Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Induktion av akut Skeletal Muscle Regeneration av Cardiotoxin Injection

doi: 10.3791/54515 Published: January 1, 2017

Summary

Detta manuskript beskriver ett detaljerat protokoll för att inducera akut skelettmuskulaturen förnyelse hos vuxna möss och efterföljande manipulationer av musklerna, såsom dissektion, frysning, skärning, rutin färgning och myofiber tvärsnittsarea analys.

Abstract

Skelettmuskelregenerering är en fysiologisk process som sker i vuxen skelettmuskler som svar på skada eller sjukdom. Akut skada-inducerad skelettmuskulaturen förnyelse är en allmänt använd, kraftfulla modellsystem för att studera de som är inblandade i muskelregenerering samt mekanismer och olika aktörer händelser. I själva verket är en detaljerad kunskap om denna process avgörande för en bättre förståelse av de patologiska tillstånd som leder till degeneration av skelettmuskulaturen, och det hjälper till att identifiera nya målinriktade terapeutiska strategier. Detta arbete beskriver en detaljerad och reproducerbar protokoll för att framkalla akut skelettmuskulaturen förnyelse i möss genom en enda intramuskulär injektion av cardiotoxin (CTX). CTX tillhör familjen av ormgift toxiner och orsakar myolys av myofibers, som så småningom utlöser regenereringshändelser. Dynamiken i skelettmuskelregenerering utvärderas genom histologisk analys av muskel sektioner. Protokollet ocksåillustrerar de experimentella förfarandena för att dissekera, frysning, och skära tibialis anterior, liksom rutinen Hematoxylin & Eosin färgning som ofta används för efterföljande morfologiska och morfometrisk analys.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Däggdjur vuxna skelettmuskulaturen bildas av grupper av fascicules av flerkärniga muskelceller (myofibers) som är specialiserade för kontraktion. Varje myofiber är en långsträckt syncytium, omgiven av sarcolemma (plasmamembran) och innehåller myofibriller, som består av regelbundet och upprepade gånger organiserade kontraktila proteiner (aktin och myosin filament). I vuxenlivet och när man vilar, skelettmuskler har en mycket låg omsättning på sin myonuclei 1; sannerligen, myonuclei, som ligger i utkanten av myofiber under sarcolemma, arresteras i G0 fasen av cellcykeln och är oförmögna att föröka sig 1,2.

Skelettmuskler har den säregna förmåga att regenerera efter skada och nådde homeostas efter flera händelser av vävnadsombildning som är tätt kopplade till varandra. Efter en akut skada eller trauma är degeneration induceras, följt av regenereringsprocessersom involverar olika cellpopulationer, inklusive en bofast befolkning av muskelceller, satellitceller (SCS). I själva verket, i avsaknad av miljö stimuli, satellitceller i ett vilotillstånd och är belägna i en nisch mellan sarcolemma och basala lamina 3,4. Efter en skada eller sjukdom, SCS blir aktiverad, förökar sig, migrera till de skadade områdena, och så småningom differentiera, vilket ger upphov till nya bildar myofibers 5. Aktiverade kaster etablera överhörning med olika cellpopulationer, främst inflammatoriska celler, som rekryteras i stället för trauma 6-8. Detta överhörning gör att cellerna att följa ett reglerat paradigm genom vilka molekylära signaler medföra strukturella förändringar, så småningom leder till homeostas 9. Förutom SC, inflammatoriska och interstitiella celler, angiogena processer, och åter innervation händelser är också involverade, agerar på ett samordnat sätt för att reparera detta välorganiserad och specialized struktur.

