Abstract
뉴 라미니다 아제에 대한 항체 (NA), 인플루엔자 바이러스의 두 번째 가장 풍부한 표면 단백질은 인플루엔자에 대한 보호에 기여할. 전통적인 방법은 NA가 억제 측정하기 (NI) 항체 역가 일상 혈청학 실용적되지 않습니다. 이 프로토콜은 효소 - 결합 렉틴 분석 (엘라) 많은 당 단백질 기판 fetuin 코팅 96 웰 플레이트에서 수행된다 NI 역가를 측정하기위한 실용적인 대안적인 방법을 설명한다. NA의 절단 터미널 시알 fetuin에서 산, 끝에서 두 번째 설탕을 노출, 갈락토스. 땅콩 응집소 (PNA)은 퍼 옥시다아제 발색 기질의 첨가에 이어 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 - PNA 복합체를 사용하여 정량화 될 수 갈락토오스 및 특이성의 탈시 알릴 화 따라서 정도와 렉틴이다. 측정 된 광학 밀도는 NA 활성에 비례한다. NI 항체 역가를 측정하기 위해, 혈청의 연속 희석은 37 CO에서 배양 / 고정 된 양 오와 fetuin-코팅 된 플레이트에 NF NA. NA 활성의 ≥50 % 억제를 초래 최대 혈청 희석의 역수는 NI 항체 역가로서 지정된다. 엘라는 인플루엔자 감염이나 예방 접종 다음 인간 항체 반응의 일상적인 평가를위한 실제적인 형식을 제공합니다.
Introduction
뉴 라미니다 제 (NA)는 인플루엔자 바이러스 입자의 표면에 발현되는 당 단백질이다. 그 효소 활성 1,2- 감염된 세포에서 새롭게 형성된 바이러스 입자의 방출을 위해 필수적이다. NA 활성 억제하는 항체는 동물 모델 3의 바이러스 역가 및 질병의 증상을 감소시키고 인간 4 질병에 대한 내성과 상관 관계. 전통적인 분석 루틴 혈청학 비실용적이다 NI 항체 역가를 측정하기 때문에 NA 억제 (NI) 역가 백신 접종의 증가 때문에 그러나 많은 과거 인플루엔자 면역 원성 연구에서,이 엔드 포인트를 포함하지 않은 백신의 효능의 지표를 제공 할 수있다.
NI 역가를 측정하기위한 전통적인 방법은 NA (1)에 의해 복합 당질로부터 절단되는 시알 산의 양을 정량화에 기초한다. 종종 대한 TBA (TBA) 방법이라 함이 방법은, 시알 AC 변환 유해 화학 물질을 사용하여분석에 의해 정량화 할 수있는 발색단에 ID입니다. 분석은 각각의 유리관을 사용하고 있기 때문에, 시료의 다수를 테스트하는 분석법이 번잡하게 적합하지 않다. 96- 웰 플레이트에 상기 분석의 소형화 그러나 이러한 분석은 여전히 독성 화학 물질의 사용을 필요로하기 때문에 이상적이지 않다 좀더 실용적인 형태 5를 제공한다.
NI 항체 역가를 측정하는 다른 분석은 Lambré 외. (6)에 의해 개발되었다. 이 분석은 시알 산 NA에 의해 해제 될 때 노출된다 당단백, 갈락토오스의 끝에서 두 번째 설탕의 양을 측정하여 효소 활성을 정량화한다. 땅콩 응집소 (PNA)을 갈락토스에 특이 적으로 결합 때문에, PNA-고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRPO) 접합체 비색 판독을 얻기 위해 사용될 수있다. 측정 된 광학 밀도는 샘플의 NA 활성에 따라서 비례한다. NI 역가가 높은 희석을 결정함으로써 측정개구 활성의 적어도 50 %를 억제하는 혈청. 이 효소 - 결합 렉틴 분석 (엘라) NA 용 기판으로서, fetuin 고도로 당화 혈청 단백질로 코팅 된 96- 웰 플레이트에서 수행된다.
NI 역가를 측정하는 분석법에 대한 중요한 고려 사항은 NA의 근원이다. 백신 또는 감염된 개인의 혈청이 NA로 헤 마글 루티 닌 (HA) 항체뿐만 아니라 항체를 포함하기 때문이다. HA에 결합하는 항체는 NA 활성을 방해 할 수 있으므로, 분석에 사용한다 항원 부정합 HA-HA를 포함하는 특이 적 항체에 의한 비특이적 억제 정제 NA 또는 전체 바이러스 않도록. 이러한 바이러스는 유전자 재 고전 또는 역 유전학에 의해 생성 될 수있다; 목적은 연구중인 바이러스의 대상 균주에 관련되지 않는 서브 타입의 HA를 포함하는 바이러스를 구출이며, NA. 이 문서에서 설명하는 분석은 회전에 의해 생성 된 인플루엔자 A 바이러스를 사용인플루엔자 A 바이러스, 서브 타입 H1N1 및 H3N2 5에서 서브 타입 H6의 HA 및 NA 대상을 포함 유전학을 ERSE.
