Summary

אינדוקציה של התחדשות שריר שלד החריף ידי Cardiotoxin הזרקה

Published: January 01, 2017
doi:

Summary

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט להניע התחדשות שרירי שלד חריפה בעכברים בוגרים ומניפולציות הבאות של השרירים, כגון לנתיחה, מקפיא, חיתוך, מכתים שיגרתי, וניתוח שטח החתך myofiber.

Abstract

התחדשות שריר שלד היא תהליך פיסיולוגי המתרחש שרירי שלד מבוגרים בתגובת פציעה או מחלה. פגיעה הנגרמת חריפת התחדשות שריר שלד היא בשימוש נרחב, מערכת מודל רבה עצמה כדי לחקור את האירועים מעורבים התחדשות שרירים, כמו גם את מנגנוני שחקנים שונים. אכן, ידע מפורט של תהליך זה הוא חיוני להבנה טובה יותר של מצבים פתולוגיים שמובילים ניוון שרירי שלד, וזה מסייע בזיהוי אסטרטגיות טיפוליות ממוקדות חדשות. העבודה הנוכחית מתארת ​​פרוטוקול מפורט לשחזור להניע התחדשות שרירי שלד חריפה בעכברים באמצעות זריקה תוך שרירית אחת של cardiotoxin (CTX). CTX שייך למשפחת מרעלים ארס נחשים וגורם myolysis של myofibers, אשר בסופו של דבר מעורר את אירועי התחדשות. הדינמיקה של התחדשות שריר שלד מוערכת על ידי ניתוח היסטולוגית סעיפי שריר. הפרוטוקול גםממחיש את הפרוצדורות עבור לנתח, מקפיא, חיתוך השריר הקדמי tibialis, כמו גם מכתים Hematoxylin & Eosin שגר כי נעשה שימוש נרחב לניתוח מורפולוגיים morphometric הבא.

Introduction

שרירי שלד מבוגרים יונק נוצרים על ידי קבוצות של fascicules של תאי שריר multinucleated (myofibers) כי הם מיוחדים עבור התכווצות. כל myofiber הוא syncytium מוארך, מוקף sarcolemma (קרום plasmatic) ו במיופיברילים המכיל, אשר עשויים מחלבונים התכווצות מאורגן קבוע וחוזר (סיבי אקטין ו שרירן). בהבגרות ובתנאים המנוחים, שרירי שלד יש תחלופה נמוכה מאוד של myonuclei שלהם 1; ואכן, myonuclei, אשר ממוקמים בפריפריה של myofiber, תחת sarcolemma, נעצרים בשלב G0 של מחזור התא אינם מסוגלים להתרבות 1,2.

יש שרירי השלד יכולת מופלאה להתחדש בעקבות נזקים והגיע הומאוסטזיס לאחר מספר אירועים של שיפוץ רקמות שאינן קשורות באופן הדוק זה לזה. לאחר פציעה או טראומה חריפה, ניוון מושרה, ואחריו תהליכי התחדשותשכוללים אוכלוסיות תאים שונות, כולל אוכלוסיית תושב תאי שריר, תאי הלווין (SCS). ואכן, בהעדר כל לגירויים סביבתיים, תאי הלווין נמצאים במצב שקט וממוקמים בתוך גומחה בין sarcolemma ואת 3,4 lamina הבסיס. בעקבות פציעה או מחלה, גיל להיות מופעל, להתרבות, נודד אל האזורים שנפגעו, ובסופו של דבר להבדיל, והוליד להרכיב חדש myofibers 5. גיל הופעל להקים הצטלבות עם אוכלוסיות תאים שונות, תאים דלקתיים בעיקר, אשר מגויסות באתר של טראומת 6-8. הצטלבות זו מאפשרת לתאים אחרי פרדיגמה מוסדר שבו אותות מולקולריים לנהוג שינויים מבניים, המוביל בסופו של דבר הומאוסטזיס 9. מלבד גיל, תאים דלקתיים ביניים, תהליכי אנגיוגנזה, ואירועים מחדש עצבוב מעורב גם, מתנהג באופן מתואם כדי לתקן המאורגן הזה מאוד שלמבנה pecialized.

יש עניין רב בלימוד היבטים שונים של התחדשות שריר שלד, לא רק להבין את הפיסיולוגיה של השריר, אלא גם כדי לשפר אסטרטגיות טיפוליות הדורשות ידע עמוק של התהליך כולו. גישות ניסוייות קיימות מספר כרגע ללמוד את זהותו ותפקידו של אוכלוסיות תאים שונות, מסלולי איתות, ואת המנגנונים המולקולריים המעורבים. מודלים עכבר של פגיעה חריפה מייצגים כלי רב עוצמה כדי לחקור היבטים רבים של תהליך זה. שונים השתמש בטכניקות נפוצות כדי לגרום ניזק לשרירים חריף מאפשר לחוקרים לעקוב אחר תהליך ההתחדשות in vivo, מן בשלבים מוקדמים מאוד עד סוף התהליך. פרוטוקול זה מתאר את השלבים מן זריקה תוך שרירית של cardiotoxin הנגזרות ארס נחשים (CTX), אשר גורם myolysis ומפעיל את תהליך השיקום, עד מועד ניתוח של דגימות רקמה. בעקבות הזרקת CTX, מילce אפשר להקריב בנקודות זמן שונות בהתאם לדרישות ניסוי, ואת שרירי השלד יכולים להיות גזור ומעובד לניתוח נוסף. לבסוף, אנו מתארים את פרוטוקול מכתים סעיפי רקמות לבצע תצפיות מורפולוגיים ניתוחים כמותיים בסיסיים. פרוטוקול זה מאפשר לחקר התחדשות שרירי השלד חריפה in vivo באופן מאוד לשחזור 10.

