前根刺激のための斜め脊髄スライスの調製

Abstract

脊髄切片からの電気生理学的記録は、携帯電話からネットワーク特性に問題の広い範囲を調査する価値のある技術であることが証明されています。私たちは、若いマウス（ - P11 P2）の脊髄の実行可能な斜めのスライスを準備する方法を示しています。この準備では、運動ニューロンは脊髄の前根から出てくる彼らの軸索を保持します。これらの軸索の刺激は脊髄内の運動ニューロンのSOMAの、エキサイティングな運動ニューロン担保に侵入バック伝搬する活動電位を誘発します。逆行性活動電位の記録は、他の識別方法を上回る運動ニューロンのアイデンティティを、特徴付けるため、即時の決定的かつエレガントな方法です。また、運動ニューロンの担保を刺激することは、他の運動ニューロンまたはRとして、脊髄内の運動ニューロンの担保対象を励起するためのシンプルで信頼性の高い方法であります細胞をenshaw。このプロトコルでは、我々は前根刺激に起因する、逆行運動ニューロンのSOMAのからの記録だけでなく、レンショウ細胞の興奮を提示します。

Introduction

歴史的に、シャープな電極を用いた運動ニューロンの記録は、例えば、ネコやネズミ¹などの大型動物やマウス²で分離された全脊髄のin vivoで行われました。 SOMAの必要なシールのような運動ニューロンへの直接アクセスを呼びかけ1980年代にパッチクランプ記録技術の出現は、視覚的な指導の下で達成されます。したがって、脊髄スライス標本は容易に1990年代初頭³は達成されています。しかし、初期のスライス標本は、多くの場合、前根を刺激することができませんでした。我々の知る限り、唯一の二つの研究は、横断スライスにおける腹側根の成功刺激を報告している、とどれもマウス^4,5から得られませんでした。

運動ニューロンプールはその前根を逸脱軸索を保持する - この記事では、新生児マウス（P11 P2）の実行可能な脊髄スライスを達成するための手法を提示します。ベントRALルート刺激は同じ前根から出た運動ニューロンプールのSOMAのに戻し逆行性活動電位をトリガします。また、運動ニューロン担保対象、他の運動ニューロン^6-10とレンショウ細胞^11-13を励起^します 。唯一の運動ニューロンは、前根ダウンその軸索を送っているので、我々は運動ニューロン^10を識別physiologicalyするための簡単で確実な方法として、逆行性活動電位の記録を使用します。

運動ニューロンのアイデンティティを確認するために、潜在的に非包括的または誤解を招く電気生理学的および形態学的な規準を使用することに加えて、脊髄運動ニューロン上の最近の研究はまた、面倒で時間のかかる事後染色¹⁶に依存していました。このような識別は、通常は記録された細胞のサンプルに対して実行されます。他の特定の戦略は、運動ニューロンの内因性蛍光を発現するマウス系統に依存しています1,2,20,21ため、このような識別技術を使用しています。最適な条件では、記録された運動ニューロンの事実上すべてから逆行性活動電位を誘発することができました。

また、前根刺激は確実に他の運動ニューロン^22,23、またはそれらの標的を励起するために使用することができます。レンショウ細胞^10,24,25。ここでは、運動ニューロンのSOMAのからの逆行性活動電位記録の形で前根刺激の用途だけでなく、レンショウ細胞の興奮を提示します。

