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Developmental Biology

Cardiotoxin इंजेक्शन द्वारा तीव्र कंकाल की मांसपेशी उत्थान की प्रेरण

doi: 10.3791/54515 Published: January 1, 2017

Summary

यह पांडुलिपि वयस्क चूहों और इस तरह के विच्छेदन के रूप में की मांसपेशियों के बाद जोड़तोड़, ठंड, काटने, दिनचर्या धुंधला हो जाना, और myofiber पार के अनुभागीय क्षेत्र के विश्लेषण में तीव्र कंकाल की मांसपेशी उत्थान के लिए प्रेरित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है।

Abstract

कंकाल की मांसपेशी उत्थान एक शारीरिक प्रक्रिया है कि चोट या बीमारी के जवाब में वयस्क कंकाल की मांसपेशियों में होता है। गंभीर चोट प्रेरित कंकाल की मांसपेशी उत्थान पेशी उत्थान के साथ ही तंत्र और अलग अलग खिलाड़ियों में शामिल घटनाओं का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया, शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है। दरअसल, इस प्रक्रिया की एक विस्तृत ज्ञान रोग की स्थिति यह है कि कंकाल की मांसपेशी अध: पतन के लिए नेतृत्व का एक बेहतर समझ के लिए आवश्यक है, और यह नए लक्षित चिकित्सीय रणनीतियों की पहचान करने में मदद करता है। वर्तमान कार्य (CTX) cardiotoxin का एक भी इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के माध्यम से चूहों में तीव्र कंकाल की मांसपेशी उत्थान के लिए प्रेरित करने के लिए एक विस्तृत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल का वर्णन है। CTX सांप के जहर विषाक्त पदार्थों के परिवार का है और myofibers की myolysis, जो अंततः उत्थान की घटनाओं से चलाता है का कारण बनता है। कंकाल की मांसपेशी उत्थान की गतिशीलता पेशी वर्गों के histological विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया है। प्रोटोकॉल भी, विदारक ठंड, और tibialis पूर्वकाल मांसपेशी, साथ ही दिनचर्या Hematoxylin और Eosin धुंधला कि व्यापक रूप से बाद में रूपात्मक और morphometric विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है को काटने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को दिखाता है।

Introduction

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स्तनधारी वयस्क कंकाल की मांसपेशियों multinucleated मांसपेशियों की कोशिकाओं (myofibers) कि संकुचन के लिए विशेष कर रहे हैं की fascicules के समूहों से बनते हैं। प्रत्येक myofiber एक लम्बी संकोश, sarcolemma (Plasmatic झिल्ली) और युक्त पेशीतंतुओं, जो नियमित रूप से और बार बार संगठित सिकुड़ा प्रोटीन (actin और मायोसिन तंतु) के बने होते हैं से घिरा हुआ है। वयस्क जीवन में और आराम की स्थिति में, कंकाल की मांसपेशियों उनकी myonuclei 1 का एक बहुत कम कारोबार किया है; दरअसल, myonuclei, जो sarcolemma तहत myofiber की परिधि में स्थित हैं, कोशिका चक्र के G0 चरण में गिरफ्तार किया गया और 1,2 पैदा करने में असमर्थ रहे हैं।

कंकाल की मांसपेशियों क्षति के बाद, ऊतक remodeling के कई घटनाओं है कि कसकर एक-दूसरे से जुड़े हुए हैं के बाद homeostasis तक पहुंचने को पुनर्जीवित करने के लिए अजीब क्षमता है। एक गंभीर चोट या आघात के बाद, अध: पतन, प्रेरित उत्थान प्रक्रियाओं द्वारा पीछा किया जाता हैकि मांसपेशियों की कोशिकाओं के एक निवासी की आबादी सहित विभिन्न सेल आबादी, शामिल है, उपग्रह कोशिकाओं (एससी)। दरअसल, किसी भी पर्यावरण उत्तेजनाओं के अभाव में, उपग्रह कोशिकाओं एक मौन राज्य में हैं और sarcolemma और बेसल पटल 3,4 के बीच एक विशेष जगह में स्थित हैं। एक चोट या बीमारी, अनुसूचित जाति बनने सक्रिय, क्षतिग्रस्त क्षेत्रों की ओर पलायन पैदा करना, और अंत में अंतर है, नव बनाने myofibers 5 को जन्म देने के बाद। सक्रिय अनुसूचित जाति अलग सेल आबादी, मुख्य रूप से भड़काऊ कोशिकाओं है, जो आघात 6-8 की साइट में भर्ती कर रहे हैं के साथ पार बात की स्थापना। इस पार से बात की कोशिकाओं को एक विनियमित प्रतिमान है जिसके द्वारा आणविक संकेतों संरचनात्मक संशोधनों ड्राइव का पालन करने के लिए, अंत में 9 homeostasis के लिए अग्रणी अनुमति देता है। अनुसूचित जाति, भड़काऊ और मध्य कोशिकाओं, एन्जियोजेनिक प्रक्रियाओं, और फिर से तंत्रिका वितरण की घटनाओं के अलावा भी शामिल कर रहे हैं, एक समन्वित तरीके से अभिनय की मरम्मत के लिए इस बेहद संगठित और एसpecialized संरचना।