Det finns ett stort intresse för att studera olika aspekter av skelettmuskulaturen förnyelse, inte bara för att förstå fysiologi muskler, men också för att förbättra behandlingsstrategier som kräver djupare kunskap om hela processen. Flera experimentella metoder är för närvarande tillgängliga för att studera identitet och funktion av de olika cellpopulationer, de signalvägar, och de molekylära mekanismer som är inblandade. Musmodeller av akuta skador representerar ett kraftfullt verktyg för att undersöka många aspekter av denna process. Olika vanligt förekommande tekniker för att framkalla akut muskelskada tillåta forskare att följa regenereringsprocessen in vivo, från mycket tidiga skeden till slutet av processen. Detta protokoll beskriver stegen från intramuskulär injektion av ormgift-härlett cardiotoxin (CTX), som inducerar myolys och utlöser regenereringsprocessen, fram till analys av vävnadsprover. Följande CTX injektion, mice kan offras vid olika tidpunkter beroende på experimentella krav, och skelettmuskulaturen kan dissekeras och bearbetades för ytterligare analys. Slutligen beskriver vi färgningsprotokollet av vävnadssnitt för att utföra morfologiska observationer och grundläggande kvantitativa analyser. Detta protokoll möjliggör studier av akut skelettmuskel förnyelse in vivo på ett mycket reproducerbart sätt 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla experiment utfördes i strikt överensstämmelse med de institutionella riktlinjerna för djurförsök och godkänts av Institutionen för folkhälsa, djurhälsa, kost och livsmedelssäkerhet i den italienska hälsoministeriet i enlighet med lagen om djurförsök. Halsdislokation procedurer kan variera från institution till institution baserad på IACUC eller motsvarande krav.

1. Cardiotoxin injektion i tibialis anterior

  1. Bered en 10 ^ M arbetslösning av cardiotoxin (CTX) genom att späda cardiotoxin stamlösning i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller i vatten före start av förfarandet.
    Obs: CTX är löslig i vatten vid 1 mg / ml. Bered en 70 ^ M förrådslösning. Alikvot och förvara vid -20 ° C. CTX används för detta protokoll är en blandning av cardiotoxins som har en molekylvikt av ca 7000 Da.
    VARNING: Det föreslås att bäradubbla handskar, en hygien mask och skyddsglasögon (alternativt till skyddsglasögon, är det rekommenderat att arbeta under en huva) och att vara mycket noga med att undvika all kontakt med lösningen, även om utspädd.
  2. Söva möss genom intraperitoneal injektion av ketamin och xylazin (80 mg / kg och 10 mg / kg av kroppsvikten) eller annan godkänd tillgängliga bedövningsmedel.
  3. Med musen vänd uppåt, spraya bakbenen med 70% etanol. För att visualisera den exakta platsen för tibialis anterior (TA) muskel, med hjälp av en skalpell, klippa håret bort på den främre delen av underbenet, under knät.
    Obs! TA muskel uppstår från den proximala kroppen av skenbenet, går ner i sidled till benet och slutar vid vristen. Dess långa sena sträcker sig in i foten över ankeln (se figur 1A).
  4. Rita ~ 100 mikroliter av lösningen i sprutan genom att dra tillbaka kolven långsamt.
  5. Ta bort luftbubblor, som håller sprutan upprätt (med nålen uppåt). Dra försiktigt ner kolven och knacka på sidan av sprutan för att hjälpa eventuella luftbubblor som är knutna till den inre delen av röret kommer uppåt. Sakta pressa ner kolven för att frigöra stora luftbubblor. Några droppar vätska kommer att komma ut nålen. Vid denna punkt, se till att plocka upp vätskan igen i röret och inte sprida den, med tanke på toxicitet cardiotoxin.
  6. Dra tillbaka lösningen i sprutan tills den önskade dosen har uppnåtts. Injicera 20 mikroliter av CTX lösning för varje TA muskel.
  7. In nålen i centrum av TA genom att följa positionen för Tibia ben som vägledning, från senan mot knäet. Eftersom TA är en tunn vävnad, utföra injektionen utan att gå för djupt (in nålen 2/3 mm djup, vid ungefär 10 ° till 20 ° vinkel), och undvika att gå utanför muskeln själv (Figur 1A).
  8. Dra inte ut nålen omedelbart efter injektionen, men vänta 2 - 3 s för att förhindra läckageålder av CTX sjunker från muskeln.
  9. Efter ingreppet, placera buren på en uppvärmd platta (vid 37 ° C) tills mössen är vakna, eftersom anestetikum och den använda etanolen minska kroppstemperatur.