Protocol

実験は、欧州指令（609分の86 / CEEと2010から63-UE）とフランスの法律に従って行われ、パリデカルト大学の倫理委員会によって承認されました。

1.脊髄スライスの準備

1. 毎日、以下の溶液を調製するか、事前に1日。場合は95％O ₂および5％CO ₂で一晩、バブルを維持し、密閉瓶で冷蔵保管してください。
   1. 低のNa ⁺人工脳脊髄液（ACSF）を準備：3のKCl、1 mMののNaH ₂ PO _4、230mMのスクロース、26 mMの_炭酸水素ナトリウム、0.8mMのCaCl ₂を、8のMgCl _2、25 mMグルコース、0.4 mMのアスコルビン酸、 1 mMののNa-kynurenate、2 mMのピルビン酸ナトリウム。 95％O ₂および5％CO _2（pH7.4）でバブル。 Na-kynurenateは、多くの場合、溶解することが困難であるので、材料の表に記載されているものを購入することを確認します。
   2. K-グルコン酸ソリューを準備ン：KOHでpH7.4に調整130mMのK-グルコン酸塩、15mMのKClを、0.05 mMのEGTA、20mMのHEPES、25 mMグルコース、1mMのNaをkynurenate、2 mMのピルビン酸ナトリウム、。
   3. 準備ACSF：130のNaCl、2.5mMのKClを、2mMのCaCl ₂を、1mMのMgCl _2、1mMののNaH ₂ PO _4、26 mMの_炭酸水素ナトリウム、25 mMグルコース、0.4mMのアスコルビン酸、2mMのナトリウムピルビン酸。 95％O ₂および5％CO _2（pH7.4）でバブル。
   4. 解剖の開始前に、K-グルコン酸溶液を80ミリリットルで2％寒天を溶解し、60℃で保温。
2. 心臓内灌流
   1. P2からP11までの年齢に至るまで、雌雄のマウスにこの準備を行います。
   2. 25mMのペントバルビタールナトリウム（50mg / kg）の0.1mlを腹腔内注射してマウスを麻酔。
   3. 針やテープを使用して、シリコンを充填した大型シャーレに背の上でマウスを固定化します。解剖顕微鏡を使用して、解剖の残りの電子。
   4. 胸骨の先端を持ち、胸を持ち上げ、細かいハサミを使用して、振動板をカット。その後、心臓を露出するためにリブを切断することにより、両側の胸を開きます。
   5. 27G針で左心室を穿刺する前に、右心房をカットします。
   6. 氷のように冷たい低いのNa ⁺ ACSFで灌流します。 30秒後に、低いのNa ⁺ ACSFは、心房から流出見られるべきです。ナトリウムの低い量はスパイクから細胞を防止し、解剖時に細胞死を減少させます。
   7. 血液が排出される際に肝臓が黄色になるまで解剖顕微鏡下で心臓に針を保持し続けます。
3. 脊髄の解剖
   1. 動物の首をはねるとそのお腹の上に置きました。
   2. 素早くバック（ 図1A1）の皮膚を除去。肩を介して2つのカットを行い、胸のケージ（ 図1A2）を下って行きます。その後リットルとしてコードをカット動物の下部からリブの始まりと脊柱を分離するために、尾部でできるだけOW。再び動物を裏返し、まだリブに取り付けられた内臓を取り除きます。
   3. 別の脊柱を移し、より小さなシリコンで満たされたペトリ皿と背側を上（ 図1A）、それを保持するために4虫ピンを使用します。
   4. 背側の椎弓切除を行い、吻側端（ 図1B）から脊髄を露出させながら、連続的に（約4℃）カーボゲンバブリングACSFで動物を灌流。これを行うには、骨と脊髄の間の微妙なハサミの先端を挿入し、白質から離れて滞在することを確認して、吻側端から少しずつ骨を切りました。それぞれの側に代替すでに（ 図1B1）カット骨のバンドを離れて保つためにピンセットを使用している間。
   5. 利用可能な最小春のはさみとピンセットを使用して、硬膜とカットを持ち上げますはさみで脊髄を損傷しないようにするために、両側に硬膜の緩い部分を保持したまま。吻側 - 尾側軸に沿って切断。
      注：硬膜は、半透明の連続膜です。この年齢で軟膜はあまりにも脆く、解剖やスライシング（ 図1B2）の間に離れて来ます。
   6. 硬膜は、吻側側から、使用に優しくハーフカット脊柱によって形成された溝の左側にコードをプッシュし、右側の腹側と背側根をカットする鈍いガラスやプラスチックの先端を除去されると、彼らは（少なくとも数mm、 図1B2）コードを入力する場所から遠いです。
   7. 常に頭側から尾側に行く、左側の操作を繰り返します。左利きの場合は、左側から開始し、右側に移動します。
4. 寒天に埋め込みます
   1. 脊柱の外にコードをスリップ。突き止めるために小さい虫ピンを使用しますコード背面を上にしてと繊細にはまだ（ 図1C1）それに接続されている膜の任意の部分を削除します。
   2. 洗浄後は、両端（ 図1C2）をトリミングします。コードを操作し、その向き（ 図1C2の矢印）を注意することは、コードの前部に曲がった虫ピンを挿入します。その後、氷冷K-グルコン酸溶液に脊髄を転送します。
      注：このソリューションは、CSFの細胞内の組成を模倣し、運動ニューロンが^26をカットされます一度浸透圧ショックで死ぬから細胞を防ぐことができます。
   3. 脊髄がイントラセルラーソリューション内になると、乾燥槽の外に寒天を入れたビーカーを取り、氷と水の混合物でそれをクールダウン。
   4. 温度を測定しながら攪拌してください。温度が到達すると38°Cは、虫ピンでそれを保持し、脊髄を浸すとダウンそれを吻側側に配置します。脊髄は、STのようであることを確認してくださいraight可能な限り、離れて尾部、壁からやや上向き（ 図1D1）。
   5. 寒天は、可能な限り迅速に固化することを可能にするために氷と水の混合物中にビーカーを残します。それは場所にとどまり、コードが直（ 図1D1）可能な限りであることを確認してください。
5. スライス
   1. 固化した後、ブロックのベースはコード（ 図1D2の矢印）の腰部に35°の角度になるように脊髄を含む寒天ブロックをカット。背面は、ベース（ 図1D2）から反対されるべきです。
      注：これは、彼らが終了し、そこから前根に運動ニューロンプールの連続性を維持するための手順における重要なステップです。
   2. シアノアクリレート接着剤を使用して、ビブラのチャンバ内にブロックを接着。維持するために、K-グルコン酸溶液中に浸し、酔っぱらった冷凍K-グルコン酸溶液を加え（2℃以下）チルド風呂。
   3. （その曲率と大きい直径によって識別）腰部の400μmの厚さにスライス - 350をカットします。その正しい向き（1.4.1を参照。）で、腹面に背側から切り取り、スライス連続より吻側を作るためにブレードを使用しています。一般的に、2mm以上を拡張する前根と4-5の適切なスライスがあります。 10°の角度、70 Hzの振動周波数とスライスの10mm /分の速度：次のパラメータを使用します。
6. インキュベーション
   1. 34℃でACSFにスライスを転送します。約30分後、RTにスライスを冷却し、記録セッションを開始します。