वहाँ न केवल मांसपेशियों के शरीर क्रिया विज्ञान को समझने के लिए, लेकिन यह भी चिकित्सकीय रणनीति है कि पूरी प्रक्रिया का गहरा ज्ञान की आवश्यकता होती है में सुधार करने के कंकाल की मांसपेशी उत्थान के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने में बहुत रुचि है। कई प्रयोगात्मक दृष्टिकोण वर्तमान में पहचान और अलग सेल आबादी, संकेत दे रास्ते, और आणविक शामिल तंत्र के समारोह में अध्ययन करने के लिए उपलब्ध हैं। गंभीर चोट के माउस मॉडल इस प्रक्रिया के कई पहलुओं की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रतिनिधित्व करते हैं। विभिन्न सामान्यतः तकनीकों का इस्तेमाल किया प्रेरित करने के लिए तीव्र मांसपेशियों की क्षति शोधकर्ताओं प्रक्रिया के अंत करने के लिए बहुत प्रारंभिक दौर से विवो में उत्थान की प्रक्रिया का पालन करने की अनुमति देते हैं। इस प्रोटोकॉल सांप के जहर व्युत्पन्न cardiotoxin इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन (CTX), जो myolysis लाती है और ऊतकों के नमूनों के विश्लेषण के लिए ऊपर उत्थान की प्रक्रिया से चलाता है, से कदम का वर्णन है। CTX इंजेक्शन के बाद, एमआईसीई प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर अलग-अलग समय बिंदुओं पर बलिदान किया जा सकता है, और कंकाल की मांसपेशियों विच्छेदित और आगे के विश्लेषण के लिए कार्रवाई की जा सकती है। अंत में, हम ऊतक वर्गों के धुंधला प्रोटोकॉल रूपात्मक टिप्पणियों और बुनियादी मात्रात्मक विश्लेषण प्रदर्शन करने का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से 10 विवो में तीव्र कंकाल की मांसपेशी उत्थान के अध्ययन के लिए अनुमति देता है।

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Protocol

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सभी प्रयोगों पशु अनुसंधान के लिए संस्थागत दिशा निर्देशों के साथ सख्त अनुसार आयोजित और पशु प्रयोगों पर कानून के अनुसार सार्वजनिक स्वास्थ्य, पशु स्वास्थ्य, पोषण और स्वास्थ्य के इतालवी मंत्रालय के खाद्य सुरक्षा विभाग द्वारा अनुमोदित किया गया। सरवाइकल अव्यवस्था प्रक्रियाओं IACUC या इसके समकक्ष आवश्यकताओं के आधार पर संस्था से संस्था के लिए भिन्न हो सकते हैं।

1. tibialis पूर्वकाल की मांसपेशी में Cardiotoxin इंजेक्शन

  1. प्रक्रिया शुरू करने से पहले बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में या पानी में cardiotoxin शेयर समाधान गिराए द्वारा एक 10 कार्य cardiotoxin (CTX) का समाधान माइक्रोन के लिए तैयार करें।
    नोट: CTX 1 मिलीग्राम / एमएल पानी में घुलनशील है। एक 70 माइक्रोन के शेयर समाधान तैयार है। अशेष और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। CTX इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल लगभग 7,000 दा की आणविक वजन होने cardiotoxins का एक मिश्रण है।
    चेतावनी: इसे पहनने के लिए सुझाव दिया हैडबल दस्ताने, एक स्वच्छता मुखौटा है, और सुरक्षा चश्मा और समाधान के साथ किसी भी संपर्क से बचने के लिए बहुत सावधान रहना होगा (सुरक्षा चश्मा करने के लिए वैकल्पिक रूप से, यह एक डाकू के तहत काम करने के लिए सिफारिश की है), तो भी पतला था।
  2. ketamine और xylazine (80 मिलीग्राम / किग्रा और / शरीर द्रव्यमान का किलो 10 मिलीग्राम) या अन्य अनुमोदित उपलब्ध संवेदनाहारी के intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा चूहों anesthetize।
  3. माउस चेहरे के साथ, स्प्रे 70% इथेनॉल के साथ हिंद अंग। Tibialis पूर्वकाल (टीए) मांसपेशी का सही स्थान, एक छुरी की मदद से कल्पना करने के लिए, कम पैर का अग्र भाग में दूर बाल काट घुटने के नीचे।
    नोट: टीए मांसपेशी टिबिया के समीपस्थ शरीर से पैदा होती है, नीचे की हड्डी के लिए पार्श्व जा रहा है और टखने में समाप्त। अपने लंबे कण्डरा टखने भर में पैर में फैली हुई है (चित्रा 1 ए देखें)।
  4. ड्रा सिरिंज में समाधान की ~ 100 μL वापस धीरे धीरे सवार खींच कर।
  5. हवा के बुलबुले निकालें, ईमानदार सिरिंज पकड़े (सुई के साथ ऊपर की ओर)। धीरे सवार नीचे खींचने के लिए और किसी भी हवाई बुलबुले ट्यूब के भीतरी भाग से जुड़ी ऊपर की तरफ आने में मदद करने के लिए सिरिंज के पक्ष में नल। धीरे सवार बड़े हवाई बुलबुले को रिहा करने के लिए दबाएँ। तरल की कुछ बूँदें सुई बाहर आ जाएगा। इस बिंदु पर, cardiotoxin की विषाक्तता दिया, ट्यूब में फिर से तरल लेने और इसे फैलाने के लिए नहीं करने के लिए सुनिश्चित करें।
  6. सिरिंज में समाधान को वापस लेने के लिए जब तक वांछित खुराक तक पहुँच जाता है। प्रत्येक टीए पेशी के लिए CTX समाधान के 20 μL इंजेक्षन।
  7. मार्गदर्शन के रूप में टिबिया हड्डी की स्थिति के बाद घुटने की ओर से कण्डरा द्वारा टीए के केंद्र में सुई डालें। चूंकि टीए एक पतली ऊतक है, बहुत गहरी जा रहा बिना इंजेक्शन प्रदर्शन (सुई 2/3 मिमी गहरी, लगभग एक 10 डिग्री से 20 डिग्री कोण डालें), और मांसपेशियों में ही (चित्रा 1 ए) से परे जा रहा से बचें।
  8. सुई को बाहर खींचने के तुरंत इंजेक्शन के बाद नहीं है, लेकिन इंतजार 2 - रिसाव को रोकने के लिए 3 SCTX की उम्र पेशी से चला जाता है।
  9. प्रक्रिया के बाद, एक गर्म प्लेट (37 डिग्री सेल्सियस) पर पिंजरे जगह जब तक चूहों, जाग रहे हैं संवेदनाहारी के बाद से इस्तेमाल किया और इथेनॉल के शरीर के तापमान को कम करते हैं।