엘라에 의해 생성 된 결과 및 소형화 TBA 분석은 이러한 방법이 유사한 하위 특이성과 민감도 7, 비교할 보여줍니다. 엘라 유해 화학 물질의 사용을 필요로하므로 NI 역가를 측정하기위한 바람직한 방법이다 않는다. 단지 몇 단계 (그림 1)을 수행하기 쉬운 : 샘플을 희석하고, 추가되는 fetuin 코팅 된 플레이트 바이러스 (NA의 소스)로 전송됩니다. 플레이트는 O / N을 배양하고 PNA-HRPO를 추가하기 전에 세척한다. 2 시간 배양 후, 플레이트를 세척하고 퍼 옥시 다제 기질을 첨가한다; 색 반응은 정지되고, 최종적으로 광학 밀도를 측정 및 NA 활성의 적어도 50 % 저해를 초래 시료 희석액의 역수는 50 % 종점 역가로서보고된다. 인트라 실험실 연구는 reproducibili을 평가하기엘라의 타이는 판에 판 변동성을 최소화하고 연산자 - 투 - 운영자 반복성이 역가 7 개 이하의 2 배 차이의 결과 것으로 나타났다. 엘라 변동의 후속 간 실험실 연구는 서로 다른 실험실에서 수행하고 표준의 포함이 더 결과 8 변동성을 줄일 수 있습니다 때 분석이 좋은 재현성을 가지고 있음을 보여 주었다. 엘라 전임상 및 임상 인플루엔자 백신 연구 7에서 혈청 패널에서 NI 항체 역가를 측정하기에 적합하며 또한 인플루엔자 바이러스 (9)의 사이의 NA 항원 차이를 평가하기 위해 사용될 수있다.
Protocol
조류 구성 요소와 모든 살아있는 된 재조합 바이러스는 바이오 안전성 레벨을 미국 농무부 (USDA) 및 제도적 바이오 안전성위원회에 의해 사용이 승인 실험실 - 향상된 사례 2 (BSL2)를 사용하여 처리해야합니다.
시약 및 출발 물질의 제조 1
주 : 모든 시약의 소스를 획득하기 위해 상기 재료 표를 참조.
- Fetuin 코팅 된 플레이트
- 90 ml를 10 ml의 10 배 코팅 완충액을 혼합하여 코팅 버퍼를 준비하여 H 2 O를 탈
- -20 ℃에서 500 μL 씩 도포에 1X 버퍼 저장에 25 ㎎ / ㎖의 fetuin의 스톡 용액을 제조 하였다.
- 1 배 코팅 버퍼를 1,000 배 원액을 희석하여 즉시 코팅 플레이트 전에 fetuin (25 μg의 / ㎖)의 작업 솔루션을 준비합니다.
- 알로 fetuin의 작동 용액 100 ㎕를 분배하는 멀티 채널 피펫을 사용하여높은 단백질 결합능을 갖는 96- 웰 플레이트의 웰 L.
- 다음 10의 그룹으로 판을 쌓아 호일을 감싸 접시 시일 각 플레이트를 커버.
- 분석법을 수행하기 전에 냉장고 (2-8 ° C)에 대한 최소 18 시간에서 접시를 놓습니다.
주 : 플레이트를 미리 도포하고, 최대 2 개월 동안 2-8 ℃에서 상기 코팅 용액으로 저장 될 수있다.
- 희석제
- 94.2 mL의 혼합 바이러스 샘플 희석액 (2- (N의 -morpholino) 에탄 설 폰산 (MES)의 pH 6.5, 20 mM의 CaCl2를 1 % 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.5 % 트윈 20)를 만들기 위해, 희석제를 제조 1X MES, 2 ml의 CaCl2를 (10 ㎎ / ㎖)으로 pH 6.5, 3.3 ml의 30 % BSA 및 0.5 ㎖의 트윈 20.
- 2ml의 CaCl2를 (10 ㎎ / ㎖)가 94.7 ㎖의 1X의 MES, pH가 6.5를 혼합, PNA-HRPO (MES, 20 mM의 CaCl2를하고 1 % BSA으로 pH 6.5)에 희석을 준비하고, 3.3 ml의 30 % BSA하려면 .