Protocol

כל הניסויים נערכו בהתאם קפדן עם ההנחיות המוסדיות עבור מחקר בבעלי חיים ואושר על ידי המחלקה לבריאות הציבור, בריאות בעלי החיים, תזונה ובטיחות המזון של המשרד האיטלקי בריאות בהתאם לחוק על ניסויים בבעלי חיים. נהלים נקע בצוואר רחם עשויים להשתנות ממוסד למוסד מבוסס על IACUC או הדרישות המק?…

Representative Results

צביעת H & E מאפשרת ההערכה של המורפולוגיה של תהליך ההתחדשות בנקודות זמן ספציפי במהלך רגנרציה שרירי שלד. איור 3 מציג את הניתוח כמובן הזמן שבוצע על שרירי ת"א נפצעו של עכברי סוג ברים. שרירים בודדו בבית 3, 7, 15, ו -30 ימים לאחר הזרקת CTX, כמו schematized <str…

Discussion

כאן אנו מתארים פרוטוקול לגרום לפגיעה חריפה בשרירי השלד (כלומר, זריקה תוך שרירית של CTX). זה נעשה שימוש נרחב ככלי רב עוצמה כדי ללמוד את הדינמיקה של התחדשות שריר השלד in vivo. הזרקת CTX גורמת לניוון של סיבי שריר, אשר נגרם על ידי שלילת הקוטביות של sarcolemma ואת ההתכווצות של…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank the Animal House and the Integrated Microscopy Facilities of IGB-CNR. This work has benefited from research funding from the European Community’s Seventh Framework Programme in the project ENDOSTEM (Activation of vasculature associated stem cells and muscle stem cells for the repair and maintenance of muscle tissue, grant agreement number 241440), the Italian Ministry of Education-University-Research (MIUR-PRIN2 010-2011) to G.M. and S.B. and PON Cluster IRMI to G.M., and the CARIPLO foundation to G.M. and S.B.

Materials

Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica SIGMA ALDRICH C9759
Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G X 8 mm – Da 0,3 ml BD 324826
Tragacanth Gum MP BIOMEDICALS,LLC 104792
2-Methylbutane (Isopentane) SIGMA ALDRICH 78-78-4.
OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat Bio-optica  05-9801
Feather Microtome Blade S35 Bio-optica  01-S35
Glass Slide Superfrost Plus Menzel-Gläser 09-OPLUS
Dumon #5 Mirror Finish Forceps  2BIOLOGICAL INSTRUMENTS 11251-23
Scissors Straight Sharp/Sharp 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS 15024-10
Scissors Noyes Straight 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS 15012-12
Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10,5 Cm 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS 14094-11
Eukitt Bio-optica 09-00100
Slide Coverslip BIOSIGMA VBS651
Xylene SIGMA ALDRICH 214736
Ethanol 100% sigma-Aldrich 02860-2.5L
Hematoxyline J.T. BAKER 3873
Eosin SIGMA ALDRICH HT110116
Cryostat LEICA CM3050 S

References

  1. Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35 (8), 1151-1156 (2003).
  2. Roca, I., Requena, J., Edel, M. J., Alvarez-Palomo, A. B. Myogenic Precursors from iPS Cells for Skeletal Muscle Cell Replacement Therapy. J Clin Med. 4 (2), 243-259 (2015).
  3. Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
  4. Dumont, N. A., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Intrinsic and extrinsic mechanisms regulating satellite cell function. Development. 142 (9), 1572-1581 (2015).
  5. Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J Appl Physiol. 91 (1985), 534-551 (1985).
  6. Saclier, M., et al. Differentially activated macrophages orchestrate myogenic precursor cell fate during human skeletal muscle regeneration. Stem Cells. 31 (2), 384-396 (2013).
  7. Pillon, N. J., Bilan, P. J., Fink, L. N., Klip, A. Cross-talk between skeletal muscle and immune cells: muscle-derived mediators and metabolic implications. Am J Physiol Endocrinol Metab. 304 (5), E453-E465 (2013).
  8. Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
  9. Costamagna, D., Costelli, P., Sampaolesi, M., Penna, F. Role of Inflammation in Muscle Homeostasis and Myogenesis. Mediators Inflamm. 2015, (2015).
  10. Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).
  11. Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. J Exp Med. 204 (5), 1057-1069 (2007).
  12. Chang, C. C., Chuang, S. T., Lee, C. Y., Wei, J. W. Role of cardiotoxin and phospholipase A in the blockade of nerve conduction and depolarization of skeletal muscle induced by cobra venom. Br J Pharmacol. 44 (4), 752-764 (1972).
  13. Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
  14. Mann, C. J., et al. Aberrant repair and fibrosis development in skeletal muscle. Skelet Muscle. 1 (1), (2011).
  15. Pessina, P., et al. Novel and optimized strategies for inducing fibrosis in vivo: focus on Duchenne Muscular Dystrophy. Skelet Muscle. 4 (1), 7 (2014).

Play Video

Cite This Article
Guardiola, O., Andolfi, G., Tirone, M., Iavarone, F., Brunelli, S., Minchiotti, G. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J. Vis. Exp. (119), e54515, doi:10.3791/54515 (2017).

View Video