2. tibialis anterior Isolering

Notera: Muskler kan isoleras vid olika tidpunkter efter cardiotoxin injektion enligt experimentella krav.

  1. Offra musen genom halsdislokation.
  2. Spraya bakbenen med 70% etanol. Under förfarandet, kan djuret fixeras till ett stöd för att hålla ner den.
  3. Skär huden på samma nivå som den proximala senan (ovanför foten), sätt ett av bladen i saxen under huden, och skära in i huden uppåt, i riktning mot knäet. Med hjälp av pincett, dra upp huden och exponera muskeln helt. Försiktigt bort all hud och hår från området av intresse.
  4. Eliminera fascia genom att långsamt klämma eller skära (med thi-tip pincett eller med fina mikro dissekera sax) den extrema periferin av muskeln på den motsatta sidan av skenbenet (Figur 1B). När bruten, försiktigt bort fascian med hjälp av tunna-tip pincett; undvika att skada den underliggande muskeln.
    Obs! Liksom med andra muskler och organ, är TA omfattas av fascia (djup fascia av benet), en tunn skiva av bindväv som ligger djupt under huden och som måste tas bort för att enkelt isolera den underliggande muskeln.
  5. Visualisera distala TA senan och extensor digitorum senan över foten, som är placerade intill varandra. Senan av extensor digitorum longus (EDL) muskel ligger något under TA senan. Senor från vuxna möss är synliga för blotta ögat.
  6. Ta TA muskeln efter en av de två följande tekniker:
    1. Skär båda senor med fina mikro dissekera sax och dra dem mot den proximala sidan, holding senorna med pincett. Separera de två senor, dra dem försiktigt i motsatta riktningar för att separera musklerna.
    2. Med hjälp av tunna spets pincett, separera distala TA senan från extensor digitorum senan genom att spetsen under senan själv (Figur 1C, övre bilden). Skjut försiktigt pincetten under TA för att separera den från de underliggande musklerna (Figur 1C, nedre bilden).
    3. Håll pincett under muskeln att hålla den något upphöjda, skär TA senan, och försiktigt dra det uppåt tills endast området under knäet är fäst (figur 1D, vänstra bilden). Skär TA under knäet, följer kanten av muskeln med en sax (figur 1D, högra bilden).
      Obs: Om muskeln fortfarande något fäst på sidorna, använd bra mikro dissekera sax för att hjälpa loss den.
      Obs: Om tången inte lätt passar under TA,det är möjligt att fascian inte har fullständigt tagits bort, och det kan fortfarande vara synlig på toppen av muskeln. I detta fall, helt ta bort fascian innan man fortsätter.