- 뉴 라미니다 아제 (NA)
참고 : H6Nx 바이러스 reass게시 된 방법 5,10 다음 ortants (이러한 H6 서브 타입의 HA와 관심의 NA가) 생성됩니다. 그들은 사내 사용할 수없는 경우 공동 작업자에서 불 활성화 된 재조합 바이러스의 튜브를 요청합니다. 불 활성화 된 바이러스를 사용하는 경우, 제제는 비활성화 프로세스 NA 활성에 큰 영향을 미치지 않았다 시범을 통해 엘라에 사용하기에 적합한 것으로 확인.- 문화 발육 계란 11 H6Nx 바이러스의 재고 및 -80 ° C에서 깔끔한 뇨 유체의 0.5 ml의 분취 량을 저장합니다.
- 각 분석에 대한 바이러스의 새로운 나누어지는을 사용합니다. 동결 및 분취 액을 해동하지 마십시오.
- 혈청 샘플 및 컨트롤
- 모든 혈청 열 불 활성화 (시험 샘플을 예를 들면, 전후 접종 혈청뿐만 아니라 제어, 예를 들면, 공지 된 NI 역가 샘플) 45 ~ 60 분 동안 56 ℃에서 물 중탕한다. 전 또는 열처리 후 -20 내지 -70 ℃에서 혈청 보관. SAMP의 경우레 반복 시험 샘플 반복 냉동 융해되지 않도록 동결 전에 몇 분취 량을 확인하여야한다.
- 높은 역가와 적어도 낮은 역가와 다른 하나를 식별하는 (> 5 ㎖) 합리적인 수량에서 사용할 수있는 인간 혈청의 NI 역가를 측정 할 수 엘라를 사용합니다. 100 μL 씩 저장 ≤ 20 ° C 동일한 샘플 분석 성능을 추적하기 위해 많은 검정에서 대조군으로 사용할 수 있도록.
- 피넛 응집소 (PNA) - 서양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRPO)
- PNA-HRPO 희석제 (MES, CaCl2를 1 % BSA를 사용하여 pH 6.5)을 준비한다.
- 희석제를 1ml PNA-HRPO 1 mg을 용해하여 PNA-HRPO 스톡 용액을 제조 하였다. -20 ° C에서 20 ~ 200 μL 씩 보관하십시오.
- (양성 대조군으로 최대 OD 결과 양을 확인하려면이 시약의 2000 희석 (바이러스 만 해당) 및 배경 : 500, 1 : 750, 1 : 1,000 및 1 새로운 PNA-HRPO 많은 테스트 1을 사용하기 전에 더 바이러스) t 없습니다모자는 <인 긍정적 인 신호의 10 %.
- 2.1 절에 설명 된대로 사통 바이러스 희석합니다.
- 2.2 절에 설명 된대로 fetuin 코팅 된 플레이트에 희석을 전송하고 37 ° C에서 접시를 품어.
- 16 ~ 18 시간 후 접시를 씻으 1 추가 : 접시의 행을 복제 PNA-HRPO 2,000 희석 (100 μL / 웰) : 500, 1 : 750, 1 : 1,000 및 1.
- 2.3.9에 단계 2.3.4에 설명 된대로 분석을 완료합니다.
- > 10 배 배경입니다 최대 신호 결과 희석을 선택하기 위해 데이터를 검토합니다.
- 즉시 사용하기 전에, 1.5.3에서 확인 된 PNA-HRPO의 최적 희석을 준비합니다.
- 세척 완충액 (0.01 M 인산염 완충 식염수 (PBS), pH 7.4의 0.05 % 트윈 20 (PBS-T))의 큰 볼륨을 준비한다. 실온에서 보관하십시오.
- 퍼 옥시다아제 기판 (오 - 페닐 렌 디아민 디 히드로 클로라이드 (OPD)를) 준비 : 참고 사항 : 3,3 같은 대체 퍼 옥시 다제 기질 '이용 될 수 있고, 5,5'- 테트라 메틸 벤지딘 (TMB)
- 분석의 날에 100 ㎖ DH 2 O 1 캡슐을 용해하여 인산 구연산 버퍼를 준비합니다.
- 사용 직전 인산 구연산 완충액 20ml에 1 OPD 정제 (10 mg)을 녹인다.
- 정지 용액 (1 NH 2 SO 4)를 준비 : SO 4 973 ml의 DH 2 O.에 27.2 ml의 재고 98 %의 H 2를 추가 혼합 한 다음 실온에서 보관하십시오.