2. tibialis पूर्वकाल अलगाव

नोट: स्नायु प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार cardiotoxin इंजेक्शन के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर अलग किया जा सकता है।

  1. ग्रीवा अव्यवस्था से माउस बलिदान।
  2. 70% इथेनॉल के साथ hindlimbs स्प्रे। प्रक्रिया के दौरान, जानवर एक समर्थन करने के लिए तय किया जा सकता है कि यह रोक कर रखें।
  3. (पैर ऊपर) समीपस्थ कण्डरा के स्तर पर त्वचा में कटौती, त्वचा के नीचे कैंची के ब्लेड में से एक डालें, और त्वचा के ऊपर की तरफ कटौती, घुटने की दिशा में। संदंश की मदद के साथ, त्वचा को खींचने के लिए और पूरी तरह से मांसपेशियों को बेनकाब। ध्यान से त्वचा और हित के क्षेत्र से बालों के सभी को हटा दें।
  4. (ध के साथ धीरे-धीरे बन्द रखो या काटने से प्रावरणी को हटा देंमें नोक चिमटी या टिबिअ (चित्रा 1 बी) के विपरीत पक्ष पर कैंची विदारक) मांसपेशी के चरम परिधि ठीक माइक्रो के साथ। एक बार टूट गया, धीरे पतली-टिप चिमटी की मदद से प्रावरणी हटा; अंतर्निहित मांसपेशियों को नुकसान पहुँचाए से बचें।
    नोट: अन्य मांसपेशियों और अंगों के साथ के रूप में, टीए प्रावरणी (पैर की गहरी प्रावरणी), संयोजी ऊतक की एक पतली शीट कि त्वचा के नीचे गहरे झूठ और है कि आसानी से अंतर्निहित मांसपेशियों को अलग-थलग करने के लिए हटा दिया जाना चाहिए द्वारा कवर किया जाता है।
  5. बाहर का टीए कण्डरा और पैर ऊपर extensor digitorum कण्डरा, जो juxtaposed हैं कल्पना। Extensor digitorum Longus (EDL) मांसपेशी के कण्डरा थोड़ा टीए कण्डरा नीचे स्थित है। वयस्क चूहों के tendons नंगी आंखों से दिखाई दे रहे हैं।
  6. हटाये दो निम्न तकनीक से एक के बाद टीए मांसपेशी:
    1. ठीक सूक्ष्म कैंची विदारक के साथ दोनों tendons कट और उन्हें समीपस्थ पक्ष की ओर खींचने के लिए, holdinजी संदंश के साथ tendons। अलग दो tendons, उन्हें विपरीत दिशाओं में धीरे खींच मांसपेशियों को अलग करने के लिए।
    2. पतली-टिप चिमटी की मदद से, कण्डरा ही (चित्रा 1C, ऊपरी चित्र) नीचे टिप से गुजर रहा extensor digitorum कण्डरा से बाहर का टीए कण्डरा अलग। धीरे अंतर्निहित मांसपेशियों (चित्रा 1C, नीचे तस्वीर) से अलग करने के लिए टीए नीचे चिमटी स्लाइड।
    3. इसे रखने के लिए थोड़ा उठाया, टीए कण्डरा में कटौती पेशी के तहत चिमटी पकड़ो, और धीरे से ही क्षेत्र के नीचे घुटने से जुड़ा हुआ है (चित्रा -1, चित्र बाएं) जब तक ऊपर की ओर खींच। घुटने के नीचे टीए कट, कैंची (चित्रा -1, सही चित्र) के साथ मांसपेशियों के किनारे के बाद।
      नोट: पेशी से थोड़ा पक्षों के साथ जुड़ा रहता है, तो कैंची विदारक इसे अलग करने में मदद करने के लिए ठीक सूक्ष्म उपयोग करें।
      नोट: संदंश आसानी से टीए नीचे फिट नहीं है,यह संभव है कि प्रावरणी पूरी तरह से हटाया नहीं गया है, और यह अभी भी पेशी के शीर्ष पर दिखाई दे रहा हो सकता है। इस मामले में, पूरी तरह से आगे बढ़ने से पहले प्रावरणी को हटा दें।

3. ताजा जमे हुए स्नायु तकनीक

  1. Tragacanth गम या काग का एक टुकड़ा पर एक समान चिपकने वाला ठंड यौगिक (जैसे, इष्टतम काटना तापमान (OCT) यौगिक) की एक छोटी राशि रखें। रिवर्स साइड पर काग का टुकड़ा लेबल ठंड से पहले, यदि आवश्यक हो तो (2A चित्रा)।
  2. आदेश में मांसपेशियों की अनुप्रस्थ वर्गों प्राप्त करने के लिए, बाहर का पट्टा डालने और बाहर पेशी के 3/4 के बारे में छोड़ कर tragacanth गम में टीए सिंक काग के संबंध में एक सीधा स्थिति में पेशी सुनिश्चित करने के लिए (चित्रा 2A)।
  3. एक एल्यूमीनियम सकते भर (वैकल्पिक रूप से, एक धातु कप या एक गिलास बीकर), isopentane के साथ। एक देवर युक्त liqui में isopentane के कर सकते हैं निलंबितडी नाइट्रोजन, तरल नाइट्रोजन सकते में प्रवेश करने की अनुमति नहीं है।
    नोट: isopentane (-150 से -160 डिग्री सेल्सियस) ऊतक का इष्टतम ठंड के लिए उचित तापमान तक पहुँचने की जरूरत है। सही तापमान तक पहुँच जाता है जब कुछ सफेद ठोस कणों कर सकते हैं के तल पर फार्म और isopentane थोड़ा चिपचिपा हो जाता है।
    नोट: ठोस कणों के गठन से पहले नमूना स्थिर नहीं है, के रूप में यह ठंड कलाकृतियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। दूसरी ओर, यदि isopentane पूरी तरह ठोस हो जाता है, यह कमरे के तापमान पर छोड़ जब तक यह thawed है, यकीन है कि कुछ सफेद कणों अभी भी मौजूद हैं बना रही है।
  4. Mixter संदंश का प्रयोग, तेजी से isopentane में पेशी के साथ काग डुबकी, मांसपेशियों में तैनात नीचे की ओर रखते हुए, और जब यह पूरी तरह से तरल में डूब जाता है काग को रिहा करने के लिए सुनिश्चित करें। इस रास्ते में, जबकि नमूना तैरता है, केवल काग के रिवर्स साइड तरल में दिखाई जानी चाहिए।
  5. SA छोड़ दो1 मिनट के लिए isopentane में mple।
  6. Mixter संदंश (या इसी तरह संदंश) का उपयोग करना, मांसपेशियों में ले सकते हैं और कम से कम 2 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन में विसर्जित।
  7. लपेटें नमूनों को व्यक्तिगत रूप से लेबल एल्यूमीनियम पन्नी में और तुरंत उन्हें सूखी बर्फ (-70 डिग्री सेल्सियस) में जगह है, या सीधे उन्हें एक में स्टोर -80 सेल्सियस फ्रीजर।
    नोट: प्रक्रिया के दौरान, कदम से 3.4 से 3.7 के लिए, यह अत्यंत महत्वपूर्ण है सही तापमान बनाए रखने के लिए और (सेल्सियस फ्रीजर -80 स्थानांतरण के दौरान, उदा।) विगलन से नमूनों को रोकने के लिए। अनियंत्रित विगलन और पानी microcrystals कि ऊतक के भीतर मौजूद हैं और अंत में कलाकृतियों के गठन या मांसपेशी फाइबर के टूटने का कारण बनता है की refreezing में बढ़ते तापमान परिणाम (फाइबर के केंद्र में बड़े सफेद छेद के रूप में ऊतक वर्गों पर देखे)।

4. जमे हुए स्नायु की Cryostat सेक्शनिंग

  1. cryostat कक्ष तापमान टी सेटओ -20 -22 डिग्री सेल्सियस के लिए।
  2. नमूना ठूंठ, ब्लेड, और cryostat कक्ष में नमूना रखो, उन्हें कम से कम 30 मिनट के लिए संतुलित करने की इजाजत दी।
  3. ठंड यौगिक (जैसे, अक्टूबर यौगिक) नमूना ठूंठ पर की एक छोटी राशि की जगह और ठंड यौगिक solidifies से पहले नमूना के साथ काग विसर्जित कर दिया। इस बीच में, ब्लेड धारक में ब्लेड जगह है।
  4. ब्लेड धारक (चित्रा 2 बी) के साथ नमूना धारक उन्मुख करने के लिए प्रदान की जाती शिकंजा का उपयोग नमूना और ब्लेड संरेखित करें।
  5. 10 माइक्रोन के लिए खंड मोटाई निर्धारित करें। ऊतक में कटौती करने के लिए आगे बढ़ें। ड्राइव व्हील के प्रत्येक बारी के लिए, नमूना धारक ब्लेड की दिशा में एक नियंत्रित दूरी अग्रिम।
  6. एक ध्रुवीकृत स्लाइड (स्लाइड प्रति 8 से 10 अनुभाग) (चित्रा -2) पर वर्गों रखें।
  7. सेक्शनिंग के बाद, -80 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड की दुकान।
    नोट: नमूना एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहित किया जा सकता है और furthe के लिए पुन: उपयोगआर, सेक्शनिंग अगर ठीक से संभाला और संग्रहीत।

5. नियमित ऊतकीय धुंधला (Hematoxylin और Eosin दाग)

नोट: कई ऊतकीय दाग विश्लेषण के अनुसार पेशी वर्गों पर प्रदर्शन किया जा सकता है। रूपात्मक और morphometric विश्लेषण के लिए एक नियमित ऊतकीय दाग Hematoxylin और eosin (एच एंड ई) bichromic दाग है। hematoxylin नाभिक एक गहरे बैंगनी दाग। परमाणु धुंधला eosin साथ counterstained है (गुलाबी / लाल), जो इस तरह के कोशिका द्रव्य में myofibers रूप इओसिनोफिलिक संरचनाओं, दाग।

