Summary
Mostramos como preparar fatias oblíquas da medula espinhal em ratos jovens. Esta preparação permite que a estimulação das raízes ventrais.
Abstract
gravações electrofisiológicos a partir de fatias de medula espinal têm provado ser uma técnica valiosa para investigar um grande número de questões, a partir de propriedades da rede celular. Mostramos como preparar fatias oblíquas viáveis da medula espinhal de ratos jovens (P2 - 11). Nesta preparação, os motoneurónios reter os seus axónios que sai das raízes ventrais da medula espinal. A estimulação desses axônios provoca back-propagação potenciais de ação que invadem o somas motoneurônio e emocionantes garantias do motoneurônios na medula espinhal. Gravação de potenciais de ação antidrômicos é uma forma imediata, definitiva e elegante para caracterizar a identidade motoneurônio, que supera outros métodos de identificação. Além disso, estimular as garantias de neurónios motores é uma maneira simples e confiável para excitar os alvos colaterais dos neurónios motores na medula espinhal, como outros neurónios motores ou Renshaw células. Neste protocolo, apresentamos gravações antidrômicos do motoneurônio somas, bem como excitação celular Renshaw, resultante da estimulação da raiz ventral.
Introduction
Historicamente, as gravações de neurónios motores que utilizam afiado-eléctrodo foram realizadas in vivo em animais de grande porte, tais como gatos ou ratos 1, ou por um conjunto isolado da medula espinal em ratos 2. O surgimento da técnica de gravação de patch-clamp durante os anos 1980, chamado para o acesso directo à motoneurônio somas como a selagem necessária para ser alcançado sob a orientação visual. Assim, a preparação fatia da medula espinal foi prontamente alcançado desde o início da década de 1990 3. No entanto, a preparação fatia precoce muitas vezes não permitir a estimulação das raízes ventrais. Para o melhor de nosso conhecimento, apenas dois estudos relataram a estimulação bem sucedida das raízes ventrais em fatias transversais, e nenhuma foi obtido a partir de camundongos 4,5.
Neste artigo apresentamos uma técnica para alcançar fatias de medula espinhal viáveis de ratos neonatal (P2 - P11) em que o agregado neuromotor mantém suas raízes partida axônios ventral. respiradouroestimulação da raiz ral desencadeia potencial de ação antidrômica de volta para as somas do agregado neuromotor sair da mesma raiz ventral. Ele também excita os objectivos de garantia de neurónios motores, outros motoneurônios 6-10 e as células de Renshaw 11-13. Uma vez que apenas neurónios motores enviam seus axônios para baixo as raízes ventrais, usamos o registro de potenciais de ação antidrômicos como uma maneira simples e definitiva para fisiologicamente identificar neurónios motores 10.
Além de usar critérios eletrofisiológicos e morfológicos potencialmente não incluído ou enganosas para confirmar a identidade motoneurônio, estudos recentes sobre neurónios motores da medula espinhal também contou com tediosa e demorada post hoc colorações 16. Esta identificação é normalmente realizado apenas numa amostra das células gravadas. Outras estratégias de identificação dependem de linhas de rato em que os neurónios motores expressar fluorescência endógena
Além disso, a estimulação raiz ventral pode ser usado com fiabilidade para excitar outros motoneurónios 22,23 ou os seus alvos. as células de Renshaw 10,24,25. Apresentamos aqui as aplicações da estimulação raiz ventral na forma de ação antidrômica potenciais gravações de somas motoneurônio, bem como excitação de células de Renshaw.
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Protocol
Os experimentos foram realizados em conformidade com as directivas europeias (86/609 / CEE e 2010-63-UE) e da legislação francesa, e foram aprovados pelo comitê de ética Paris Descartes University.
1. Spinal Cord Slice Preparação
- Prepare as seguintes soluções diárias ou um dia de antecedência. Se mantida durante a noite, bolha, com 95% de O2 e 5% de CO 2 e manter refrigerado em frascos bem fechados.
- Prepare baixo Na + fluido artificial cerebrospinal (ACSF): KCl a 3 mM, 1 mM de NaH 2 PO 4, sacarose 230 mM, 26 mM NaHCO3, 0,8 mM de CaCl 2, 8 mM de MgCl2, glucose 25 mM, ácido ascórbico 0,4 mM, 1 mM de Na-cinurenato, 2 mM de Na-piruvato. Bolha com 95% de O2 e 5% de CO 2 (pH 7,4). Desde Na-cinurenato é muitas vezes difícil de dissolver-se, certifique-se de comprar o que está listado na tabela de materiais.
- Prepare solu K-gluconatoção: mM de K-gluconato 130, KCl 15 mM, EGTA 0,05 mM, HEPES 20 mM, glicose 25 mM, 1 mM de Na-cinurenato, 2 mM de Na-piruvato, ajustado para pH 7,4 com KOH.