NA의 양 2. 결정은 엘라에서 사용하는
- 96 웰 플레이트에 바이러스 희석 준비
- 열 희석 판의 1-11에 120 μL 샘플 희석제 (섹션 1.2) 분배.
- 열 1로, 추가로 96 μl의 샘플 희석제를 추가합니다.
- 해동 한 후이 바이러스시 10 분 희석을 제공 열 1의 우물을 복제하기 위해 24 μl를 추가하기 전에 바이러스의 병을 소용돌이.
- 전사함으로써, 샘플 희석제 바이러스의 연속 2 배 희석액을하나에서 잘 각각의 희석에 대한 다음 사용하여 깨끗한 피펫 팁 120 μL.
- Fetuin 코팅 된 플레이트에 바이러스 희석 이동
- PBS-T (1.6 절)과 fetuin 코팅 된 플레이트 3 회 반복 한 후 초과 세척 버퍼를 제거하는 흡수 종이 타월에 각 판을시킨다.
- fetuin 코팅 된 플레이트 (11)에 열이 각 웰에 1 샘플 희석제 (섹션 1.2.1)의 50 μl를 추가합니다.
- 칼럼 12의 시료 희석액 100 ㎕를 (이 웰은 음성 대조군이다) 추가한다.
- 전송 컬럼 fetuin 코팅 된 판의 해당 우물에 희석 판의 1-11에서 희석 바이러스의 50 μL.
- 접시 실러와 함께 접시를 커버 한 다음 37 ℃에서 가습 인큐베이터에 넣습니다.
- 나머지 단계 (16 ~ 18 시간 이상)을 수행 할 것입니다되는 시간을 기록합니다.
- 개구 결정을 완료
- 배양이 (16-18 시간)이 완료되면, 전송벤치에 플레이트와 플레이트의 봉인을 제거합니다.
- PBS-T (1.7 절)과 판 6 회 반복 한 후 반전과 흡수성 종이 타월에 빈틈이 모든 액체가 우물에서 제거되었습니다 확인 할 수 있습니다.
- 모든 우물에 (1.5.3에서 결정된 희석) 100 μL / 잘 PNA-HRPO 솔루션을 추가하고 실온에서 2 시간 동안 접시를 품어.
- 배양 끝까지 미만 15 분 전에 1.7 절에서 설명한 바와 같이, OPD 용액을 제조 하였다.
- PNA-HRPO를 제거하고 각 웰에 OPD 기판의 100 μl를 추가하기 전에 건조시킨다하기 위해 시험 플레이트를 3 회 반복한다.
- 실온에서 정확히 10 분 동안 접시를 품어.
- 100 μL / 1N 황산 웰을 첨가하여 반응을 정지.
- 0.1 초 동안 490 nm에서의 광학 밀도 (OD)를 측정하는 플레이트 리더를 사용합니다.
- 저장 한 모든 데이터 파일을 내 보냅니다.
- 혈청학에 사용되는 바이러스 희석을 선택
- 외경, 420㎚을 나타내는 그래프 그리기 (즉, 곡선의 선형 영역)에 비례 OD 결과 바이러스 희석액.
- 최대 신호의 약 90 %를 제공하고, 선형 범위 내에 바이러스 희석액을 선택한다. 선택한 희석에서 OD가 적어도 배경 신호보다 10 배 있는지 확인합니다. 이 특정 바이러스 주식을 사용하는 모든 분석을 위해 선택된 바이러스 희석을 사용합니다.
, 또는 바이러스의 NA 활동을 측정하고 엘라에 15 ~ 20 ~ μU NA 활동 / ㎖를 사용합니다.
3. 렉틴 분석 효소 연결
참고 : 그림 2 웃음을희석 및 분석 판의 설정을 WS.
- 샘플 희석합니다
- 얼음에 열 불 활성화 샘플을 놓습니다.
참고 : 8 혈청 각 플레이트에 희석 될 수있다. - A는 판에서 1:10부터 희석액을 사용하여 설정을 위해, 열 3-11의 모든 웰에 120 ㎕의 샘플 희석제를 추가합니다.
- 열 2, 샘플 희석액 216 ㎕를 각 샘플의 24 μl를 추가합니다. 최대 피펫 팅에 의해 3 번 아래로 잘 샘플을 혼합 한 후 다음 컬럼에 120 μl를 전송합니다.
- 피펫 팁을 변경 한 후, 아래로 피펫 팅에 의해 우물의 내용을 혼합 한 후 다음 컬럼에 120 μl를 전송합니다.