図1.解剖
A1：脊柱を露出させるために背中の皮膚の除去A2：脊柱を解放するために肩や肋骨の切断B1：脊椎のコラムはシリコンで満たされたペトリ皿（背側を上、左尾側）に固定B2：脊髄露出し、解剖と同じC1：脊髄孤立。（左吻側側）C2：埋め込みする準備ができて脊髄（腹側まで、吻側側左）。吻側側の小さい虫ピンに注意してくださいD1：寒天ビーカー（吻側側ウ、底に面した腹側）で脊髄D2：埋め込まれた脊髄と寒天ブロックをカット。 35°の角度にブロックのベースと腰膨大（矢印）と脊髄のフォームを注意してください。スケールバー1センチメートル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

2.チャンバー内にスライスを配置します

注：Veはntral根は可変サイズです。

1. 事前に40から170ミクロンまでの範囲の先端径を有する様々なピペットの箱を用意します。吸引ピペットを準備するには、長いテーパーで、多くのピペットを準備します。ダイヤモンドナイフを使用して、異なる位置で切断してください。その後、解剖顕微鏡下で、ピンセットで先端を押すことでそれを破ります。
2. 記録顕微鏡から室を削除し、解剖顕微鏡下に置きます。
3. 吸引刺激電極上に搭載されるのに十分な長さ（2mm以上）の腹側のルートを含むスライスを選択します。前根とスライス上方（ 図2A）の適切な方向を選択し、スライス（ 図2B）の周りに寒天の残りの部分を残しながら微妙に前根の周りに寒天をカット。
   注：寒天は、スライスよりもより強固であるため、これはスライスのアンカーのスレッドが寒天上ではなくスライス上に静止することができますので、Anchorは、組織を損傷することはありません。スライスのアンカーのスレッドが（ 図2Cに赤で示されている）運動ニューロンプールの上にあることを確認します。
4. 顕微鏡上にバックチャンバーをマウントし、継続的に1の割合でACSFで記録チャンバーを灌流 - 室温で、2ml /分。ガラスピペットACSFを充填したシリンジに接続を使用して、前根（ 図2Cの矢印）のいずれかを吸います。前根の良い刺激を達成するために、ピペットチップは、前根の周りにタイトにする必要があります。一方の極には、刺激電極と他の浴中で1つ（またはパッチクランプ電極基準に接続されている）であるべきです。
5. 所望の細胞型のパッチクランプ記録を達成し、previsouly ¹⁰記載されているように前根刺激の効果を記録。
   1. ここでは、データ収集のためのアンプを使用しています。 3 kHzでホールセル記録をフィルタリングします。 10kHzでデジタル化します。 curreにブリッジ抵抗を補償NT-クランプモード。

図2.前根の準備
：上を向いて前根と寒天中に埋め込まれた腰椎脊髄スライスB：寒天から解放された前根と腰椎脊髄スライスC：しっかりと前根（矢印）の周りに配置され刺激電極と腰椎脊髄スライス。マウスレポーターR26 ^{トム・17。}スケールバー1ミリメートルと交配chrna2-Creをマウス²⁸で赤色蛍光を発現しているレンショウ細胞の位置に注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Na-kynurenate	ABCAM	ab120256	dissolves better then other brands
KCl	Sigma	P3911
NaH2PO4	Sigma	P5655
sucrose	Sigma	S9378
NaHCO3	Sigma	S6014
CaCl2	G Biosciences	R040
MgCl2	Quality Biological	351-033-721
glucose	Sigma	G5767
ascorbic acid	Sigma	A5960
Na-pyruvate	Sigma	P2250
K-gluconate	Sigma	P1847
EGTA	Sigma	E3889
HEPES	Sigma	H4034
NaCl	Sigma	S9888
Agar	Sigma	A9799
QX-314	Alomone	Q150
Mg-ATP	Sigma	A9187
CsOH	Sigma	232041
Na-GTP	Sigma	51120
gluconic acid	Sigma	G1951
Cesium hydroxide solution	Sigma	232041
KOH	Sigma	P5958
Vannas Spring Scissors - 2.5mm	FST	15000-08	only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones
Stimulator	A-M Systems	Isolated Pulse Stimulator Model 2100
Vibratome	Campden	Vibrating Microtome 7000 - Model 7000smz-2