3. Färsk Fryst Muscle Technique

  1. Placera en liten mängd dragantgummi eller liknande bindemedel frysning förening (t.ex. Optimal Cutting Temperature (oktober) förening) på en skiva av kork. Märka korken s slice på den omvända sidan före frysning, om så är nödvändigt (Figur 2A).
  2. I syfte att erhålla tvärgående sektioner av muskeln, diskbänk TA in i dragantgummi genom att föra in den distala senan och vilket innebär att ungefär 3/4 av muskeln utsidan, att se till att ha muskeln i ett vinkelrätt läge i förhållande till korken (Figur 2A).
  3. Fyll en aluminiumburk (alternativt en metall kopp eller en glasbägare), med isopentan. Häng upp burk isopentan i en Dewar innehållande LIQUId kväve, som inte medger att flytande kväve för att träda in i burken.
    Notera: Isopentan behöver nå rätt temperatur (från -150 till -160 ° C) för optimal frysning av vävnaden. Rätt temperatur är nådd när vissa vita fasta partiklar bildas vid botten av burken och isopentan blir lätt viskös.
    Obs: Får ej frysas provet innan bildandet av de fasta partiklarna, eftersom det kan leda till frysning artefakter. Å andra sidan, om isopentan blir helt fast, lämna den vid rumstemperatur tills den tinades, att se till att vissa vita partiklar som fortfarande finns kvar.
  4. Använda mixter pincett, snabbt doppa korken med muskeln i isopentan, hålla muskeln placerade nedåt, och se till att frigöra korken när det är helt nedsänkt i vätskan. På detta sätt, under det att provet flyter, bör endast den motsatta sidan av korken vara synlig i vätskan.
  5. Låt sample i isopentan under 1 min.
  6. Använda mixter pincett (eller liknande tång), ta muskeln och doppa den i flytande kväve under minst två minuter.
  7. Wrap proverna individuellt i märkt aluminiumfolie och omedelbart placera dem i torris (-70 ° C), eller direkt lagra dem i en -80 ° C frys.
    Obs: Under hela förfarandet, från steg 3,4 till 3,7, är det oerhört viktigt att hålla rätt temperatur och att förhindra proverna från upptining (t.ex. under överföringen till -80 ° C frys.). De stigande temperatur resulterar i okontrollerad upptining och omfrysning av vattenmikrokristallerna som finns i vävnaden och så småningom orsakar bildandet av artefakter eller fördelningen av muskelfibrer (visualiseras på vävnadssnitt som stora vita hål i mitten av fibern).

4. Kryostat Sektionering av frysta Muscles

  1. Ställa in kryostat kammartemperaturen to -20 till -22 ° C.
  2. Sätt provet stubben, bladet, och provet i kryostat kammaren, vilket gör dem till jämvikt under åtminstone 30 minuter.
  3. Placera en liten mängd frys förening (t.ex. OCT-förening) på provet påbörjad och sänk korken med provet innan frysning sammansatta stelnar. Under tiden, placera bladet i bladhållaren.
  4. Rikta provet och bladet med hjälp av de medföljande skruvarna för att orientera provhållaren med bladhållaren (Figur 2B).
  5. Ställa in snittjockleken till 10 | im. Fortsätt att skära vävnaden. För varje varv hos drivhjulet, avancerar provhållaren en styrd sträcka mot bladet.
  6. Placera delarna på en polariserad slide (8-10 avsnitt per bild) (Figur 2C).
  7. Efter sektionering, lagra bilderna vid -80 ° C.
    Obs: provexemplaret kan lagras i en -80 ° C frys och återanvändas för further sektionering, om det är korrekt hanteras och lagras.

5. Rutin Histologisk färgning (Hematoxylin & Eosin Stains)

Obs: Flera histologiska fläckar kan utföras på muskelsektioner enligt analysen. En rutin histologiska fläck för morfologisk och morfometrisk analys är Hematoxylin & Eosin (H & E) bichromic fläck. Den hematoxylin fläckar kärnorna en djup lila. Kärn färgning motfärgades med eosin (rosa / röd), som färgar eosinofila strukturer, såsom myofibers i cytoplasman.