- 샘플까지 단계를 반복 3.1.4 열 (11)에 전송 된 나머지 120 μl를 폐기.
- 얼음에 열 불 활성화 샘플을 놓습니다.
- Fetuin 코팅 된 플레이트에 샘플 및 바이러스 추가
- 바이러스, 소용돌이의 병을 해동하고 2 단계에서 선택한 희석 희석제 (1.2 절)에 바이러스를 재현 탁.4.2. 각 분석 플레이트에 대한 바이러스의 적어도 5 mL를 준비합니다. 플레이트를 세척 및 혈청 샘플 판에 추가 될 때까지 얼음에 희석 바이러스를 유지합니다.
- 분석에 필요한 fetuin-코팅 된 플레이트의 수 결정 (일반적으로 접시 당 4 개의 혈청을 적용). PBS-T로 fetuin 코팅 된 플레이트 3 회 반복 한 다음 각 플레이트를 반전 과잉 세척 버퍼를 제거하는 흡수 종이 타월 위에시킨다.
- 열 2-11 중복 우물에 희석 플레이트에서 각 혈청 제어 또는 샘플 희석 50 μl를 전송하는 멀티 채널 피펫을 사용합니다.
- 음성 대조군 (열 12)을 제외한 모든 웰에 희석 바이러스의 50 μl를 추가합니다.
- 1 열에서 우물에 샘플 희석제 50 μl를 추가하고 열 (12)에 샘플 희석제 100 μl를 추가합니다.
- 접시 실러와 함께 우물을 덮고 부드럽게 플레이트의 측면을 누르거나 10 초 동안 보통 속도로 접시 통에 넣어 혼합한다.
- humidif에 접시를 놓고16 ~ 18 시간 동안 37 ° C에서 IED 인큐베이터.
- PNA-HRPO을 추가하고 2.3 절에 설명 된대로 분석을 완료
4. 데이터 분석
- 상기 분석 결과의 유효성을 확인합니다
- 배경 값 (더 바이러스) 양성 대조군 (바이러스없이 혈청)의 10 % 미만임을 확인합니다.
- 동일한 조건을 사용하여 다른 분석에서 제어 혈청 실행의 역가가 평균 역가의 2 배 내에 있는지 확인합니다.
- 제어 우물의 OD 측정은 (≤20 % 다른) 일치 및 중복 샘플 우물의 OD 측정은 (≤10 % 다른) 일관성을 확인합니다.
- 잘못된 결과의 근본 원인을 확인하고 4.1.1, 4.1.2 또는 4.1.3에 나와있는 조건이 충족되지 않으면 분석을 반복합니다. 문제를 해결하려고 할 때 표 1에 제시된 요인을 고려하십시오.
- 50 % 종점 역가 할당
- 각 분석 플레이트, 스와의 경우모든 측정 값의 평균 배경 (웰에 첨가없이 항원) btract.
- 수식을 이용하여 각각의 혈청 희석의 억제율을 계산한다 : 100 × (OD 바이러스 전용 제어 - OD 시험 샘플) / OD 바이러스만을 제어한다.
- 최대 신호의 적어도 50 % 억제를 초래 최고 희석액을 식별한다.
- 50 % 엔드 포인트 역가 등이 희석의 역수를보고합니다.
참고 : 50 % 억제가있는 희석 달성되지 않은 경우, 역가 시험 제 희석 미만인 예, <10 1:10 시험 제 희석한다.
- 50 % 억제 농도를 계산 (IC 50)
- 회귀 분석을 수행하는 프로그램에 결과를 전송하는 모든 수치의 평균 배경을 빼고 다음과 같이 IC (50) 역가를 결정하는 네 가지 파라미터 로지스틱 회귀 분석을 사용한다.
- 최대 집합, 비선형 회귀를 사용하여바이러스만을 제어하고 정확히 최소 50 % 억제에 해당하는 희석을 결정하기 위해 0으로 설정.
- 이 IC (50) 역가 등이 희석의 역수를보고합니다.
Representative Results
이 논문에 제시된 분석은 2가 96 웰 플레이트 레이아웃을 보여줍니다. 그림 1에 개략적으로 표시하고, 혈청 샘플의 연속 희석이 fetuin 코팅 된 플레이트로 전송하기 전에 희석 접시에 준비가되어 있음을 나타냅니다. 상기 분석의 중요한 매개 변수는 분석에서 사용되는 뉴 라미니다 제의 양이고; 이 재조합 체 바이러스의 적정을 통해 결정된다. H6N1 및 H6N2 바이러스 역가의 예.도 3에 도시되어 H6N1 1:10, 1:20 희석 1시 40분에서 광학 밀도 조건은 최대 판독 얻었다되도록했다 것을 나타내는 유사 하였다. 1:80 희석액에서 판독 된 최대의 약 90 %이고, 따라서 바이러스의이 희석 후의 분석에 사용 하였다. 혈청 역가의 예는도 4에 도시되어있다. 도면은했던 사람 혈청 샘플을 나타낸다 TIH6N1 및 H6N2 바이러스에 보이는 것. 각 데이터 포인트는 혈청의 연속 희석하여 달성 하였다 NA 활성의 억제율을 나타낸다 H6N1 분석에서 제 혈청 희석 1:80이었다; ≥50 % 억제를 초래 최고 희석 NC의 NA / 99 (N1)에 대한 NI 항체가이 예에 도시 된 혈청의 역가가 640이므로 H6N2 분석 혈청의 제 희석 5였다 및 WI의 NA / 05 (N2)에 대한 160.
.도 1 엘라 프로토콜의 개략도 항원 (바이러스)의 희석 (A) 결정은 분석 (프로토콜의 단계 2)에서 사용하는 방법 : 바이러스 희석에 의해 측정 된 fetuin 코팅 플레이트 및 NA 활성에 추가 프로토콜의 단계 2.3에 기재된 바와 같이 PNA-HRPO 결합을 말단 갈락토스 잔기를 정량화; (B 혈청 NI 항체 역가 (프로토콜의 3 단계)의 g>) 결정. 샘플을 희석 한 후 바이러스가 추가됩니다 fetuin 코팅 된 플레이트에 전송됩니다. 플레이트를 O / N PNA-HRPO 첨가하면서 발색 반응을 생성하기 위해 필요한 단계를 수행하기 전에 배양한다. 마지막으로, 색 반응은 정지되고, 광학 밀도를 측정한다. NA 활동의 50 % 이상 억제 결과 샘플 희석의 역수는 50 % 엔드 포인트 역가로보고됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 다이어그램은 엘라 판 설정 표시합니다. 혈청 샘플의 일련 희석 희석 판으로 만든 후 fetuin 코팅 된 플레이트에 전송됩니다. 3fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
H6N1 및 H6N2 바이러스 적정 그림 3. 예. H6N1 BR / 07의 시리얼 희석 (A의 NA / 브리즈번 / / 2007 (H1N1) 59 파란색 기호 표시) 및 H6N2 UR / 07 (NA (A)의 / 우루과이 / 716 / 빨간색 기호에 표시된 2007 (H3N2)) 18 fetuin-코팅 된 플레이트에 시간과 기술로 결정 PNA-HRPO과의 반응성 동안 배양 하였다. 평균 이 우물의 OD의 490nm 이하는 바이러스 희석의 역수에 그려집니다. 엘라에 사용하기 위해 선택한 H6N1의 희석은 1:80이며이 희석이 최대 광학 밀도의 약 90 %를 결과 및 선형 범위 내에서 있었기 때문에 선택 H6N2의 희석 1:40이었다.3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
N1의 NA (적색 기호) 및 N2에 대한 혈청 (파란색 기호) 부속 그림 4. 적정는. NA 억제 역가가 된 재조합 바이러스를 측정 하였다 H6N1 NC / 99 (포함하는의 NA / 뉴 칼레도니아 / / 1999 20 (H1N1) ) 및 H6N2 WI / 05 (포함하는의 NA / 위스콘신 / / 2005 67 (H3N2)). 혈청의 연속 희석에 대한 백분율 효소 억제는 50 % 억제를 나타내는 점선 수평 라인으로 표시됩니다. (A)의 NAS에 대한 NA 억제 역가 / 뉴 칼레도니아 / / 1999 20 (H1N1) (NC / 99) 및 A / 위스콘신 / / 2005 67 2 9.3 (640) 및 2 7.3이었다 (WI / 05) (H3N2) ( 160), 각각. 더 큰이 적이 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 rsion.
| 문제 | 가능한 원인 | 해결책 |
| 약한 신호 또는 바이러스 적정에 도달없는 고원 | ⅰ) 낮은 NA 효소 활성 ⅱ) 바이러스 주식은 최적의 조건에서 저장되지 | i)는 희석제 NA 활동을위한 최적의 pH가 있는지 확인; pH가 최적의 경우, 새로운 바이러스 주식을 준비하거나 바이러스를 집중 ⅱ) 자라게과 나누어지는 재고; -80 ° C에서 저장하기 전에 드라이 아이스에 스냅 동결 바이알 |
| 양성 세포의 제어 우물에 약하거나없는 색상 | ⅰ) 바이러스 희석이 잘못 할당 냉동 바이러스 분취 액에 II) 바이알에 바이알 가변성 ⅲ) PNA- HRPO 변성 또는 너무 희석 ⅳ) OPD가 잘못 준비 | 나는); 반복 바이러스 적정 ⅱ)에는 변동이없는 보장하기 위해 같은 배치에서 여러 개의 튜브를 적정한다. 중요한 변동 한 경우 신선한 분취 량을 준비 ⅲ) PNA- HRPO을 retitrate하는 최적의 바이러스 희석 사용 ⅳ) OPD의 신선한 준비와 반복 |
| 양성 대조군 혈청에 의한 약한 또는 전혀 억제 | 분석에 사용 된 내가) 너무 많은 바이러스 ⅱ) 혈청이 저하 | ⅰ) 반복 바이러스 적정 ⅱ) 새로운 항혈청 검사 보관 조건을 구합니다 |
| 음성 대조군 혈청에 의해 저해 | 혈청의 난) 부적절한 열처리 분석에 사용 ⅱ) 너무 작은 바이러스 | ⅰ) 혈청의 열 불 활성화를 반복 ⅱ) 반복 바이러스 적정 |
| 높은 배경 | 판의 난) 가능한 오염 ⅱ) PNA- HRPO 농도가 너무 낮 / 너무 높은 | ⅰ) 갓 코팅 된 플레이트를 사용하여 반복 II)를 사용하는 올바른 희석을 식별하는 PNA-HRPO을 적정 |
| 바이러스 적정 낮은 희석에서 NA 활동의 명백한 억제를 보여줍니다 | ⅰ) 뇨의 유체는 NA 용 기판을 포함 할 수있다 | 자당 쿠션을 통해 펠렛 화 된 ⅱ)를 사용하여 바이러스 |
성능 기준을 만족하지 않는 분석 표 1. 근본 원인 분석. 이 표는 엘라를 수행 할 때 발생할 수있는 문제에 대한 가능한 원인과 솔루션을 제공합니다.
Discussion
효소 - 결합 렉틴 분석은 혈청 NI 항체 역가를 측정하기위한 실용적인 방법이다. 엘라 1990에 의해 Lambre 외., 설명되었지만, 표준 혈청 학적 검정과 같은 수락 임상 샘플 12-16의 NI 항체 역가를 측정하기 위해 분석을 수행하는 여러 실험실로, 최근왔다. 일부 변형을 측정하는 NI 역가에 큰 영향없이 프로토콜 단계로 이루어질 수있다. 예를 들어, PBS가 희석제로서 이용 될 수 있지만, 이는 권장되는 버퍼 바이러스 적정 곡선 (MES, pH를 6.5)와 비교하는 것이 매우 유용하다 PBS 결정이 이루어지기 전에 어떤 NA 서브 타입이 크게에서 효소 활성을 감소로서 pH가> 7.0. 최적 pH를 사용하지 않는 경우, 바이러스의 최대 신호는 분석에서 항원 (예 : 바이러스)의 과량의 사용의 결과로 감소 될 수있다; 이러한 조건에서, 상기 분석은 감소 된 감도를 가질 수있다.
일부 없음치료는 혈청 엘라 시험시 해당 고유 억제 관찰된다. 이것은 thermolabile β 억제제의 존재를 나타내는, 열처리 (45 분간 56 ° C)에 의해 제거된다. 기타 비특이적 억제제 (α 및 γ 수준) 인플루엔자 HA의 특히 H3N2 바이러스 혈구 응집 및 감염과 관련하여 설명되었다. H3N2 바이러스는 NA의 소스로서 사용되는 경우 실제로 비특이적 억제는 엘라 관찰되고 이 시알 리다 아제 저해 9 소량의 혈청 시료의 처리에 의해 제거된다.
다른 혈청 학적 분석에 관해서는, 음성 및 양성 통제를 분석 성능을 평가하는 수단을 제공하기 위해 각각의 분석에 포함되어야한다. 분석이 허용 기준을 충족하지 않은 경우, 그 이유는 식별되어야한다. 표 1은 문제를 해결하는 해결 할 수있는 분석에서 잠재적 단계의 목록을 제공합니다.
엘라 프로토콜 잠이 보고서에 ided는 NA의 소스로서, 조류 바이러스로부터 HA의 발신이 포함 된 재조합 바이러스를 사용합니다. 이 허가가 저 병원성 조류 바이러스와 함께 작동하도록 필요하기 때문에 분석을 수행에 제한을 선물한다. 그들이 비활성화 된 후에 H6Nx 된 재조합 바이러스는 실험실간에 공유 될 수있다. 따라서, 재조합 체 바이러스를 생성하는 기관이 불 활성화가 완료되었음을 입증되면 상기 분석은 공동으로 수행 될 수 있고, 제조는 NA 활성을 유지하고있다. H6Nx를 재조합 체 바이러스를 사용하는 제약 NA의 비 감염성 소스를 사용하여 극복 될 수있다. 다른 바이러스 유사 입자 (VLP를) (15)를 사용한 예를 들어, 일부 실험실 재조합 NA 17 정제에 사용 하였다. 그러나, 재조합 NA도 VLP를 모두 쉽게 사용할 수 있으며, 따라서 우리는 항원 - 일치하지 않는 조류 HA와 인플루엔자 바이러스를 계속 사용합니다.
전통적인NI 항체 역가를 측정하는 방법은 여러 가지 이유로 실용적이지 않다; 가장 우려의 발색 반응을 생산하는데 필요한 유해 화학 물질이다. 또한, 시료의 대량이 필요하고 분석은 수행 할 복잡하고 있습니다. 반대로, 엘라 수행 용이하고 샘플의 적절한 수의 적정을 가능하게하는 형식이다. 엘라 변동성 쇼 그 분석 수익률 재현 가능한 결과 7, 8을 조사 연구 데이터. 엘라 결과적 가능한 NI 항체 역가의 측정 루틴을 만들었으며, 혈청 학적 연구를 수행 실험실에서 자주 사용될 것으로 예상된다.
엘라를 수행 할 때 고려해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 먼저, NA 활성의 비특이적 억제제가 제거되어야한다. 이러한 억제제는 일반적 thermolabile 45 분 동안 56 ℃에서 열처리에 의해 파괴된다. 열처리는 비 정시를 제거하기에 충분한H6 된 재조합 바이러스는 NA의 소스로서 사용되는 경우 H3N2 바이러스가 엘라에 사용되는 경우, FIC 샘플로부터 억제제 그러나, 헤 마글 루티 닌에 결합하는 혈청 인자는 엘라 방해 시알 리다 소량의 처리에 의해 제거되어야 치료 (9)를 가열하기 전에. 이 분석의 민감도를 감소 둘째, 항원, 즉 H6Nx 된 재조합 바이러스의 과량 사용되지 않아야한다. 바이러스의주의 적정 따라서 필수적인 단계이다 각각의 분석에 사용 된 항원의 양이 아니라 배경 위에 신호를 제공해야하며, 적정 곡선, 즉의 선형 범위 내에 있어야 신호 (광학 밀도) 바이러스 희석에 비례한다.
혈청학 루틴 이외에, 엘라는 계절 인플루엔자 바이러스의 NA 항원 사이의 차이를 평가하기 위해 사용될 수있다. 포함 A에 대한 바이러스 균주를 선택할 때이 정보는 매우 도움이 될 수 있습니다의 백신 후보와 NA의 항원 드리프트 결과 면역 압력의 더 큰 이해를 촉진 할 것이다. 또한, 돼지 나 조류 인플루엔자 바이러스로부터의 NA의 항원 분석은 새로운 균주의 대유행 가능성을 결정하는 데 중요한 정보를 제공 할 수있다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coating buffer | KPL | 50-84-01 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| 5x MES, pH 6.5 | KD-Medical | PBS-0134 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| 30% BSA | Sigma | A8327 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Lectin PNA-HRPO | Sigma | L7759 | |
| PBS-T | Sigma | P3563-10PAK | |
| o-Phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
| Phosphate-citrate buffer | Sigma | P4922 | |
| Sulfuric acid | Sigma | 258105 | |
| 96-well Maxisorp plates | NUNC | 439454 | |
| 96-well round bottom well plates | NUNC | 267245 | |
| Plate sealers | Thermo Scientific | 14-245-192B | |
| Chicken eggs | Charles River Laboratories | 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) chicken eggs | |
| Multichannel pipette | Variety of suppliers e.g., Rainin, Eppendorf | 8 or 12 channel manual pipette 50-250 µl volume | |
| Pipette tips | Depends on pipettor brand | Depends on pipettor brand | |
| Plate reader, with 490 nm filter | Perkin Elmer | Victor V | |
| Water bath set to 37 °C | Variety of suppliers | Variety of models | |
| Water bath set to 56 °C | Variety of suppliers | Variety of models | |
| Refrigerator set to 4 °C | Variety of suppliers | Variety of models | |
| Incubator set to 37 °C | Variety of suppliers | Variety of models |
References
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