  1. पूरी तरह से हवा शुष्क के लिए 10 वर्गों के साथ जमे हुए स्लाइड - कमरे के तापमान पर 15 मिनट, एक धुंधला ट्रे में स्लाइड्स लॉज, और एक धुंधला गर्त में ट्रे डाल दिया।
  2. hematoxylin के साथ 1 मिनट के लिए दाग।
  3. एक काफी कमजोर नल का पानी जेट के तहत धुंधला गर्त निर्धारित करना 10 मिनट hematoxylin बाहर धोने के लिए।
  4. 5 से 95 मिनट में% इथेनॉल के लिए स्लाइड विसर्जित (छोड़ टी eosin के एक शराबी समाधान इस्तेमाल किया जाएगाएक जलीय eosin समाधान के मामले में उसकी सौतेली)।
  5. eosin समाधान के साथ 1 मिनट के लिए Counterstain।
  6. पानी से कुल्ला अत्यधिक eosin समाधान समाप्त करने के लिए।
    नोट: या तो hematoxylin या eosin के साथ धुंधला के इष्टतम समय प्रत्येक नए बैच के लिए परिभाषित किया जाना चाहिए।
  7. एक वर्गीकृत इथेनॉल श्रृंखला में नमूने निर्जलीकरण: 50% और 70% (कुछ सेकंड के प्रत्येक)। तेजी से 95% इथेनॉल में विसर्जित, 100% इथेनॉल में 2 परिवर्तन, 5 मिनट प्रत्येक द्वारा पीछा किया।
  8. xylene के 2 में परिवर्तन, प्रत्येक 5 मिनट या उससे अधिक समय में स्पष्ट है। यह कदम एक रासायनिक हुड के तहत बाहर किया जाना चाहिए।
  9. एक xylene आधारित बढ़ते मध्यम के साथ स्लाइड माउंट, स्लाइड पर बढ़ते मध्यम और एक coverslip के साथ कवर की कुछ बूंदों के आवेदन। बढ़ते मध्यम भी coverslip और coverslip स्लाइड पर डाल करने के लिए लागू किया जा सकता है।
    1. स्लाइड और coverslip के बीच हवा के बुलबुले के गठन से बचें। हवा के बुलबुले को खत्म करने, स्लाइड खड़ी रखने के (बढ़ते के बाद) और अतिरिक्त मो बाहर निचोड़unting मध्यम और धीरे कुंद संदंश (या इसी तरह की एक कुंद उपकरण) के साथ coverslip पर दबाने से हवा के बुलबुले।
  10. या कुछ घंटों के लिए हुड के नीचे स्लाइड रखें रात भर xylene विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ने से पहले पूरी तरह से लुप्त हो जाने के लिए।
  11. माउस के अनुसार कम से कम एक पूरे पेशी खंड के गैर अतिव्यापी सीरियल छवियों का उपयोग करके एच ई-दाग regenerating पेशी वर्गों की रूपात्मक और morphometric विश्लेषण करते हैं। छवियों को एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ कब्जा, 20X बढ़ाई साथ।
    ध्यान दें: 5 चूहों की एक न्यूनतम संख्या माप के सांख्यिकीय महत्व प्राप्त करने के लिए सिफारिश की है।
    नोट: छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर इस तरह के फ्री सॉफ्टवेयर डाउनलोड करें ImageJ के रूप में (http://imagej.nih.gov/ij/) इस उद्देश्य के लिए उपलब्ध है।

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Representative Results

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एच एंड ई धुंधला कंकाल की मांसपेशी उत्थान के दौरान विशिष्ट समय बिंदुओं पर उत्थान की प्रक्रिया की आकृति विज्ञान के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है। चित्रा 3 जंगली प्रकार चूहों के घायल टीए मांसपेशियों पर प्रदर्शन समय के पाठ्यक्रम के विश्लेषण से पता चलता। स्नायु, CTX इंजेक्शन के बाद 3, 7, 15, और 30 दिनों में अलग-थलग कर दिया गया है के रूप में चित्रा 3 ए में schematized। एच एंड ई दाग अनुप्रस्थ वर्गों के प्रतिनिधि चित्र (चित्रा 3 बी-ई) समय के साथ कंकाल की मांसपेशी की मरम्मत की गतिशीलता दिखा। चोट के बाद 3 दिन में पेशी के संरचनात्मक वास्तुकला पूरी तरह से नष्ट हो जाता है, और दोनों degenerated myofibers (परिगलित क्षेत्र) और mononucleated कोशिकाओं स्पष्ट रूप से दिखाई (चित्रा 3 बी) कर रहे हैं। कोशिकाओं की इस विषम समूह मुख्य रूप से क्षणिक amplifying उपग्रह कोशिकाओं (myoblasts), भड़काऊ कोशिकाओं को रक्त 11 से भर्ती, और मध्य और endothelial कोशिकाओं है कि पार्टी के होते हैंउत्थान प्रक्रिया है, जो चोट के स्थल पर शुरू हो रहा है में cipate। इस संदर्भ में, नई regenerating myofibers फ्यूजन और myoblasts के भेदभाव से उत्पन्न कर रहे हैं। Regenerating क्षेत्र की मुख्य विशेषता केन्द्र स्थित नाभिक और एक काले दाग कोशिका द्रव्य (चित्रा 3 सी) के साथ छोटे Basophilic myofibers की उपस्थिति है। इस स्तर पर, सूजन, हालांकि यह उत्तरोत्तर कम हो जाती है, अभी भी दिखाई दे रहा है। Regenerating myofibers के आकार के समय के साथ बढ़ जाती है, इओसिनोफिलिक पुनर्जीवित myofibers केन्द्र स्थित नाभिक (चित्रा 3 डी, ई) की विशेषता को जन्म दे रही है। पुनर्जीवित myofibers उत्थान के बाद के चरणों में है और इस प्रक्रिया के अंत तक दिखाई दे रहे हैं। स्वस्थ myofibers बेहद संगठित और एक दूसरे के करीब दिखाई देते हैं, एक गुलाबी कोशिका द्रव्य के साथ और sarcolemma के तहत फाइबर की परिधि में रखा गया है, नाभिक के साथ। ये आमतौर पर myofibers CTX इंजेक्शन और चोट की साइट से अब तक मौजूद हैं, और वे और अधिक दुर्लभLy क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं जहां उत्थान निश्चित पूरा हो गया है। दरअसल, पुनर्जीवित फाइबर केन्द्र स्थित नाभिक है कि केवल कई महीनों की चोट के बाद परिधि के लिए ले जाने की उपस्थिति की विशेषता है।

दाग पेशी वर्गों के डिजिटल छवियों स्थानिक अंशांकन है, जो आवश्यक है सही रुचि क्षेत्रों की आकृति रूपरेखा द्वारा हित के क्षेत्रों को मापने के लिए के लिए स्केल सलाखों जोड़कर कब्जा कर रहे हैं। myofiber पार के अनुभागीय क्षेत्र (सीएसए) की माप के लिए एक विश्वसनीय morphometric विश्लेषण है, जो व्यापक रूप से चूहों के विभिन्न समूहों के बीच उत्थान प्रवृत्ति में मतभेद यों इस्तेमाल किया जाता है। इस विश्लेषण कम से कम 500 और ऊपर अनुभाग प्रति 1,000 फाइबर सहित, केन्द्र केन्द्रक myofibers के क्षेत्रों की माप की आवश्यकता है। दोनों regenerating की औसत और पुनर्जीवित myofiber क्षेत्रों और इन क्षेत्रों के गाऊसी वितरण उत्थान proc के संकेतक हैंईएसएस। वृद्धि myofiber सीएसए आम तौर पर एक बेहतर और / या त्वरित पुनर्योजी प्रतिक्रिया के साथ जुड़ा हुआ है। इसके विपरीत, उचित उत्थान की विफलता सीएसए में कमी के साथ जुड़ा हुआ है। यहाँ, हम myofiber सीएसए विश्लेषण सूचना दी, दोनों औसत (चित्रा 3F) और विभिन्न बिंदुओं पर समय myofiber सीएसए के वितरण (चित्रा 3 जी) के रूप में संकेत दिया। विश्लेषण पर प्रकाश डाला गया है कि कैसे myofiber क्षेत्रों के वितरण के समय के साथ और कैसे उत्थान आगम की प्रक्रिया के रूप में बड़े आकार के रेशों की ओर सीएसए पारियों में परिवर्तन।

आकृति 1
चित्रा 1. इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन और tibialis स्नायु के अलगाव। Tibialis पूर्वकाल मांसपेशियों में cardiotoxin के Intramuscular इंजेक्शन। बी। पेशी प्रावरणी का हटाया। सफेद तीर पतली इत्तला दे दी चिमटी कि मांसपेशियों चुटकी वें दूर करने के लिए इंगित करता हैई प्रावरणी। सी। ऊपर चित्र बाहर का टीए कण्डरा की शारीरिक स्थिति से पता चलता है। नीचे चित्र टीए उठा और इसे हटाने जबकि मांसपेशियों की क्षति से बचने के लिए कैसे पता चलता है। डी। वाम तस्वीर: प्रादेशिक सेना में ऊपर की ओर बाहर का पट्टा खींच कर उठाया है। सफेद तीर डिस्टल EDL कण्डरा इंगित करता है। सही तस्वीर: संदंश के साथ पट्टा धारण करके, टीए के ऊपरी किनारे से दूर घुटने के नीचे से कट जाता है। सफेद तीर काटने साइट इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. ताजा बर्फ़ीली स्नायु और जमे हुए स्नायु की Cryostat सेक्शनिंग। Tragacanth गम में ताजा पेशी शामिल किए जाने के तकनीक। टीए मांसपेशी 3/4 के बारे में बाहर के साथ, कण्डरा से गम में डूब जाता है औरकाग के संबंध में एक सीधा स्थिति में बनाए रखा। Cryostat सेक्शनिंग के लिए प्रक्रिया के बी प्रतिनिधि छवियाँ। काग नमूना ठूंठ पर ठंड यौगिक की एक छोटी राशि में रखा गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. टाइम कोर्स कंकाल की मांसपेशी उत्थान का विश्लेषण। तीव्र कंकाल की मांसपेशी की चोट के प्रायोगिक योजना। बीई। cardiotoxin के Hematoxylin और Eosin दाग वर्गों (CTX) के प्रतिनिधि चित्रों चोट के बाद संकेत दिया दिनों में मांसपेशियों -treated। बी। काले सतत लाइन (चित्र की बाईं ओर), परिगलित फाइबर के एक जोड़े हैं, आमतौर पर भड़काऊ कोशिकाओं द्वारा हमला encloses। धराशायी लाइन (दाईं ओरतस्वीर का) mononucleated कोशिकाओं में घुसपैठ के एक क्षेत्र के निशान। केन्द्र स्थित नाभिक के साथ सी एक एकल अपरिपक्व myofiber काले सर्किल ने संकेत दिया है। डे। बड़े पुनर्जीवित इओसिनोफिलिक myofibers, केन्द्र स्थित नाभिक के साथ काले घेरे द्वारा चिह्नित कर रहे हैं। स्केल सलाखों 100 मिमी प्रतिनिधित्व करते हैं। टीए मांसपेशी वर्गों में केन्द्र केन्द्रक myofiber आकार मूल्यों की एफ औसत। मूल्यों मतलब ± SEM, 5 चूहों / समूह हैं। जी Myofiber 6, 15 में पार के अनुभागीय क्षेत्र (सीएसए) के वितरण, और 30 दिनों CTX इंजेक्शन के बाद। मूल्यों मतलब ± SEM, 5 चूहों / समूह हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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यहाँ, हम कंकाल की मांसपेशी (यानी, CTX इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन) में गंभीर चोट प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। यह व्यापक रूप से विवो में कंकाल की मांसपेशी उत्थान की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में प्रयोग किया जाता है। CTX इंजेक्शन जो sarcolemma के विध्रुवण और फाइबर 12 के संकुचन के कारण होता है मांसपेशी फाइबर, के अध: पतन लाती है, और घटनाओं है कि मांसपेशियों के उत्थान की ओर जाता है का झरना हो सके। कंकाल की मांसपेशियों, इंजेक्शन और चोट के बाद वांछित समय बिंदुओं पर विच्छेदित कर रहे हैं प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार, और बाद में ऊतकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया। विच्छेदित मांसपेशियों या तो क्रायो protectant मीडिया में शामिल किए जाने के बाद जमे हुए किया जा सकता है, या पैराफिन में शामिल थे। हालांकि, इन प्रक्रियाओं paraformaldehyde के साथ प्री-निर्धारण, जो कलाकृतियों उत्पन्न कर सकते हैं और अंत में बाद के विश्लेषण को प्रभावित कर सकते हैं की एक कदम की आवश्यकता है। ऊतक सीधे बर्फ़ीली इस समस्या को रोका जा सकता है। ध्यान से, कईप्राथमिक एंटीबॉडी ताजा जमे हुए पेशी वर्गों 13 है, जो इस प्रक्रिया को और अधिक विश्वसनीय बनाता है पर विशेष रूप से या अधिक प्रभावी ढंग से काम करते हैं। morphometric विश्लेषण आमतौर पर समय पाठ्यक्रम प्रयोगों, जो एक ही उम्र के साथ चूहों के समूहों के बीच उत्थान प्रक्रियाओं में मतभेद के मूल्यांकन के लिए और विशिष्ट आनुवंशिक परिवर्तन और / या औषधीय उपचार के साथ की अनुमति देने पर किया जाता है। हालांकि CTX प्रेरित नुकसान के प्रोटोकॉल अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रतिशत से है, एक संभव सीमा CTX इंजेक्शन के ऑपरेटर पर निर्भर परिवर्तनशीलता के कारण है। इस सीमा को पार करने के लिए, यह है कि पूरे समय बेशक प्रयोग एक ही ऑपरेटर द्वारा किया जाता है बेहतर है।

पेशी के उत्थान की हद तक स्वस्थ फाइबर, परिगलित क्षेत्रों और सूजन, और regenerating और पुनर्जीवित क्षेत्रों के कुल क्षेत्रफल से अधिक की प्रतिशतता के रूप में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। हालांकि, इस दृष्टिकोण ज्यादातर प्रयोग किया जाता है जब इस तरह के dystrophic MDX मील में के रूप में पुराने नुकसान की घटनाओं, का अध्ययनसीई, बल्कि गंभीर चोट के मॉडल की तुलना में। दरअसल, जबकि dystrophic मांसपेशियों अध: पतन और उत्थान के अतुल्यकालिक घटनाओं की विशेषता है, गंभीर चोट अच्छी तरह से परिभाषित और परिणामी घटनाओं के बाद है। इन विश्लेषण है, जो ऊपर वर्णित रूपात्मक सुविधाओं की एक अनुभवजन्य पहचान की आवश्यकता की एक सीमा है, कि वे पूरी तरह से निष्पक्ष नहीं हो रहा है। प्रयोगात्मक निष्कर्ष का समर्थन करने के लिए, रूपात्मक विश्लेषण हमेशा आगे के विश्लेषण के साथ, इस तरह के विशिष्ट आणविक मार्कर के immunofluorescence विश्लेषण के रूप में, प्रयोगात्मक निष्कर्ष का समर्थन करने के लिए सराहना की जानी चाहिए। इस कारण से, यह समानांतर विश्लेषण का उपयोग करने के लिए स्पष्ट परिणामों की व्याख्या करने के लिए पसंद किया जाता है। उदाहरण के लिए, regenerating myofibers सकारात्मक भ्रूण मायोसिन भारी चेन (eMyHC) कि नवगठित myofibers में विशेष रूप से व्यक्त किया जाता है के लिए दाग रहे हैं। इस प्रकार, eMyHC से सना हुआ myofibers की मात्रा का ठहराव रूपात्मक विश्लेषण के साथ कंधे-से-कंधा मिलाकर किया जा सकता है।

सीएसए के विश्लेषण के लिए एक और अधिक विश्वसनीय मात्रा का ठहराव है और एच एंड ई दाग वर्गों पर या laminin, जो मांसपेशी फाइबर की बढ़त के निशान के साथ दाग पेशी वर्गों पर या तो किया जा सकता है; जैसा कि ऊपर वर्णित मात्रा का ठहराव, ImageJ की उचित मैक्रो का उपयोग किया जाता है। दोनों ही मामलों में, यह हमेशा जरूरी पहली वर्गों की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए और ऊतकों के क्षेत्रों है कि विकृत या कर्ल करवाने प्रकट बाहर करने के लिए है।

ऊतकों की रूपात्मक विश्लेषण के अलावा, एच एंड ई दाग वर्गों ऐसे फाइब्रोसिस और / या वसा ऊतकों की उपस्थिति के रूप में अन्य विशेष सुविधाओं, की पहचान के लिए अनुमति देते हैं। दरअसल, फाइब्रोसिस बाह्य मैट्रिक्स के अत्यधिक संचय या तो अगर उत्थान बिगड़ा हुआ है या पुराने रोगों 14 में होता है कि से निकला है। दरअसल, बाह्य मैट्रिक्स संचय के रूप में दिखाई पीला सामग्री एच ई-ऊतकीय धुंधला में पुनर्जीवित myofibers के बीच जमा है। CTX इंजेक्शन के कई दौर टी इस्तेमाल किया जा सकताओ नकल पुरानी बीमारी है जिसमें myofibers अध: पतन और उत्थान और निशान ऊतक की लहरों से गुजरना aberrantly जम जाता है। हालाँकि, और अधिक विश्वसनीय प्रोटोकॉल पेशी फाइब्रोसिस 15 प्रेरित करने के लिए उपलब्ध हैं, और विशिष्ट ऊतकीय धुंधला की पहचान करने और इस तरह के मेसन के Trichrome या सीरियस लाल धुंधला के रूप में इन संरचनाओं, यों करने के लिए किया जा सकता है। वसायुक्त ऊतक के गठन myofibers के बीच गोल सफेद संरचनाओं, वसा ऊतकों, जो तेल लाल धुंधला द्वारा मात्रा निर्धारित है की उपस्थिति का एक महत्वपूर्ण संकेत देने के रूप में एच ई-दाग वर्गों में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है। अंत में, कंकाल की मांसपेशी वर्गों प्रोटोकॉल वर्णित विशिष्ट एंटीबॉडी और प्रोटोकॉल का उपयोग immunofluorescence विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता निम्न प्राप्त की।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica SIGMA ALDRICH C9759
Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G x 8 mm - Da 0.3 mL BD 324826
Tragacanth Gum MP BIOMEDICALS,LLC 104792
2-Methylbutane (Isopentane) SIGMA ALDRICH 78-78-4.
OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat Bio-optica  05-9801
Feather Microtome Blade S35 Bio-optica  01-S35
Glass Slide Superfrost Plus Menzel-Gläser 09-OPLUS
Dumon #5 Mirror Finish Forceps  2BIOLOGICAL INSTRUMENTS 11251-23
Scissors Straight Sharp/Sharp 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS 15024-10
Scissors Noyes Straight 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS 15012-12
Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10.5 cm 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS 14094-11
Eukitt Bio-optica 09-00100
Slide Coverslip BIOSIGMA VBS651
Xylene SIGMA ALDRICH 214736
Ethanol 100% sigma-Aldrich 02860-2.5L
Hematoxyline J.T. BAKER 3873
Eosin SIGMA ALDRICH HT110116
Cryostat LEICA CM3050 S

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References

  1. Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35, (8), 1151-1156 (2003).
  2. Roca, I., Requena, J., Edel, M. J., Alvarez-Palomo, A. B. Myogenic Precursors from iPS Cells for Skeletal Muscle Cell Replacement Therapy. J Clin Med. 4, (2), 243-259 (2015).
  3. Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, (6), 329-340 (2013).
  4. Dumont, N. A., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Intrinsic and extrinsic mechanisms regulating satellite cell function. Development. 142, (9), 1572-1581 (2015).
  5. Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J Appl Physiol. 91, (1985), 534-551 (1985).
  6. Saclier, M., et al. Differentially activated macrophages orchestrate myogenic precursor cell fate during human skeletal muscle regeneration. Stem Cells. 31, (2), 384-396 (2013).
  7. Pillon, N. J., Bilan, P. J., Fink, L. N., Klip, A. Cross-talk between skeletal muscle and immune cells: muscle-derived mediators and metabolic implications. Am J Physiol Endocrinol Metab. 304, (5), E453-E465 (2013).
  8. Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14, (12), 1062-1072 (2013).
  9. Costamagna, D., Costelli, P., Sampaolesi, M., Penna, F. Role of Inflammation in Muscle Homeostasis and Myogenesis. Mediators Inflamm. 2015, (2015).
  10. Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84, (1), 209-238 (2004).
  11. Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. J Exp Med. 204, (5), 1057-1069 (2007).
  12. Chang, C. C., Chuang, S. T., Lee, C. Y., Wei, J. W. Role of cardiotoxin and phospholipase A in the blockade of nerve conduction and depolarization of skeletal muscle induced by cobra venom. Br J Pharmacol. 44, (4), 752-764 (1972).
  13. Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
  14. Mann, C. J., et al. Aberrant repair and fibrosis development in skeletal muscle. Skelet Muscle. 1, (1), (2011).
  15. Pessina, P., et al. Novel and optimized strategies for inducing fibrosis in vivo: focus on Duchenne Muscular Dystrophy. Skelet Muscle. 4, (1), 7 (2014).
Cardiotoxin इंजेक्शन द्वारा तीव्र कंकाल की मांसपेशी उत्थान की प्रेरण
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Guardiola, O., Andolfi, G., Tirone, M., Iavarone, F., Brunelli, S., Minchiotti, G. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J. Vis. Exp. (119), e54515, doi:10.3791/54515 (2017).More

Guardiola, O., Andolfi, G., Tirone, M., Iavarone, F., Brunelli, S., Minchiotti, G. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J. Vis. Exp. (119), e54515, doi:10.3791/54515 (2017).

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