- Prepare ACSF: 130 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 1 mM de NaH 2 PO 4, 26 mM de NaHCO3, glucose 25 mM, ácido ascórbico 0,4 mM, 2 mM de Na-piruvato. Bolha com 95% de O2 e 5% de CO 2 (pH 7,4).
- Antes do início da dissecção, dissolve-se 2% de agar em 80 ml de solução de K-gluconato, e mantê-lo aquecido a 60 ° C.
- intracardíaca perfusão
- Executar esta preparação em ratos fêmeas e machos, com idade variando de P2 para P11.
- Anestesiar o rato com uma injecção intraperitoneal de 0,1 ml de 25 mM de pentobarbital sódico (50 mg / kg).
- Usando agulhas ou fita, imobilizar o mouse sobre as suas costas em uma grande placa de petri preenchida com silicone. Use um microscop dissecandoe para o resto da dissecção.
- Segurando a extremidade do esterno, levantar o peito e corte do diafragma utilizando uma tesoura fina. Em seguida, abra o baú em ambos os lados, cortando as costelas para expor o coração.
- Corte o átrio direito antes de perfurar o ventrículo esquerdo com uma agulha 27G.
- Perfundir com gelado de baixo Na + ACSF. Depois de 30 segundos, de baixo Na + ACSF deve ser visto que flui para fora do átrio. Baixa quantidade de sódio evitar que as células de spiking e reduzir a morte celular durante a dissecção.
- Manter que prende a agulha no coração sob o microscópio de dissecação até que o fígado torna-se amarela quando o sangue é drenada.
- Dissecção da medula espinhal
- Decapitar o animal e colocá-lo em seu estômago.
- Remover rapidamente a pele das costas (Figura 1A1). Faça dois cortes através dos ombros e indo para baixo da caixa torácica (Figura 1A2). Em seguida, corte o cabo como lOW quanto possível na secção de caudal de modo a isolar a coluna vertebral com o início das nervuras a partir da parte inferior do animal. Virar o animal novamente e remover as vísceras ainda ligado às costelas.
- Transferir a coluna vertebral para outro, menor placa de Petri cheia de silício e utilizar 4 pinos de insectos para segurá-la dorsal voltada para cima (Figura 1A).
- Continuamente perfundir o animal com ACSF borbulhou-carbogénio (a cerca de 4 ° C) durante a execução de uma laminectomia de lado dorsal, e expor a medula espinal a partir da extremidade rostral (Figura 1B). Para fazer isso, insira a ponta de uma tesoura fina entre o osso e da medula espinhal e cortar o osso, pouco a pouco a partir do final rostral, certificando-se de ficar longe da matéria branca. Suplente de cada lado ao usar uma pinça para manter longe a banda do osso já cortadas (Figura 1B1).
- Usando as mais pequenas tesouras primavera disponíveis e pinças, levante a dura e cortarem ambos os lados ao mesmo tempo que prende a parte solta da dura-máter de modo a evitar danificar a espinal medula com a tesoura. Corte ao longo do eixo rostro-caudal.
NOTA: A dura-máter é uma membrana contínua semi transparente; nesta idade a pia-máter é muito frágil e se parta durante a dissecção e corte (Figura 1B2). - Uma vez que a dura-máter é a utilização removeu um vidro sem corte ou a ponta de plástico para empurrar suavemente a cabo no lado esquerdo da ranhura formada pela coluna meia-cortada da coluna vertebral, e cortar as raízes ventrais e dorsais no lado direito, a partir do lado rostral , mais distante, onde eles entram na medula (alguns mm, pelo menos, Figura 1B2).
- Repita a operação do lado esquerdo, sempre indo de rostral para caudal. Se canhoto, comece a partir do lado esquerdo e, em seguida, passar para o lado direito.
- Incorporação em agar
- Deslize o cabo da coluna vertebral. Use um pino de insetos menores de fixar para baixoo cabo com o dorsal superfície para cima e delicadamente remover qualquer pedaço de membrana ainda ligado a ele (Figura 1C1).
- Uma vez limpo, cortar ambas as extremidades (Figura 1C2). Insira um pino de insetos dobrado na parte anterior da medula para manipular o cabo e observe a sua orientação (seta na Figura 1C2). Em seguida, transferir a medula espinal a uma solução de K-gluconato gelada.
NOTA: Esta solução imita a composição intracelular do CSF e impedirá que as células morram de choque osmótico uma vez que os neurónios motores serão cortados 26. - Uma vez que a medula espinal está dentro da solução intra-celular, levar o copo com o ágar para fora do banho seco e arrefece-se para baixo sobre uma mistura de gelo e água.
- Manter agitação enquanto se mede a temperatura. Quando a temperatura atinge 38 ° C mergulhe a medula espinhal, segurando-o pelo pino de insetos e colocá-lo lado rostral para baixo. Certifique-se a medula espinhal é como straight possível, longe das paredes, parte caudal ligeiramente para cima (Figura 1D1).
- Deixar o copo na mistura de gelo e água, para permitir o agar solidificar mais rapidamente possível. Certifique-se de que fique no lugar e que o cabo é o mais reto possível (Figura 1D1).
- Cortando
- Após a solidificação, cortar o bloco de agar contendo a medula espinal, de tal maneira que a base do bloco é a um ângulo de 35 ° com a parte lombar da medula (seta na Figura 1D2). A superfície dorsal deve estar voltada para longe da base (Figura 1D2).
NOTA: Este é um passo crítico no processo, para manter a continuidade das piscinas de neurónios motores para as raízes ventrais de onde eles saem. - Cole o bloco para dentro da câmara do vibratome utilizando de cola de cianoacrilato. Mergulhá-lo na solução de K-gluconato e adicionar solução de K-gluconato congelada slushed para mantero banho frio (abaixo de 2 ° C).
- Corte 350 - 400 mm fatias grossas de região lombar (identificável pela sua curvatura e diâmetro maior). Na sua orientação adequada (ver 1.4.1.), Use a lâmina para cortar a partir da dorsal à superfície ventral e fazer fatias continuamente mais rostral. Normalmente, existem 4-5 fatias adequados, com raízes ventrais que se estendem 2 mm ou mais. Utilize os seguintes parâmetros: 10 ° de ângulo, frequência de vibração 70 Hz e 10 mm Velocidade / min de corte.
- Após a solidificação, cortar o bloco de agar contendo a medula espinal, de tal maneira que a base do bloco é a um ângulo de 35 ° com a parte lombar da medula (seta na Figura 1D2). A superfície dorsal deve estar voltada para longe da base (Figura 1D2).
- Incubação
- Transferir as fatias para ACSF a 34 ° C. Após cerca de 30 min, arrefecer as fatias até à TA e começar a sessão de gravação.
Figura 1. Dissecção
A1:. A remoção da pele da parte de trás para expor a coluna dorsal A2:Corte dos ombros e costelas para libertar a coluna dorsal B1:. Coluna vertebral fixado na placa de Petri cheia de silício (lado dorsal para cima, lado caudal esquerda) B2:. Mesmo com a medula espinal exposta e dissecados C1:. Medular isolada . (lado rostral esquerda) C2: medular pronto para ser incorporado (lado ventral para cima, lado rostral esquerda). Observe o pino de insetos menores no lado rostral D1:.. Medular no copo de agar (lado rostral dow, lado ventral de frente para a parte inferior) D2: bloco de agar Cut com a medula espinhal incorporado. Nota o ângulo de 35 ° as formas medulares com a base do bloco e do alargamento lombar (Seta). Barras de escala 1 cm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Colocar a fatia para a Câmara
NOTA: Ventral raízes são de tamanho variável.
- Prepara-se uma caixa de várias pipetas com diâmetros ponta variando de 40 a 170 um com antecedência. Para preparar pipetas de sucção, prepare muitos pipetas com um longo cone. Usando uma faca de diamante, fazer um corte em diferentes posições. Em seguida, sob um microscópio de dissecação, quebrá-lo por bater a ponta com uma pinça.
- Retire a câmara do microscópio de gravação e colocá-lo sob um microscópio de dissecação.
- Seleccionar uma fatia que contém uma raiz ventral de comprimento suficiente (2 mm ou mais) para ser montado sobre um eléctrodo de estimulação de sucção. Marque a orientação correcta da fatia com as raízes ventrais para cima (Figura 2A) e delicadamente cortar o agar em torno das raízes ventrais, deixando o resto do agar em volta da fatia (Figura 2B).
Observação: Uma vez que o ágar é mais firme do que a fatia, isto irá permitir que os fios da âncora da fatia para descansar sobre o agar em vez de sobre a fatia e, assim, a umnchor não irá danificar o tecido. Certifique-se os fios da âncora do fatia estão acima do agregado neuromotor (mostrado em vermelho na Figura 2C). - Montar a câmara de volta para o microscópio e continuamente perfundir a câmara de registo com ACSF a uma taxa de 1-2 ml / min, à RT. Usando uma pipeta de vidro preenchido com ACSF e ligado a uma seringa, uma chupar da raiz ventral (seta na Figura 2C). A fim de alcançar uma boa estimulação da raiz ventral, a ponta da pipeta tem de ser apertado em torno da raiz ventral. Um pólo deverá estar no eléctrodo estimulante e o outro no banho (ou ligada ao eléctrodo de referência de fixação adesivo).
- Atingir gravação de patch-clamp do tipo de célula desejado e registar o efeito de estimulação da raiz ventral, tal como descrito materialização 10.
- Aqui, usar um amplificador para aquisição de dados. Filtrar gravações de célula inteira a 3 kHz. Digitalizar a 10 kHz. Compensar a resistência ponte em curreModo de NT-braçadeira.
Figura 2. Preparação de raiz ventral
A: fatia lombar da medula espinhal incorporado em agar com a raiz ventral para cima B:. Fatia da medula espinal lombar com as raízes ventrais libertados do agar C:. Fatia da medula espinal lombar com um eletrodo estimulante firmemente colocados ao redor das raízes ventrais (seta) . Observe a localização das células que expressam Renshaw fluorescência vermelha na 28 chrna2-Cre rato cruzado com o repórter do mouse R26 Tom 17. Barras de escala de 1 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Representative Results
Confirmação do motoneurônio Identidade Usando Potenciais antidrômica Ação
segmentação celular
Os motoneurónios são encontrados no corno ventral (no vermelho visível na Figura 2C). Iniciar a partir do feixe de axônios que formam a raiz ventral e ir até o feixe dispersa totalmente e um começa a ver grandes células (eixo longo Soma, acima de 20 mm). Alcançar a gravação de célula inteira de uma célula olhando em volta saudável usando um eletrodo de resistência inicial de 3-4 mohms. A solução interna utilizada continha: 140 mM de K-gluconato, KCl 6 mM, HEPES 10 mM, EGTA 1 mM, CaCl 0,1 2, 4 mM de Mg-ATP, 0,3 mM de Na 2 GTP. Ajustar o pH para 7,3 com KOH e a osmolaridade de 285-295 mOsm por adição de água destilada.
Quando a gravação de célula inteira é alcançada, aplicar uma única estimulação bifásica da raiz ventral (1-50 V, 0,1-0,3 ms) para provocar um potencial de ação antidrômica nas células gravadas da medula ventral Figuras 3A1 e 3A2 mostram ação antidrômica. potenciais de tensão-clamp ou corrente-clamp, respectivamente. Ao aumentar a intensidade de estimulação de 1 a 5 V (Figura 3A1) e de 10 a 15 V (Figura 3A2) o potencial de acção antidrômica aparece de uma forma de tudo-ou-nada, com uma latência de 0,9 ms e 1,1 ms, respectivamente. Tendo em conta que apenas neurónios motores enviam seus axônios através das raízes ventrais, o potencial de ação antidrômica é uma prova da identidade da célula. Numa minoria de neurónios motores (cerca de 10%), a estimulação da raiz ventral não conseguiuprovocar potencial de ação antidrômica mas sim provocada potenciais de ação ortodrômicas. Figuras 3B1 e 3B2 mostrar os potenciais de ação ortodrômicas de tensão-clamp ou corrente-clamp, respectivamente. Quando o aumento da estimulação entre 20 e 30 V (Figura 3B1) e 25 a 40 V (Figura 3B2), um potencial de acção exibida, seguindo um anterior excitatório corrente pós-sináptica (EPSC) ou excitatório pós-sináptico potencial (EPSP). As latências dos potenciais de ação são mais longos (5.1 ms e 5,3 ms, respectivamente). Nestas duas células, estimulando a raiz ventral provocou uma excitação feed-forward (motoneurônios enviar colaterais de axônios para si e para outros neurónios motores), que era forte o suficiente para provocar um potencial de ação orthodromic. Em tais células, o fracasso para eliciar um potencial de acção antidrômica (caracterizada pela sua forma de tudo-ou-nada e uma latência mais curta do que 5 ms) não permitem concluir que essas células AR e neurónios motores. Note-se que a intensidade de estimulação necessário para eliciar feed-forward de excitação é maior do que a necessária para provocar uma acção potencial antidrômica. Todas as estimulações aqui mostrados são de 0,1 ms, mas, por vezes, mais de estimulação (até 0,3 mseg) pode ser necessária para eliciar um potencial de acção antidrômica. Estimulação Renshaw celular segmentação celular As células de Renshaw são encontrados no corno anterior 27,28. Visualize os feixes de axônios com contraste (DIC) de imagens de interferência diferencial usando um 20x e 63x objetivos. Iniciar a partir do feixe de axônios que formam a raiz ventral e ir até os axônios começam a se dispersar, mas ainda são discerníveis (Figura 4A, setas). Alvo para as células de tamanho intermédio (com cerca de 10 - 15 um de diâmetro, a Figura 4A, pontas de seta). Alcançar a gravação de célula inteira de uma célula redonda com aparência saudável usando um eletrodo de resistência inicial de 5-7 mohms. Dependendo da experiência, utilizou-EIther Cs + baseado ou K + baseados em soluções internas 10. A solução baseia-Cs impediu grandes correntes de potássio que eram visíveis em torno de -45 mV. Em algumas experiências, nós também adicionados 5 mM QX-314 para bloquear os canais de sódio responsáveis pela cravação na célula registada. A + com base na solução Cs contém: 125 mM de Cs-gluconato, 5 mM de 314 QX-Cl, HEPES 10 mM, EGTA 10 mM, CaCl2 1 mM, 4 mM de Mg-ATP e GTP mM de Na-0,4, com o pH ajustado para 7,3 com CsOH. A + com base na solução de K deve ser utilizada para analisar, tanto em por tensão e corrente de pinça, as respostas de células de Renshaw a estimulação raiz ventral em condições aproximar tanto quanto possível os fisiológicos. Esta solução contém: mM de K-gluconato 125, HEPES 10 mM, EGTA 1 mM, CaCl 0,1 2, 4 mM de Mg-ATP, 0,4 mM de Na-GTP, com o pH ajustado para 7,3 com KOH. A intensidade do estímulo varia entre 10 e 100 V e a sua duração variou entre 50 e 300 ms. Bipo Lar pulsos foram usadas em todos os casos. Resposta das células de Renshaw à estimulação raiz ventral Estimulação da raiz ventral desencadeia a corelease de glutamato e acetilcolina dos neurónios motores colaterais sobre as células de Renshaw 10. Inibição feed-forward mediado por GABA e glicina também é recrutado 10. Figura 4B apresenta respostas à única estimulação da raiz ventral. A célula foi gravado num modo de tensão-grampo com a solução de base de césio, e mantida a uma voltagem de -45 mV. QX-314 na solução intracelular impediu a célula de disparo e GABA e glicina respostas foram bloqueados por 3 gabazine uM e 1 uM estricnina, respectivamente. A corrente sináptica para dentro na Figura 4B é a soma das correntes e glutamatérgica nicotínicos. 
Figura 3. Respostas motoneurônio para Estimulação raiz ventral
A1: 1 V (traço vermelho) e 5 V estímulos (traço preto) A2:.. 10 V (traço vermelho) e 15 V estímulos (traço preto) B1: 20 V (traço vermelho) e 30 V (traço preto) estimulações . B2: 25 V (traço vermelho) e 40 V estímulos (traço preto). Os pontos pretos indicam estímulo temporização. setas duplas enfatizar a diferença de latências entre picos orto- e antidrômicos.m / files / ftp_upload / 54525 / 54525fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 4. Estimulação celular Renshaw da raiz ventral
R: As imagens da piscina celular Renshaw adquiridos utilizando um condensador oblíquo na mesma fatia tomada em duas ampliações diferentes (20X e 40X objectivos). Observe os axônios de neurónios motores que se fundem na raiz ventral (seta). células putativo Renshaw são indicados com setas. Barras de escala: 100 mm na A1, 50 mm na A2 B:. Gravações de tensão-clamp de uma célula Renshaw após a estimulação da raiz ventral (ponto preto). O traço vermelho é a média dos cinzentos. tensão Holding foi fixado em -45 mV. QX-314 na solução intra-celular impediu a célula de disparo e GABA e glicina respostas foram bloqueados por 3 gabazine uM e 1 uM estricnina, respectivamente. ponto preto indica estímulo temporização.com / files / ftp_upload / 54525 54525fig4large.jpg "target =" / _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
corte oblíquo da medula espinhal é importante uma vez que permite a estimulação unilateral de piscinas de neurónios motores e células de Renshaw em um único segmento vertebral de uma forma fiável, completo e específico. Além disso, ele permite uma identificação rápida, elegante e não-ambígua de neurónios motores gravados. Em seguida, vamos destacar as vantagens desta técnica em comparação com outros métodos de preparação fatia, e depois vamos forçar para fora das armadilhas mais comuns para evitar durante a realização deste procedimento.
A maioria dos estudos que usam fatias transversais baseiam a sua identificação em propriedades eléctricas intrínsecas 3,14,15,29. No entanto, estas variam grandemente entre conjuntos de neurónios motores, bem como entre os subtipos de neurónios motores dentro de um determinado grupo (alfa-, beta- e gama-motoneurónios 30). Portanto, estudos utilizando parâmetros de tamanho são susceptíveis de excluir os menores gama-neurónios motores. Por outro lado, Cooper e d Sherringtonescribed em 1940 um grupo de células nervosas grandes na massa cinzenta ventro-lateral da medula espinhal lombar de macacos e gatos que haviam cruzado ascendente axônios 31,32. Além de ser perto do somas motoneurônio, eles notaram que eles apareceram histologicamente indistinguível de neurónios motores. Um artigo recente confirmou a existência de tais células no ratinho 33. Devido ao grande tamanho destas células e a sua localização, que poderiam ter sido erroneamente incluídos em estudos anteriores. Nosso critério de identificação exclui células de fronteira da coluna vertebral putativos, uma vez que o seu axônio não projeta na raiz ventral, permitindo a identificação confiável de todos os neurónios motores, independentemente do seu tamanho. Além disso, a análise das propriedades eléctricas intrínsecas, (por exemplo, a resistência de entrada), é mais demorada do que a simples observação de um potencial de acção antidrômica.
Além de utilizar as propriedades eléctricas intrínsecas, alguns Studies usando fatias transversais, confirmar a sua identificação através da realização de análise post hoc do marcador molecular para neurónios motores (como Islet-1/2 16) ou através da visualização da morfologia utilizando biocitina rotulamentos 14,17. Essas identificações são, porém tedioso e não fornecem uma identificação directa. Por conseguinte, eles são raramente executado sistematicamente.
Alguns estudos tentaram fazer uso do mouse linhas que expressam um marcador fluorescente motoneurônio geneticamente codificado (linha do rato Hb9-GFP 18, chat-EGFP ratinhos transgénicos, que expressam eGFP em células colinérgicos incluindo neurónios motores 19, ou ratinhos transgénicos G85R SOD1-YFP, que expressam fortemente a proteína de fusão YFP em neurónios motores 17). No entanto, porque a expressão do marcador genético é normalmente condicionado no tempo e uma vez que as fatias são geralmente tomadas a partir de embriões ou juvenis, a expressão do marcador pode não ser adequado no s a idadetudy é realizada. Outros estudos têm utilizado a injeção do meio retrógrada de visualizar o agregado neuromotor 34. Também realizamos cólera injeções de toxina beta no sóleo ou o EDL (observação pessoal). Tais técnicas de rotulagem são de grande valor para rotular um determinado agregado neuromotor, mas requerem cirurgia tediosa alguns dias antes do experimento. Além disso, a idade jovem em que os experimentos fatia estão sendo feitas, torna significativamente mais difícil de visar especificamente os músculos. Finalmente, existe uma preocupação real de perturbação do motoneurônio através da injeção de um agente exógeno.
Em condições óptimas, fomos capazes de obter potenciais de acção antidrômicos em praticamente todos os neurónios motores gravados. O ângulo de 35 ° utilizada é crítica para obtenção de raízes ventrais de comprimento suficiente. Em conclusão, a preparação fatia oblíqua oferece uma maneira rápida e fiável para identificar cada motoneurónio, que é superior a outras técnicas de identificação.
Tal como indicado na introdução, apenas dois estudos relataram estimulação bem sucedida das raízes ventrais em fatias transversais. O primeiro estudo registrou neurônios do colo do útero no rato e estimulou a substância branca, onde o toco de raiz ventral emerge 4. Eles induzida com sucesso potencial de ação antidrômica em 85% dos neurônios registrados. Acreditamos que a sua elevada taxa de sucesso baseou-se no fato de que, a nível cervical, os axônios e somas de neurónios motores estão no mesmo plano. Este não é o caso em fatias mais caudal. Mesmo ao nível cervical, suas fatias transversais só manteve topos das raízes ventrais, que são menos confiáveis para estimular. O segundo estudo estimulou o segmento dorso-lombar embrião de galinha 5. No entanto, eles usaram tensão gravação corante sensível, a qual faltava a resolução espacial para indicar o sucesso de induzir uma potenciais de acção antidrômicos ao nível da célula individual.
Nossa preparat fatiaion também oferece uma forma superior para estimular as células de Renshaw como afirmado em um artigo recente 28. Usando as fatias oblíquas, eles foram capazes de gravar monosinápticos Renshaw células respostas em 46% dos casos, o que foi uma grande melhoria a partir da taxa de sucesso de 10% encontrado usando fatias transversais 35. Embora não conseguimos encontrar uma comparação semelhante para a estimulação das piscinas de neurónios motores, essa observação na célula Renshaw nos leva a crer que motoneurônios também retêm mais conectividade.
corte oblíquo da medula espinhal é uma técnica altamente exigente, que requer muita prática antes de obter de forma confiável uma preparação a partir do qual se pode gravar. Com uma pinça muito finas e afiadas e micro-tesoura é essencial. O tempo gasto dissecando pode ser bastante longo (até 1 hora), desde que todo o procedimento é realizado em meio de dissecção borbulhou-carbogénio refrigerados. Enquanto alguns autores não reconhecer qualquer benefício de perfusio intracardíacan na preparação de fatias 36, decidimos manter este passo do processo. É difícil de medir objectivamente o benefício de perfusão intracardíaca para a qualidade das gravações, especialmente porque ela varia com a idade.
O fator mais crítico é a idade mouse. Gravamos com sucesso a partir de ratos entre P2 e P11 usando o protocolo acima. Passado essa idade, a mielina da medula espinhal torna-se demasiado densa e as maiores células (os motoneurônios) morrer antes de cortar, provavelmente devido à privação de oxigênio. Depois que a janela, descobrimos que é cada vez mais difícil de obter fatias saudáveis. Recentemente, as novas técnicas têm sido relatados para obter fatias saudáveis em animais mais velhos 17,36. Eles usaram aditivos extras para seu meio de dissecação e gravação, como fontes complementares de energia (etil-piruvato), menores de Na + e Cl - concentrações para evitar oncosis das células 37,38 e polietileno glicol para limitar o FEPECTS dos transectos membrana extensas que ocorrem durante o corte. Com essas melhorias, eles foram capazes de gravar a partir de até 6 meses de animais velhos.
No futuro, seria interessante tentar preparações fatia oblíquas em animais adultos, a combinar as vantagens das duas técnicas. Combinando os dois protocolos deverá revelar relativamente fácil e irá fornecer uma ferramenta confiável para confirmar a identidade motoneurônio e estudar a população alvo por colaterais dos axônios de neurónios motores em ratos adultos. Além disso, pode-se tentar obter fatias oblíquas no rato embrião. Digno de nota, a preparação também retém as raízes dorsais, que podem ser estimuladas para estudar a activação monossináptico eu uma inervação para os neurónios motores, bem como a activação de populações neuronais dorsais da medula espinhal. Em conclusão, estimulações raiz ventral oferecer uma ferramenta confiável para confirmar a identidade motoneurônio e estudar a população-alvo por colaterais motoneurônio axônio. </ P>
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Acknowledgments
Os autores agradecem Marin Manuel e Olivia Goldman-Szwajkajzer por sua ajuda em tomar as fotografias. Os autores agradecem também Arjun Masukar e Tobias Bock pela revisão do manuscrito. apoios financeiros foram fornecidos pela Agence Nationale pour la Recherche (Hyper-MND, ANR-2010-BLAN-1429-1401), o NIH-NINDS (R01NS077863), a Fundação Latran Thierry (OHEX Projeto), a associação francesa para miopatia ( número de concessão 16026) e Target ALS é reconhecido agradecimento. Felix Leroy foi o destinatário de um "Contrato de Doutorado" da Ecole Normale Supérieure, Cachan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Na-kynurenate | ABCAM | ab120256 | dissolves better then other brands |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| sucrose | Sigma | S9378 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | G Biosciences | R040 | |
| MgCl2 | Quality Biological | 351-033-721 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Na-pyruvate | Sigma | P2250 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Agar | Sigma | A9799 | |
| QX-314 | Alomone | Q150 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Na-GTP | Sigma | 51120 | |
| gluconic acid | Sigma | G1951 | |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Vannas Spring Scissors - 2.5mm | FST | 15000-08 | only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones |
| Stimulator | A-M Systems | Isolated Pulse Stimulator Model 2100 | |
| Vibratome | Campden | Vibrating Microtome 7000 - Model 7000smz-2 |
References
- Brooks, C. M., Downman, C. B., Eccles, J. C. After-potentials and excitability of spinal motoneurones following antidromic activation. J Neurophysiol. 13 (1), 9-38 (1950).
- Bories, C., Amendola, J., Lamotte d'Incamps, B., Durand, J. Early electrophysiological abnormalities in lumbar motoneurons in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 25 (2), 451-459 (2007).
- Takahashi, T. Membrane currents in visually identified motoneurones of neonatal rat spinal cord. J Physiol. 423, 27-46 (1990).
- Hori, N., Tan, Y., Strominger, N. L., Carpenter, D. O. Intracellular activity of rat spinal cord motoneurons in slices. J Neurosci Methods. 112 (2), 185-191 (2001).
- Arai, Y., Mentis, G. Z., Wu, J. Y., O'Donovan, M. J. Ventrolateral origin of each cycle of rhythmic activity generated by the spinal cord of the chick embryo. PLoS One. 2 (5), e417 (2007).
- Cullheim, S., Lipsenthal, L., Burke, R. E. Direct monosynaptic contacts between type-identified alpha-motoneurons in the cat. Brain Res. 308 (1), 196-199 (1984).
- Cullheim, S., Kellerth, J. O., Conradi, S. Evidence for direct synaptic interconnections between cat spinal alpha-motoneurons via the recurrent axon collaterals: a morphological study using intracellular injection of horseradish peroxidase. Brain Res. 132 (1), 1-10 (1977).
- Gogan, P., Gueritaud, J. P., Horcholle-Bossavit, G., Tyc-Dumont, S. Direct excitatory interactions between spinal motoneurones of the cat. J Physiol. 272 (3), 755-767 (1977).
- Ichinose, T., Miyata, Y. Recurrent excitation of motoneurons in the isolated spinal cord of newborn rats detected by whole-cell recording. Neurosci Res. 31 (3), 179-187 (1998).
- Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. Four excitatory postsynaptic ionotropic receptors coactivated at the motoneuron-Renshaw cell synapse. J Neurosci. 28 (52), 14121-14131 (2008).
- Renshaw, B. Central effects of centripetal impulses in axons of spinal ventral roots. J Neurophysiol. 9, 191-204 (1946).
- Renshaw, B. Interaction of nerve impulses in the gray matter as a mechanism in central inhibition. Fed Proc. 5 (1 Pt 2), 86 (1946).
- Renshaw, B. Observations on interaction of nerve impulses in the gray matter and on the nature of central inhibition). Am J Physiol. 146, 443-448 (1946).
- Pambo-Pambo, A., Durand, J., Gueritaud, J. P. Early excitability changes in lumbar motoneurons of transgenic SOD1G85R and SOD1G(93A-Low) mice. J Neurophysiol. 102 (6), 3627-3642 (2009).
- Quinlan, K. A., Schuster, J. E., Fu, R., Siddique, T., Heckman, C. J. Altered postnatal maturation of electrical properties in spinal motoneurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Physiol. 589 (Pt 9), 2245-2260 (2011).
- Martin, E., Cazenave, W., Cattaert, D., Branchereau, P. Embryonic alteration of motoneuronal morphology induces hyperexcitability in the mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol Dis. 54, 116-126 (2013).
- Hadzipasic, M., et al. Selective degeneration of a physiological subtype of spinal motor neuron in mice with SOD1-linked ALS. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16883-16888 (2014).
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
- Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
- Manuel, M., et al. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. J Neurosci. 29 (36), 11246-11256 (2009).
- Obeidat, A. Z., Nardelli, P., Powers, R. K., Cope, T. C. Modulation of motoneuron firing by recurrent inhibition in the adult rat in vivo. J Neurophysiol. 112 (9), 2302-2315 (2014).
- Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, (2014).
- Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Zytnicki, D. Potassium currents dynamically set the recruitment and firing properties of F-type motoneurons in neonatal mice. J Neurophysiol. 114 (3), 1963-1973 (2015).
- Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. Subunit composition and kinetics of the Renshaw cell heteromeric nicotinic receptors. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1114-1121 (2013).
- Lamotte d'Incamps, B., Krejci, E., Ascher, P. Mechanisms shaping the slow nicotinic synaptic current at the motoneuron-renshaw cell synapse. J Neurosci. 32 (24), 8413-8423 (2012).
- Dugue, G. P., Dumoulin, A., Triller, A., Dieudonne, S. Target-dependent use of co-released inhibitory transmitters at central synapses. J Neurosci. 25 (28), 6490-6498 (2005).
- Mentis, G. Z., Siembab, V. C., Zerda, R., O'Donovan, M. J., Alvarez, F. J. Primary afferent synapses on developing and adult Renshaw cells. J Neurosci. 26 (51), 13297-13310 (2006).
- Perry, S., et al. Firing properties of Renshaw cells defined by Chrna2 are modulated by hyperpolarizing and small conductance ion currents Ih and ISK. Eur J Neurosci. 41 (7), 889-900 (2015).
- Thurbon, D., Luscher, H. R., Hofstetter, T., Redman, S. J. Passive electrical properties of ventral horn neurons in rat spinal cord slices. J Neurophysiol. 79 (5), 2485-2502 (1998).
- Zengel, J. E., Reid, S. A., Sypert, G. W., Munson, J. B. Membrane electrical properties and prediction of motor-unit type of medial gastrocnemius motoneurons in the cat. J Neurophysiol. 53 (5), 1323-1344 (1985).
- Cooper, S., Sherington, C. S. Gower's tract and spinal border cells. Brain. 63, 123-124 (1940).
- Morin, F., Schwartz, H. G., O'Leary, J. L. Experimental study of the spinothalamic and related tracts. Acta Psychiatr Neurol Scand. 26 (3-4), 371-396 (1951).
- Sengul, G., Fu, Y., Yu, Y., Paxinos, G. Spinal cord projections to the cerebellum in the mouse. Brain Struct Funct. 220 (5), 2997-3009 (2015).
- Russier, M., Carlier, E., Ankri, N., Fronzaroli, L., Debanne, D. A-, T-, and H-type currents shape intrinsic firing of developing rat abducens motoneurons. J Physiol. 549 (Pt 1), 21-36 (2003).
- Dourado, M., Sargent, P. B. Properties of nicotinic receptors underlying Renshaw cell excitation by alpha-motor neurons in neonatal rat spinal cord). J Neurophysiol. 87 (6), 3117-3125 (2002).
- Mitra, P., Brownstone, R. M. An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse. J Neurophysiol. 107 (2), 728-741 (2012).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. J Neurosci. 5 (6), 1483-1489 (1985).
- Olney, J. W., Price, M. T., Samson, L., Labruyere, J. The role of specific ions in glutamate neurotoxicity. Neurosci Lett. 65 (1), 65-71 (1986).