  1. Helt lufttorka frysta bilder med sektioner för 10-15 minuter vid rumstemperatur, lämna glasen i en färgnings fack och placera brickan i en färgning tråg.
  2. Färgen verka under 1 min med hematoxylin.
  3. Lägg färgningstråg enligt en ganska svag kranvatten stråle för 10 minuter för att tvätta ur hematoxylin.
  4. Sänk ned objektglasen i 5 min i 95% etanol, om en alkoholisk lösning av eosin kommer att användas (hoppa thans steg i händelse av en vattenhaltig eosin-lösning).
  5. Motfärg under 1 min med eosin-lösning.
  6. Skölj med vatten för att eliminera överdriven eosin lösning.
    Obs: Optimal timing av färgning med antingen hematoxylin eller eosin bör fastställas för varje nytt parti.
  7. Dehydratisera proverna i en graderad etanolserie: 50% och 70% (några få sekunder vardera). Snabbt fördjupa sig i 95% etanol, följt av 2 byten i 100% etanol, 5 min vardera.
  8. Klar i 2 byten av xylen, var 5 minuter eller längre. Detta steg måste utföras under en kemisk huva.
  9. Montera bilderna med en xylen-baserat monteringsmedium, applicera några droppar monteringsmedium på objektglaset och täcker med ett täckglas. Monteringsmedel kan även appliceras på täckglas och täckglas placeras på objektglaset.
    1. Undvik att bilda luftbubblor mellan bilden och täck. För att eliminera luftbubblor, hålla bilden vertikalt (efter montering) och pressa ut överflödigt mounting medium och luftbubblor genom att försiktigt trycka på täck med trubbiga pincett (eller ett liknande trubbigt verktyg).
  10. Håll glider under huven för ett par timmar eller över natten för att låta xylen avdunsta helt innan du går vidare till analysen.
  11. Utför morfologiska och morfometrisk analys av H & E-färgade regeneremuskelsektioner genom att använda icke-överlappande serie bilder av åtminstone en hel muskel avsnitt per mus. Ta bilder med en ljus-fält mikroskop med 20x förstoring.
    Obs: Minst antal 5 möss rekommenderas att erhålla statistisk signifikans av mätningarna.
    Obs: Bildanalys programvara är tillgänglig för detta ändamål, såsom den fria ladda ner programvara ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

H & E-färgning tillåter en utvärdering av morfologin hos regenereringsprocessen vid specifika tidpunkter under skelettmuskelregenerering. Figur 3 visar tidsförloppet analysen utföras på skadade TA musklerna i möss av vildtyp. Muskler har isolerats på 3, 7, 15 och 30 dagar efter CTX injektion, som schematiskt i figur 3A. Representativa bilder av H & E-färgade tvärsnitt visar dynamiken i skelettmuskulaturen reparation över tiden (Figur 3B-E). Vid dag 3 efter skada, är den strukturella uppbyggnaden av muskeln helt förstörda, och båda degenererade myofibers (nekrotiskt område) och mononukleära celler syns tydligt (Figur 3B). Denna heterogena grupp av celler består huvudsakligen av övergående förstärkningssatellitceller (myoblaster), inflammatoriska celler rekryteras från blodet 11 och interstitiell och endotelceller som participate i regenereringsprocessen, som utlöses vid platsen för skadan. I detta sammanhang är nya regenererings myofibers genereras genom sammansmältning och differentieringen av myoblaster. Det viktigaste inslaget i regenereringsområdet är närvaron av små basofila myofibers med centralt placerade kärnor och en mörk-färgade cytoplasman (Figur 3C). I detta skede, är inflammation fortfarande synliga, även om det progressivt minskar. Storleken på regenere myofibers ökar över tiden, vilket ger upphov till eosinofila regenere myofibers kännetecknas av centralt belägna kärnor (figur 3D, E). De regenererade myofibers är synliga i senare skeden av regenerering och fram till slutet av processen. De hälsosamma myofibers visas välorganiserad och nära varandra, med en rosa cytoplasma och med kärnorna placerade vid periferin av fibrerna under sarcolemma. Dessa myofibers är vanligtvis närvarande långt från platsen för CTX injektion och skada, och de mer sällsyntaly representerar områden där förnyelse är definitivt klar. I själva verket är regenererade fibrer kännetecknas av närvaron av centralt belägna kärnor som rör sig till periferin först flera månader efter skada.

Digitala bilder av de färgade muskelsektionerna fångas genom att tillsätta skal barer för rumslig kalibrering, som är nödvändig för att noggrant mäta områden av intresse genom att skissera konturerna av de berörda områdena. Mätningen av myofiber tvärsnittsarea (CSA) är en pålitlig morfometrisk analys, som ofta används för att kvantifiera skillnaderna i regenereringsutvecklingen mellan olika grupper av möss. Denna analys kräver mätning av arealer av centralt kärn myofibers, varav minst 500 och upp till 1000 fibrer per avsnitt. Både genomsnittet av det regenererande och regenererade myofiber områden och Gauss-fördelning av dessa områden är indikatorer på regenererings process. Ökad myofiber CSA är i allmänhet förknippas med en förbättrad och / eller accelererad regenerativ respons. Tvärtom är bristfälligt förnyelse i samband med en minskning av CSA. Här rapporterade vi myofiber CSA analysen, som anges som det genomsnittliga (figur 3F) och distribution (figur 3G) av myofiber CSA vid olika tidpunkter. Analysen belyser hur fördelningen av myofiber områden förändras över tid och hur CSA förändringar mot större stora fibrer som processen med regenereringsfortskrider.

Figur 1
Figur 1. Intramuskulär injektion och isolering av den tibialismuskeln. A. intramuskulär injektion av cardiotoxin i tibialis anterior. B. Avlägsnande av muskel fascia. Den vita pilen visar de tunna spets pincett som klämmer muskeln att avlägsna the fascia. C. Den övre bilden visar den anatomiska positionen av den distala TA senan. Den undre bilden visar hur man lyfter TA och ta bort det och samtidigt undvika muskelskada. D. Vänstra bilden: TA lyfts genom att dra den distala senan uppåt. Den vita pilen visar den distala EDL senan. Högra bilden: genom att hålla senan med pincett, den övre kanten av TA är avskuren under knäet. Den vita pilen indikerar skärstället. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Färska Frys Muskel och Kryostat Sektionering av frysta muskler. A. Teknik för färsk muskel ingå i dragantgummi. TA muskel är nedsänkt i tandköttet från senan, med ca 3/4 utanför ochhålls i ett vinkelrätt läge i förhållande till korken. B. Bilderna av förfarandet för kryostat sektionering. Korken är placerad i en liten mängd av frysning förening på prov stöta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Tidsförlopp Analys av skelettmuskulatur Regeneration. A. försöksverksamhet med akut skelett muskelskada. BE. Representativa bilder av Hematoxylin & Eosin färgade sektioner av cardiotoxin (CTX) -behandlade musklerna vid angivna dagar efter skada. B. Den svarta heldragna linjen (på den vänstra sidan av bilden), innesluter ett par nekrotiska fibrer, sannolikt invaderas av inflammatoriska celler. Den streckade linjen (höger sidaav bilden) markerar ett område av infiltrerande mononukleära celler. C. En enda omogen myofiber med centralt belägna kärnan indikeras av den svarta cirkeln. DE. Stora regenere eosinofila myofibers, med centralt belägna kärnor är markerade med svarta cirklar. Skalstrecken representerar 100 mm. F. Genomsnitt av centralt kärn myofiber storleksvärden i TA muskel sektioner. Värden är medelvärde ± SEM, 5 möss / grupp. G. Myofiber tvärsnittsarea (CSA) fördelning vid 6, 15, och 30 dagar efter CTX injektion. Värden är medelvärde ± SEM, 5 möss / grupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Här beskriver vi ett protokoll för att framkalla akut skada i skelettmuskel (dvs intramuskulär injektion av CTX). Den används ofta som ett kraftfullt verktyg för att studera dynamiken i skelettmuskulaturen regenerering in vivo. CTX injektion inducerar degenerering av muskelfibrer, som orsakas av depolarisation av sarcolemma och sammandragning av fibrerna 12, och utlöser kaskad av händelser som leder till muskelregenerering. Skelettmuskulatur dissekeras vid önskade tidpunkter efter injektionen och skador, enligt experimentella krav, och används för efterföljande histologiska analyser. De dissekerade muskler kan antingen frysas, efter införandet i kryo-skyddande medier, eller ingår i paraffin. Men dessa förfaranden kräver ett steg av pre-fixering med paraformaldehyd, som kan alstra artefakter och kan så småningom påverka efterföljande analyser. Frysning av vävnaden direkt kan förhindra detta problem. Notera mångaprimära antikroppar arbetar uteslutande eller mer effektivt på fryst muskelsektioner 13, vilket gör detta förfarande mer tillförlitlig. Den morfometrisk analys utförs vanligtvis på tidsförloppet experiment, som möjliggör utvärdering av skillnader i regenereringsprocesser mellan grupper av möss med samma ålder och med specifika genetiska mutationer och / eller farmakologisk behandling. Även protokollet av CTX-inducerad skada är mycket reproducerbar i sig, är en möjlig begränsning på grund av operatörsberoende variationen i CTX injektion. För att övervinna denna begränsning, är det föredraget att hela tidsförloppet Experimentet utförs av samma operatör.

Omfattningen av muskelregenerering kan kvantifieras i procent av friska fibrer, nekrotiska områden och inflammation, och regenere och regenere områden över hela området. Dock är denna metod används oftast när man studerar händelser av kroniska skador, såsom i dystrofa MDX mice, snarare än i modeller av akut skada. I själva verket, medan dystrofa muskler kännetecknas av asynkrona händelser degeneration och regeneration, är akut skada följt av väldefinierade och följdhändelser. En begränsning av dessa analyser, som kräver en empirisk identifiering av morfologiska särdrag som beskrivits ovan, är att de inte är helt objektiv. För att stödja experimentella slutsatser bör morfologisk analys alltid kompletteras med ytterligare analys, såsom immunofluorescensanalys av specifika molekylära markörer för att stödja experimentella slutsatser. Av detta skäl är det föredraget att använda parallell analys för att otvetydigt tolka resultaten. Till exempel, är regenererande myofibers positivt färgades för embryonal myosin tung kedja (eMyHC) som uttrycks specifikt i nybildade myofibers. Således kan utföras kvantifiering av eMyHC-färgade myofibers sida vid sida med den morfologiska analysen.

CSA-analys är en mer tillförlitlig kvantifiering och kan utföras antingen på H & E-färgade snitt eller på muskel sektioner färgade med laminin, som markerar kanten av muskelfibrer; kvantifiering utförs med användning av lämpliga makron av ImageJ, såsom beskrivits ovan. I båda fallen är det alltid nödvändigt att först bedöma kvaliteten på sektionerna och att utesluta områden av vävnad som visas deformerade eller böjda.

Förutom de morfologiska analyser av vävnader, H & E-färgade sektioner möjliggöra identifiering av andra särdrag, såsom förekomsten av fibros och / eller fettvävnad. I själva verket härrör fibros från överdriven ackumulering av extracellulär matrix som sker antingen om regenereringen försämras eller kroniska sjukdomar 14. I själva verket är extracellulära matrisen ackumulering synlig som blek material avsatt mellan de regenere myofibers i H & E-histologisk färgning. Flera omgångar av CTX injektion kan användas to härma kronisk sjukdom där myofibers genomgå vågor av degeneration och regeneration och ärrvävnad ackumuleras avvikande. Men mer tillförlitliga protokoll finns tillgängliga för att framkalla muskelfibros 15, och specifik histologisk färgning kan utföras för att identifiera och kvantifiera dessa strukturer, såsom Massons Trichrome eller Sirius Red färgning. Bildandet av fettvävnad är tydligt i H & E-färgade sektioner som rundade vita strukturer mellan myofibers, ger en viktig indikation på förekomsten av fettvävnad, som kvantifieras genom Oil Red färgning. Slutligen skelettmuskelsektioner erhölls efter det protokoll som beskrivs kan användas för att utföra immunofluorescensanalys med användning av specifika antikroppar och protokoll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica SIGMA ALDRICH C9759
Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G x 8 mm - Da 0.3 mL BD 324826
Tragacanth Gum MP BIOMEDICALS,LLC 104792
2-Methylbutane (Isopentane) SIGMA ALDRICH 78-78-4.
OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat Bio-optica  05-9801
Feather Microtome Blade S35 Bio-optica  01-S35
Glass Slide Superfrost Plus Menzel-Gläser 09-OPLUS
Dumon #5 Mirror Finish Forceps  2BIOLOGICAL INSTRUMENTS 11251-23
Scissors Straight Sharp/Sharp 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS 15024-10
Scissors Noyes Straight 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS 15012-12
Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10.5 cm 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS 14094-11
Eukitt Bio-optica 09-00100
Slide Coverslip BIOSIGMA VBS651
Xylene SIGMA ALDRICH 214736
Ethanol 100% sigma-Aldrich 02860-2.5L
Hematoxyline J.T. BAKER 3873
Eosin SIGMA ALDRICH HT110116
Cryostat LEICA CM3050 S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35, (8), 1151-1156 (2003).
  2. Roca, I., Requena, J., Edel, M. J., Alvarez-Palomo, A. B. Myogenic Precursors from iPS Cells for Skeletal Muscle Cell Replacement Therapy. J Clin Med. 4, (2), 243-259 (2015).
  3. Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, (6), 329-340 (2013).
  4. Dumont, N. A., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Intrinsic and extrinsic mechanisms regulating satellite cell function. Development. 142, (9), 1572-1581 (2015).
  5. Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J Appl Physiol. 91, (1985), 534-551 (1985).
  6. Saclier, M., et al. Differentially activated macrophages orchestrate myogenic precursor cell fate during human skeletal muscle regeneration. Stem Cells. 31, (2), 384-396 (2013).
  7. Pillon, N. J., Bilan, P. J., Fink, L. N., Klip, A. Cross-talk between skeletal muscle and immune cells: muscle-derived mediators and metabolic implications. Am J Physiol Endocrinol Metab. 304, (5), E453-E465 (2013).
  8. Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14, (12), 1062-1072 (2013).
  9. Costamagna, D., Costelli, P., Sampaolesi, M., Penna, F. Role of Inflammation in Muscle Homeostasis and Myogenesis. Mediators Inflamm. 2015, (2015).
  10. Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84, (1), 209-238 (2004).
  11. Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. J Exp Med. 204, (5), 1057-1069 (2007).
  12. Chang, C. C., Chuang, S. T., Lee, C. Y., Wei, J. W. Role of cardiotoxin and phospholipase A in the blockade of nerve conduction and depolarization of skeletal muscle induced by cobra venom. Br J Pharmacol. 44, (4), 752-764 (1972).
  13. Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
  14. Mann, C. J., et al. Aberrant repair and fibrosis development in skeletal muscle. Skelet Muscle. 1, (1), (2011).
  15. Pessina, P., et al. Novel and optimized strategies for inducing fibrosis in vivo: focus on Duchenne Muscular Dystrophy. Skelet Muscle. 4, (1), 7 (2014).
Induktion av akut Skeletal Muscle Regeneration av Cardiotoxin Injection
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guardiola, O., Andolfi, G., Tirone, M., Iavarone, F., Brunelli, S., Minchiotti, G. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J. Vis. Exp. (119), e54515, doi:10.3791/54515 (2017).More

Guardiola, O., Andolfi, G., Tirone, M., Iavarone, F., Brunelli, S., Minchiotti, G. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J. Vis. Exp. (119), e54515, doi:10.3791/54515 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter