è ampiamente utilizzato per quantificare le differenze nella tendenza di rigenerazione tra i diversi gruppi di topi. Questa analisi richiede la misurazione delle superfici di miofibre centralmente nucleati, di cui almeno 500 e fino a 1000 fibre per sezione. Sia la media del rigenerante e aree miofibre rigenerate e la distribuzione gaussiana di queste aree sono indicatori della proc rigenerazioneess. Aumento CSA myofiber è generalmente associata ad una risposta rigenerativa migliorata e / o accelerata. Al contrario, imperfetto della rigenerazione è associato con una diminuzione della CSA. Qui, abbiamo riportato l'analisi myofiber CSA, indicato come sia alla media (Figura 3F) e la distribuzione (Figura 3G) di myofiber CSA in diversi momenti. Tale analisi evidenzia come la distribuzione delle aree myofiber cambia nel tempo e di come gli spostamenti verso CSA fibre di maggiori dimensioni come il processo di rigenerazione. Procede

Figura 1
Figura 1. iniezioni intramuscolari e isolamento del muscolo tibiale. A. Iniezione intramuscolare di cardiotossina nel muscolo tibiale anteriore. B. Rimozione di fascia muscolare. La freccia bianca indica la pinzetta sottile a punta che pizzicare il muscolo per rimuovere °e fascia. C. L'immagine in alto mostra la posizione anatomica del tendine distale TA. La foto in basso mostra come sollevare il TA e rimuoverlo evitando danni muscolari. D. foto a sinistra: il TA è alzato tirando il tendine distale verso l'alto. La freccia bianca indica il distale del tendine EDL. Immagine a destra: tenendo il tendine con una pinza, il bordo superiore del TA viene tagliato sotto il ginocchio. La freccia bianca indica il sito di taglio. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. fresca congelamento muscolare e Criostato sezionamento di muscoli congelati. A. Tecnica di inclusione muscolare fresca in gomma adragante. Il muscolo TA è immerso nella gomma del tendine, con circa 3/4 esterno emantenuto in posizione perpendicolare rispetto al sughero. Immagini B. rappresentativi del procedimento per criostato sezionamento. Il tappo viene introdotto in una piccola quantità di congelamento composto sul stub campione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Analisi delle Corso di rigenerazione muscolare scheletrico. Schema A. Sperimentale di lesioni muscolo scheletrico acuta. BE. immagini rappresentativi di sezioni ematossilina e eosina macchiato di cardiotossina (CTX) -treated muscoli a giorni indicati dopo l'infortunio. B. La linea continua nera (sul lato sinistro della figura), racchiude una coppia di fibre necrotiche, probabilmente invaso da cellule infiammatorie. La linea tratteggiata (lato destrodel quadro) segna una superficie di infiltrarsi cellule mononucleate. C. Un singolo myofiber immature con nucleo centrale è indicato dal cerchio nero. DE. Grandi miofibre eosinofili rigenerati, con nuclei centrali sono contrassegnati da cerchi neri. Barre di scala rappresentano 100 mm. F. media dei valori centralmente nucleate dimensioni myofiber nelle sezioni muscolari TA. I valori sono media ± SEM, 5 topi / gruppo. G. myofiber sezione trasversale distribuzione zona (CSA) a 6, 15, e 30 giorni dopo l'iniezione CTX. I valori sono media ± SEM, 5 topi / gruppo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Qui, descriviamo un protocollo per indurre lesioni acute nel muscolo scheletrico (ovvero, l'iniezione intramuscolare di CTX). È ampiamente usato come un potente strumento per studiare la dinamica di rigenerazione muscolare in vivo. Iniezione CTX induce la degenerazione delle fibre muscolari, che è causato dalla depolarizzazione della sarcolemma e la contrazione delle fibre 12, e innesca la cascata di eventi che conduce alla rigenerazione muscolare. I muscoli scheletrici sono sezionati in punti temporali desiderati dopo l'iniezione e lesioni, secondo le esigenze sperimentali, e utilizzati per successive analisi istologiche. I muscoli sezionati possono sia essere congelati, dopo l'iscrizione nei media crio-protettivo, o inclusi in paraffina. Tuttavia, queste procedure richiedono una fase di pre-fissazione con paraformaldeide, che può generare artefatti e può eventualmente influenzare le analisi successive. Il congelamento direttamente il tessuto può evitare questo problema. Da segnalare, moltianticorpi primari lavorano esclusivamente o in modo più efficace sulle sezioni muscolari congelati freschi 13, il che rende questa procedura più affidabile. L'analisi morfometrica viene di solito effettuata su esperimenti sviluppo nel tempo, che consentono la valutazione delle differenze nei processi di rigenerazione tra gruppi di topi con la stessa età e con specifiche mutazioni genetiche e / o trattamenti farmacologici. Anche se il protocollo di danno CTX-indotta è altamente riproducibile per sé, una possibile limitazione è dovuta alla variabilità operatore dipendente dell'iniezione CTX. Per superare questa limitazione, è preferibile che l'intero esperimento corso volta che viene eseguita dallo stesso operatore.

L'entità della rigenerazione muscolare può essere quantificata come percentuale di fibre sane, aree di necrosi e infiammazione, e rigenerante e aree rigenerati oltre la superficie totale. Tuttavia, questo approccio è usato soprattutto quando si studiano eventi di danno cronico, come in distrofici mi mdxce, piuttosto che in modelli di trauma acuto. Infatti, mentre i muscoli distrofici sono caratterizzati da eventi asincroni di degenerazione e rigenerazione, lesione acuta è seguita da eventi ben definiti e conseguenti. Una limitazione di queste analisi, che richiedono l'identificazione empirica delle caratteristiche morfologiche descritte sopra, è che essi non sono completamente imparziale. Per supportare le conclusioni sperimentali, l'analisi morfologica deve sempre essere completata con ulteriori analisi, come l'analisi di immunofluorescenza di marcatori molecolari specifici, a sostegno delle conclusioni sperimentali. Per questa ragione, si preferisce utilizzare analisi parallela per interpretare inequivocabilmente i risultati. Per esempio, miofibre rigeneranti sono macchiati positivamente per la catena pesante embrionale miosina (eMyHC) che si esprime in particolare in fibre muscolari di nuova formazione. Così, la quantificazione di miofibre eMyHC macchiati può essere eseguita side-by-side con l'analisi morfologica.

L'analisi CSA è una quantificazione più affidabile e può essere effettuata sia su sezioni H colorati con EE o su sezioni muscolari colorate con laminina, che segna il bordo delle fibre muscolari; quantificazione viene eseguita utilizzando macro appropriate di ImageJ, come descritto sopra. In entrambi i casi, è sempre necessario valutare prima la qualità delle sezioni e di escludere aree di tessuto che appaiono deformate o arricciate.

Accanto alle analisi morfologiche dei tessuti, sezioni H colorati con EE consentono l'identificazione di altre caratteristiche specifiche, come la presenza di fibrosi e / o di tessuto adiposo. In effetti, la fibrosi deriva dalla eccessivo accumulo di matrice extracellulare che si verifica sia se la rigenerazione è compromessa o in malattie croniche 14. Infatti, l'accumulo di matrice extracellulare è visibile come materiale pallido deposita tra le miofibre rigenerate in colorazione H & E-istologico. Vari cicli di iniezione CTX possono essere usati to malattia cronica mimica, in cui le fibre muscolari subiscono ondate di degenerazione e rigenerazione e tessuto cicatriziale si accumula aberrante. Tuttavia, i protocolli più affidabili sono a disposizione per indurre la fibrosi muscolare 15, e specifica colorazione istologica possono essere eseguite per identificare e quantificare queste strutture, come ad esempio di Masson tricromica o Sirius Red colorazione. Formazione di tessuto adiposo è chiaramente visibile nelle sezioni H colorati con EE come strutture bianche arrotondate tra le miofibre, dando un'indicazione importante la presenza di tessuto adiposo, che è quantificato mediante Oil Red colorazione. Infine, sezioni muscolari scheletriche ottenuti seguendo il protocollo descritto può essere utilizzato per eseguire l'analisi di immunofluorescenza utilizzando anticorpi e protocolli specifici.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica SIGMA ALDRICH C9759
Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G x 8 mm - Da 0.3 mL BD 324826
Tragacanth Gum MP BIOMEDICALS,LLC 104792
2-Methylbutane (Isopentane) SIGMA ALDRICH 78-78-4.
OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat Bio-optica  05-9801
Feather Microtome Blade S35 Bio-optica  01-S35
Glass Slide Superfrost Plus Menzel-Gläser 09-OPLUS
Dumon #5 Mirror Finish Forceps  2BIOLOGICAL INSTRUMENTS 11251-23
Scissors Straight Sharp/Sharp 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS 15024-10
Scissors Noyes Straight 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS 15012-12
Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10.5 cm 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS 14094-11
Eukitt Bio-optica 09-00100
Slide Coverslip BIOSIGMA VBS651
Xylene SIGMA ALDRICH 214736
Ethanol 100% sigma-Aldrich 02860-2.5L
Hematoxyline J.T. BAKER 3873
Eosin SIGMA ALDRICH HT110116
Cryostat LEICA CM3050 S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35, (8), 1151-1156 (2003).
  2. Roca, I., Requena, J., Edel, M. J., Alvarez-Palomo, A. B. Myogenic Precursors from iPS Cells for Skeletal Muscle Cell Replacement Therapy. J Clin Med. 4, (2), 243-259 (2015).
  3. Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, (6), 329-340 (2013).
  4. Dumont, N. A., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Intrinsic and extrinsic mechanisms regulating satellite cell function. Development. 142, (9), 1572-1581 (2015).
  5. Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J Appl Physiol. 91, (1985), 534-551 (1985).
  6. Saclier, M., et al. Differentially activated macrophages orchestrate myogenic precursor cell fate during human skeletal muscle regeneration. Stem Cells. 31, (2), 384-396 (2013).
  7. Pillon, N. J., Bilan, P. J., Fink, L. N., Klip, A. Cross-talk between skeletal muscle and immune cells: muscle-derived mediators and metabolic implications. Am J Physiol Endocrinol Metab. 304, (5), E453-E465 (2013).
  8. Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14, (12), 1062-1072 (2013).
  9. Costamagna, D., Costelli, P., Sampaolesi, M., Penna, F. Role of Inflammation in Muscle Homeostasis and Myogenesis. Mediators Inflamm. 2015, (2015).
  10. Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84, (1), 209-238 (2004).
  11. Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. J Exp Med. 204, (5), 1057-1069 (2007).
  12. Chang, C. C., Chuang, S. T., Lee, C. Y., Wei, J. W. Role of cardiotoxin and phospholipase A in the blockade of nerve conduction and depolarization of skeletal muscle induced by cobra venom. Br J Pharmacol. 44, (4), 752-764 (1972).
  13. Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
  14. Mann, C. J., et al. Aberrant repair and fibrosis development in skeletal muscle. Skelet Muscle. 1, (1), (2011).
  15. Pessina, P., et al. Novel and optimized strategies for inducing fibrosis in vivo: focus on Duchenne Muscular Dystrophy. Skelet Muscle. 4, (1), 7 (2014).
Induzione di acuta muscolo scheletrico Rigenerazione da cardiotossina Injection
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guardiola, O., Andolfi, G., Tirone, M., Iavarone, F., Brunelli, S., Minchiotti, G. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J. Vis. Exp. (119), e54515, doi:10.3791/54515 (2017).More

Guardiola, O., Andolfi, G., Tirone, M., Iavarone, F., Brunelli, S., Minchiotti, G. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J. Vis. Exp. (119), e54515, doi:10.3791/54515 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter