Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

قياس الأنفلونزا النورامينيداز تثبيط الجسم المضاد التتر من قبل انزيم مرتبط كتين الفحص

Published: September 6, 2016 doi: 10.3791/54573
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Viral Products, CBER, Food and Drug Administration

Abstract

الأجسام المضادة لالنورامينيداز (NA)، والثاني الأكثر وفرة بروتين على سطح فيروس الانفلونزا، تساهم نحو حماية ضد الانفلونزا. الطرق التقليدية لقياس NA تثبيط (NI) التتر الضد ليست عملية لالأمصال الروتينية. يصف هذا البروتوكول كتين فحص انزيم مرتبط (إيلا)، وهي طريقة بديلة العملي لقياس التتر NI التي يتم تنفيذها في 96 لوحات جيدة المغلفة مع الركيزة بروتين سكري كبيرة، فتوين. يشق NA الأحماض محطة اللعابي من فتوين، وفضح السكر قبل الأخير، الجلاكتوز. الفول السوداني راصة (السلطة الوطنية الفلسطينية) هي كتين مع خصوصية لسكر اللبن، وبالتالي مدى desialylation يمكن قياسها كميا باستخدام المترافقة البيروكسيديز والسلطة الوطنية الفجل، تليها إضافة الركيزة البيروكسيداز اللونية. الكثافة البصرية التي يقاس يتناسب مع النشاط NA. لقياس NI التتر الأجسام المضادة، يتم تحضين التخفيفات المسلسل من الأمصال في 37 ° CO / N على لوحات المغلفة فتوين مع مبلغ ثابت سو NA. يعين متبادلة من أعلى تخفيف المصل الذي ينتج في ≥50٪ تثبيط النشاط NA باسم عيار الأضداد NI. يوفر إيلا شكل عملي لتقييم الروتيني للاستجابات الأجسام المضادة البشرية بعد الإصابة بالأنفلونزا أو التطعيم.

Introduction

النورامينيداز (NA) هو بروتين سكري أعرب على سطح virions الأنفلونزا. نشاط انزيم لها أمر ضروري لإطلاق جزيئات الفيروس شكلت حديثا من الخلايا المصابة 1،2. الأجسام المضادة التي تمنع NA النشاط يقلل التتر فيروس واعراض المرض في النماذج الحيوانية 3 وترتبط مع المقاومة ضد المرض لدى البشر (4). ولذلك قد زيادة في NA تثبيط (NI) التتر التطعيم التالية تكون مؤشرا على فعالية اللقاح، ولكن العديد من الدراسات المناعية أنفلونزا الماضي لم يتضمن هذه نقطة النهاية لأن الفحص التقليدي لقياس NI التتر الضد هو غير عملي لالأمصال الروتينية.

وتستند هذه الطريقة التقليدية لقياس التتر NI على قياس كمية الحامض اللعابي الذي المشقوق من غليكوكونجوغاتيس التي كتبها NA 1. هذه الطريقة، وغالبا ما يشار إليها على أنها طريقة thiobarbituric حمض (TBA)، يستخدم المواد الكيميائية الخطرة لتحويل التيار المتردد اللعابيمعرف لحامل اللون التي يمكن قياسها كميا بواسطة مطياف. الفحص غير مناسب لاختبار عدد كبير من العينات لأنه يتم استخدام أنابيب زجاجية الفردية، مما يجعل فحص مرهقة. التصغير للمقايسة ل96 لوحات جيدة يوفر شكل عملي أكثر 5، ولكن هذا الاختبار لا يزال يتطلب استخدام المواد الكيميائية السامة، وبالتالي ليست مثالية.

وقد تم تطوير مقايسة بديل لقياس NI التتر الضد من Lambré وآخرون. 6. هذا الاختبار يقيس نشاط انزيم عن طريق قياس كمية من السكر قبل الأخير من بروتينات سكرية، اللبن، التي تصبح مكشوفة عندما يتم تحريرها الحامض اللعابي التي كتبها NA. منذ الفول السوداني راصة (PNA) يربط على وجه التحديد إلى اللبن، والبيروكسيديز السلطة الوطنية الفلسطينية، الفجل (HRPO) المترافقة يمكن استخدامها للحصول على اللونية للقراءة خارج. الكثافة البصرية التي تقاس بالتالي تتناسب مع النشاط NA في العينة. يتم قياس التتر NI من خلال تحديد أعلى تخفيفمن المصل الذي يمنع 50٪ على الأقل من النشاط NA. يتم إجراء هذا الاختبار كتين انزيم مرتبط (إيلا) في لوحات 96-جيدا المغلفة مع فتوين، وهو بروتين مصل الغليكوزيلاتي للغاية، والركيزة لNA.

وهو عامل مهم لفحوصات لقياس التتر NI، هو مصدر NA. وذلك لأن الأمصال من الأفراد المحصنة أو المصاب يحتوي على أجسام مضادة لهيماغلوتينين (HA) وكذلك الأجسام المضادة لNA. الأجسام المضادة التي تربط إلى HA يمكن أن تتداخل مع نشاط NA، وبالتالي، لتجنب تثبيط غير محدد من الأجسام المضادة HA-محددة، تنقية NA أو فيروس كله يحتوي على HA مستضديا-متطابقة ينبغي أن تستخدم في الفحص. هذه الفيروسات يمكن توليدها عن طريق إعادة التشكيل الكلاسيكي أو عن طريق الوراثة العكسية. والهدف من ذلك هو انقاذ الفيروس الذي يحتوي على HA من نوع فرعي أن لا علاقة لسلالة الهدف، وNA من الفيروس التي يتم دراستها. الفحص الموضحة في هذه المقالة يستخدم فيروسات الأنفلونزا A التي يتم إنشاؤها من قبل القسERSE الوراثة لاحتواء HA من H6 النوع الفرعي وNA المستهدفة من فيروسات الأنفلونزا A، الأنواع الفرعية H1N1 و H3N2 5.

وأظهرت النتائج التي تم إنشاؤها بواسطة إيلا والمقايسات TBA المنمنمة هذه الأساليب قابلة للمقارنة، مع خصوصية سلالة مماثلة، وحساسية 7. إيلا لا تتطلب استخدام المواد الكيميائية الخطرة، وبالتالي هو الأسلوب المفضل لقياس التتر NI. فمن السهل القيام بها، مع خطوات قليلة فقط (الشكل 1): يتم تخفيفه العينات ونقلها إلى لوحة المغلفة فتوين التي فيروس (مصدر NA) يضاف. وحضنت لوحة O / N وغسلها قبل أن يضيف السلطة الوطنية الفلسطينية-HRPO. بعد حضانة 2 ساعة، لوحة يتم غسلها ويضاف البيروكسيديز الركيزة. توقفت رد فعل اللون، وأخيرا يتم قياس الكثافة البصرية وذكرت مقلوب التخفيف العينة التي أسفرت عن 50٪ على الأقل تثبيط النشاط NA مثل 50٪ عيار نقطة النهاية. دراسة داخل المختبر لتقييم reproducibiliأظهر تاي من إيلا أن تقلب لوحة إلى لوحة هو الحد الأدنى وأدى تكرار مشغل إلى مشغل في عدم وجود اختلافات أكثر من 2 أضعاف في عيار 7. وأظهرت دراسة أجريت بين المختبرات لاحقة من تقلب إيلا أن فحص ديه استنساخ جيدة عندما أجريت في مختبرات مختلفة، ويمكن أن إدراج معيار زيادة خفض التباين في النتائج 8. وإيلا مناسبة لقياس NI التتر الأجسام المضادة في مصل الدم لوحات من الدراسات لقاح الإنفلونزا قبل السريرية والسريرية (7) ويمكن أن تستخدم أيضا لتقييم الاختلافات المستضدات بين الجديدات فيروسات الأنفلونزا 9.

Protocol

جميع الفيروسات اندماج تضاعفي الحية مع مكونات الطيور يجب التعامل معها باستخدام مستوى السلامة الحيوية 2 (BSL2) الممارسات المحسن في مختبر معتمد للاستعمال من قبل وزارة الزراعة في الولايات المتحدة (USDA) ولجنة السلامة الأحيائية المؤسسية.

1. إعداد الكواشف وبدء المواد

ملاحظة: يرجى الرجوع إلى الجدول المواد للحصول على مصدر كل الكواشف.

  1. لوحات المغلفة فتوين
    1. إعداد عازلة الطلاء عن طريق خلط 10 مل العازلة 10X طلاء مع 90 مل H 2 O. منزوع الأيونات
    2. إعداد محلول المخزون من فتوين في 25 ملغ / مل في المخزن طلاء 1X وتخزينها في 500 مكل في -20 درجة مئوية.
    3. يعد حل عمل فتوين (25 ميكروغرام / مل) على الفور قبل لوحات طلاء عن طريق تمييع الحل الأسهم 1000 أضعاف في المخزن طلاء 1X.
    4. استخدام ماصة الأقنية إلى الاستغناء عن 100 ميكرولتر من محلول عمل فتوين إلى اللهآبار لتر من لوحة 96-جيدا أن لديها قدرة عالية ملزم البروتين.
    5. تغطية كل لوحة مع سداده لوحة ثم كومة من لوحات في مجموعات من 10 والتفاف عليها في احباط.
    6. وضع لوحات في الثلاجة (2-8 درجة مئوية) لمدة لا تقل عن 18 ساعة قبل إجراء الفحص.
      ملاحظة: قد تكون مغلفة لوحات مقدما وتخزينها مع الحل الطلاء في 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر.
  2. منظفة
    1. لإعداد مخفف لجعل الفيروس وعينة التخفيفات (2- (N -morpholino) حمض ethanesulfonic (MES)، ودرجة الحموضة 6.5، 20 ملي CaCl 2، 1٪ زلال المصل البقري (BSA) و 0.5٪ توين 20)، خلط 94.2 مل 1X زارة التربية والعلم، ودرجة الحموضة 6.5 مع 2 مل CaCl 2 (10 ملغ / مل)، 3.3 مل 30٪ BSA و 0.5 مل توين 20.
    2. لإعداد مخفف للسلطة الوطنية الفلسطينية، HRPO (MES، ودرجة الحموضة 6.5 مع 20 ملم CaCl 2 و 1٪ BSA)، خلط 94.7 مل 1X زارة التربية والعلم، ودرجة الحموضة 6.5 مع 2 مل CaCl 2 (10 ملغ / مل)، و 3.3 مل 30٪ BSA .
  3. النورامينيداز (NA)
    ملاحظة: H6Nx reass فيروسortants (هذه لها HA من H6 النوع الفرعي وNA من الفائدة)، يتم إنشاؤها التالية أساليب نشرت 5،10. طلب قارورة من فيروس اندماج تضاعفي المعطل من متعاون إذا لم تكن متوفرة في المنزل. عند استخدام الفيروس المعطل، تأكد من أن إعداد مناسب للاستخدام في إيلا خلال مظاهرة أن عملية التعطيل لم يكن لها تأثير كبير على النشاط NA.
    1. ثقافة مخزون من فيروس H6Nx في بيض الدجاج المحتوي 11 و تخزين 0.5 مل aliquots من السوائل السقاء أنيق في -80 درجة مئوية.
    2. استخدام قسامة جديدة من الفيروس لكل فحص. لا تجميد وذوبان الجليد وقسامات.
  4. عينات المصل والضوابط
    1. للحرارة تعطيل جميع الأمصال (عينات الاختبار على سبيل المثال، الأمصال قبل وبعد التطعيم، وكذلك الضوابط، على سبيل المثال، عينة مع عيار NI معروف) في حمام مائي عند 56 درجة مئوية لمدة 45-60 دقيقة. تخزين الأمصال في -20 إلى -70 درجة مئوية قبل أو بعد المعالجة الحرارية. إذا كان عصيدةليه هي لفحصها مرارا، وجعل عدة قسامات قبل التجميد حتى أن العينة لم تجمد مرارا وإذابة.
    2. استخدام إيلا لقياس التتر NI الأمصال البشرية التي تتوفر بكميات معقولة (> 5 مل) لتحديد واحد على الأقل مع عيار منخفض وآخر مع عيار عالية. تخزين 100 مكل كما ≤ 20 درجة مئوية بحيث نفس العينة يمكن استخدام عنصر تحكم في العديد من المقايسات من أجل تتبع أداء الفحص.
  5. الفول السوداني الملزن (PNA) -Horseradish البيروكسيد (HRPO)
    1. إعداد مخفف السلطة الوطنية الفلسطينية-HRPO (MES، ودرجة الحموضة 6.5 مع CaCl 2 و 1٪ BSA).
    2. إعداد محلول المخزون السلطة الوطنية الفلسطينية-HRPO عن طريق إذابة 1 ملغ من السلطة الوطنية الفلسطينية، HRPO في 1 مل من مخفف. تخزين 20-200 مكل في -20 درجة مئوية.
    3. قبل استخدام الكثير جديد للسلطة الوطنية الفلسطينية، HRPO، اختبار 1: 500، 1: 750، 1: 1000 و 1: 2000 التخفيفات من هذا كاشف لتحديد المبلغ الذي يؤدي إلى OD القصوى مع مراقبة إيجابية (فيروس فقط) وخلفية ( أي فيروس) رقبعة هو <10٪ من إشارة إيجابية.
      1. جعل التخفيفات فيروس quadruplicate كما هو موضح في القسم 2.1.
      2. نقل التخفيفات لوحة المغلفة فتوين كما هو موضح في القسم 2.2 واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية.
      3. غسل لوحة في وقت لاحق 16-18 ساعة وإضافة 1: 500، 1: 750، 1: 1000 و 1: 2000 التخفيفات من السلطة الوطنية الفلسطينية، HRPO (100 ميكرولتر / جيد) لتكرار صفوف من اللوحة.
      4. استكمال الفحص كما هو موضح في الخطوات 2.3.4 إلى 2.3.9.
      5. مراجعة البيانات لتحديد التخفيف الذي أدى إلى أقصى إشارة إلى أن> 10 مرات الخلفية.
    4. مباشرة قبل الاستعمال، وإعداد التخفيف الأمثل للسلطة الوطنية الفلسطينية، HRPO المحددة في 1.5.3.
  6. إعداد كمية كبيرة من غسل العازلة (0.01 م الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، ودرجة الحموضة 7.4، 0.05٪ توين 20 (PBS-T)). تخزين في RT.
  7. إعداد الركيزة البيروكسيداز (هيدروكلوريد س Phenylenediamine (العيادات الخارجية)): ملاحظة: ركائز بيروكسيديز بديلة مثل 3،3 '، 5،5'-Tetramethylbenzidine (TMB)، يمكن أن تستخدم
    1. إعداد العازلة الفوسفات سترات عن طريق إذابة 1 كبسولة في 100 مل درهم 2 O في يوم الفحص.
    2. حل 1 العيادات الخارجية قرص (10 ملغ) في 20 مل من العازلة فوسفات سترات مباشرة قبل الاستعمال.
  8. إعداد الحل محطة (1 NH 2 SO 4): إضافة 27.2 مل الأسهم 98٪ H 2 SO 4-973 مل درهم 2 O. خلط ومن ثم تخزينها في RT.

2. تحديد المبلغ من NA لاستخدامها في إيلا

  1. إعداد التخفيفات الفيروسات في لوحة 96-جيدا
    1. الاستغناء عن 120 عينة ميكرولتر (القسم 1.2) مخفف في أعمدة 1-11 من لوحة التخفيف.
    2. إلى العمود 1، إضافة 96 ميكرولتر عينة مخفف إضافية.
    3. ذوبان الجليد ثم دوامة القارورة من الفيروسات قبل إضافة 24 ميكرولتر لتكرار الآبار في العمود 1. وهذا يعطي 1:10 التخفيف من الفيروس.
    4. جعل التخفيفات المسلسل 2-أضعاف من الفيروس في عينة مخفف، عن طريق نقل120 ميكرولتر من بئر واحدة إلى أخرى باستخدام نصائح ماصة نظيفة لكل التخفيف.
  2. نقل التخفيفات الفيروسات لوحة المغلفة فتوين
    1. غسل المغلفة فتوين لوحة 3 مرات مع (القسم 1.6) برنامج تلفزيوني-T ثم صمة عار كل لوحة على منشفة ورقية ماصة لإزالة أي العازلة يغسل الزائد.
    2. إضافة 50 ميكرولتر من مخفف عينة (القسم 1.2.1) إلى كل بئر في الأعمدة من 1 إلى 11 من لوحة المغلفة فتوين.
    3. إضافة 100 ميكرولتر من عينة مخفف إلى العمود 12 (هذه الآبار هي المراقبة السلبية).
    4. نقل 50 ميكرولتر من الفيروس المخفف من الأعمدة 1-11 من لوحة التخفيف إلى الآبار المقابلة من لوحة المغلفة فتوين.
    5. تغطية لوحة مع سداده لوحة ومن ثم وضعه في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية.
    6. تقديم مذكرة من الوقت الذي سوف يتم تنفيذها الخطوات المتبقية (في وقت لاحق 16-18 ساعة).
  3. استكمال تحديد NA
    1. عندما اكتمال الحضانة (16-18 ساعة)، ونقللوحة لمقاعد البدلاء وإزالة سداده لوحة.
    2. غسل لوحة 6 مرات مع (القسم 1.7) برنامج تلفزيوني-T ومن ثم عكس وبات على مناشف ورقية ماصة لضمان تمت إزالة جميع السائل من الآبار.
    3. إضافة 100 ميكرولتر / جيد حل السلطة الوطنية الفلسطينية، HRPO (في التخفيف المحددة في 1.5.3) لجميع الآبار واحتضان لوحة لمدة 2 ساعة على RT.
    4. أقل من 15 دقيقة قبل الحضانة إلى نهاية، وإعداد حل العيادات الخارجية كما هو موضح في القسم 1.7.
    5. تغسل الصحون الاختبار 3 مرات لإزالة السلطة الوطنية الفلسطينية-HRPO وصمة عار الجافة قبل إضافة 100 ميكرولتر من الركيزة العيادات الخارجية إلى كل بئر.
    6. احتضان لوحة لمدة 10 دقيقة بالضبط في RT.
    7. وقف رد الفعل من خلال إضافة 100 ميكرولتر / جيد لحمض الكبريتيك 1N.
    8. استخدام قارئ لوحة لقياس الكثافة الضوئية (OD) في 490 نانومتر 0.1 ثانية.
    9. حفظ وتصدير جميع ملفات البيانات.
  4. حدد التخفيف الفيروسات التي سيتم استخدامها لالأمصال
    1. رسم بياني المؤامرات OD 490nm (أي المنطقة خطية من منحنى).
    2. حدد تخفيف الفيروس الذي يعطي ما يقرب من 90٪ من الحد الأقصى للإشارة، وهو ضمن مجموعة خطية. تأكد من أن التطوير التنظيمي في تخفيف المحدد ما لا يقل عن 10 أضعاف أكبر من إشارة الخلفية. استخدام تخفيف فيروس المختارة للجميع المقايسات التي تستخدم هذا المخزون فيروس معين.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، وقياس النشاط NA الفيروس واستخدام ~ 15-20 μU NA النشاط / مل في إيلا.

3. انزيم مرتبط كتين الفحص

ملاحظة: الشكل 2 شوWS الإعداد لوحات تخفيف والفحص.

  1. جعل التخفيفات عينة
    1. وضع العينات الحرارة المعطل على الجليد.
      ملاحظة: 8 الأمصال يمكن أن تضعف في كل لوحة.
    2. لإعدادها باستخدام التخفيفات ابتداء من الساعة 01:10 عبر لوحة، إضافة 120 ميكرولتر عينة مخفف لجميع الآبار في الأعمدة 3-11.
    3. إلى العمود 2، إضافة 216 ميكرولتر من عينة مخفف و 24 ميكرولتر من كل عينة. خلط العينة في البئر من قبل pipetting صعودا وهبوطا 3 مرات ثم نقل 120 ميكرولتر إلى العمود التالي.
    4. بعد تغيير نصائح ماصة، وخلط محتويات جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا ومن ثم نقل 120 ميكرولتر إلى العمود التالي.
    5. وقد تم نقل كرر الخطوة 3.1.4 حتى العينة إلى العمود 11 و 120 ميكرولتر المتبقية تجاهل.
  2. إضافة العينات والفيروسات إلى لوحة المغلفة فتوين
    1. ذوبان الجليد قارورة من الفيروس، دوامة و resuspend الفيروس في مخفف (القسم 1.2) في التخفيف الذي تم تحديده في الخطوة 2.4.2. إعداد 5 مل على الأقل من الفيروسات لكل لوحة الفحص. تبقي الفيروس المخفف على الجليد حتى يتم غسلها لوحات وتم إضافة عينات المصل لوحة.
    2. البت في عدد من لوحات المغلفة فتوين أن هناك حاجة لفحص (تطبيق عموما 4 الأمصال لكل لوحة). غسل المغلفة فتوين لوحة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني-T ومن ثم عكس كل لوحة وصمة عار على منشفة ورقية ماصة لإزالة غسل العازلة الزائد.
    3. استخدام ماصة الأقنية لنقل 50 ميكرولتر من كل عنصر تحكم في الدم أو عينة التخفيف من لوحة تخفيف في الآبار مكررة في الأعمدة 11/02.
    4. إضافة 50 ميكرولتر من الفيروس المخفف لجميع الآبار إلا لسيطرة سلبية (العمود 12).
    5. إضافة 50 ميكرولتر من عينة مخفف إلى الآبار في العمود 1 وإضافة 100 ميكرولتر من عينة مخفف إلى العمود 12.
    6. تغطية الآبار مع سداده لوحة ثم تخلط بواسطة التنصت بلطف جانبي لوحة أو وضع على شاكر لوحة بسرعة معتدلة لمدة 10 ثانية.
    7. وضع لوحة في humidifحاضنة العبوات الناسفة عند 37 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة.
  3. إضافة السلطة الوطنية الفلسطينية-HRPO واستكمال الفحص كما هو موضح في القسم 2.3

تحليل 4. البيانات

  1. تحديد صلاحية نتائج الفحص
    1. تأكد من أن القيم الأساسية (أي فيروس) هي أقل من 10٪ من السيطرة الايجابية (الفيروس وليس المصل).
    2. تأكد من أن التتر من السيطرة الأمصال التشغيل في فحوصات مختلفة باستخدام نفس الظروف داخل 2 أضعاف من عيار متوسط.
    3. تأكد من القياسات OD من آبار المراقبة متسقة (≤20٪ مختلفة) وأن القياسات OD من الآبار عينة مكررة متناسقة (≤10٪ مختلفة).
    4. تحديد السبب الجذري للنتائج غير صحيحة وتكرار فحص إذا كانت المعايير الواردة في 4.1.1، 4.1.2 أو 4.1.3، لم يتم الوفاء. النظر في العوامل الواردة في الجدول رقم 1 عند محاولة استكشاف.
  2. تعيين 50٪ نهاية نقطة العيار الحجمي
    1. لكل لوحة الفحص، سوbtract متوسط ​​الخلفية (أي مستضد إضافة إلى الآبار) من كل القراءات.
    2. حساب تثبيط في المئة في كل تخفيف المصل باستخدام المعادلة التالية: 100 × (OD فيروس السيطرة فقط - OD اختبار العينة) / OD فيروس السيطرة فقط.
    3. تحديد أعلى تخفيف التي أسفرت عن 50٪ على الأقل تثبيط الحد الأقصى للإشارة.
    4. عن متبادلة من هذا التخفيف مثل 50٪ عيار نقطة النهاية.
      ملاحظة: إذا لم يتحقق 50٪ تثبيط في أي تمييع، عيار أقل من التخفيف أول اختبار، على سبيل المثال، <10 عندما 1:10 هو تخفيف أول اختبار.
  3. حساب تركيز المثبطة 50٪ (IC 50)
    1. استخدام أربعة انحدارات اللوجستية المعلمة لتحديد عيار IC 50 على النحو التالي: طرح متوسط ​​خلفية من جميع القراءات وثم نقل النتائج إلى البرنامج الذي ينفذ تحليل الانحدار.
    2. استخدام الانحدار غير الخطي، مع الحد الأقصى للمجموعةلهذا الفيروس السيطرة فقط، والحد الأدنى مجموعة من الصفر، لتحديد التخفيف الذي يتوافق مع بالضبط 50٪ إعاقة.
    3. عن متبادلة من هذا التخفيف كما عيار IC 50.

Representative Results

يظهر الفحص الواردة في هذه المخطوطة بيانيا في الشكل 1. ويبين الشكل 2 تخطيط لوحة البئر 96، ويشير إلى أن يتم إعداد التخفيفات التسلسلي للعينات مصل في لوحة تخفيف قبل نقلهم إلى لوحة المغلفة فتوين. معلمة حرجة للمقايسة هي كمية النورامينيداز التي تستخدم في فحص. ويتحدد ذلك من خلال المعايرة من فيروس اندماج تضاعفي. وترد أمثلة من H6N1 وH6N2 المعايرة الفيروس في الشكل (3). وفي 01:10، 01:20 و 01:40 التخفيفات من H6N1، والكثافة البصرية مماثلة، مشيرا إلى أن الظروف كانت من النوع الذي أقصى القراءة تم الحصول عليها. في التخفيف 1:80، وكان التدريجي قراءة ما يقرب من 90٪ من الحد الأقصى، وبالتالي تم استخدام هذا التخفيف من الفيروس في فحوصات لاحقة. وترد أمثلة من المعايرة المصل في الشكل (4). ويوضح الشكل عينة مصل الإنسان التي كانت منظمة الشفافية الدوليةtrated ضد H6N1 وفيروسات H6N2. وتبين كل نقطة بيانات تثبيط في المئة من النشاط NA الذي حققته التخفيفات المسلسل من المصل. كان تخفيف المصل الأول في فحص H6N1 1:80. كان التخفيف الأول من المصل في فحص H6N2 5. منذ أعلى التخفيف الذي ينتج في ≥50٪ تثبيط هو عيار NI الأجسام المضادة، وعيار المصل هو موضح في هذا المثال هو 640 ضد NA من NC / 99 (N1) و 160 ضد NA من WI / 05 (N2).

شكل 1
. الشكل 1. التخطيطي لبروتوكول إيلا (أ) تحديد التخفيف من المستضد (فيروس) لاستخدامها في فحص (الخطوة 2 من البروتوكول): تضاف التخفيفات الفيروسات إلى لوحة المغلفة فتوين والنشاط NA تقاس قياس بقايا اللبن المحطة من خلال ربط السلطة الوطنية الفلسطينية-HRPO كما هو موضح في الخطوة 2.3 من البروتوكول. (ب ز>) تحديد التتر الضد NI المصل (الخطوة 3 من البروتوكول). مخففة عينات ومن ثم نقلها إلى لوحة المغلفة فتوين حيث يتم إضافة الفيروس. والمحتضنة لوحة O / N قبل أن يضيف السلطة الوطنية الفلسطينية-HRPO واستكمال الخطوات اللازمة لتوليد رد فعل اللون. وأخيرا، توقفت رد فعل اللون ويتم قياس الكثافة الضوئية. وذكر مقلوب التخفيف العينة التي تؤدي إلى 50٪ على الأقل تثبيط النشاط NA مثل 50٪ عيار نقطة النهاية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. مخطط لإظهار لوحة إيلا اقامة. مصنوعة التخفيفات المسلسل من عينات المصل في لوحة التخفيف ثم نقل إلى لوحة المغلفة فتوين. 3fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. أمثلة من H6N1 وH6N2 المعايرة الفيروس. التخفيفات المسلسل من H6N1 BR / 07 (NA من A / بريسبان / 59/2007 م (H1N1) التي تظهر في حرف الزرقاء) وH6N2 UR / 07 (NA من A / أوروغواي / 716 / 2007 (H3N2) التي تظهر في حرف الحمراء) وحضنت لمدة 18 ساعة في لوحات المغلفة فتوين والتفاعل مع السلطة الوطنية الفلسطينية، HRPO تحديد حد وصفه. متوسط يتم رسم OD 490nm من 2 الآبار ضد مقلوب التخفيف الفيروس. وكان التخفيف من H6N1 تم اختيارها لاستخدامها في إيلا 1:80 وكان التخفيف من H6N2 اختيار 01:40 لأن هذه التخفيفات أدت إلى ما يقرب من 90٪ من الحد الأقصى لكثافة ضوئية وكانت ضمن مجموعة خطية.3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. المعايرة من مصل ضد NA من N1 (رموز الحمراء) و N2 (رموز الأزرق) فرعية. تم قياس NA التتر تثبيط ضد الفيروسات اندماج تضاعفي H6N1 NC / 99 (يحتوي على NA من A / كاليدونيا الجديدة / 20 / لعام 1999 (H1N1) ) وH6N2 WI / 05 (يحتوي على NA من A / ولاية ويسكونسن / 67 / لعام 2005 (H3N2)). ويرد في المئة تثبيط انزيم لالتخفيفات المسلسل من المصل مع الخط الأفقي متقطع يدل على 50٪ إعاقة. التتر تثبيط NA ضد الجديدات من A / كاليدونيا الجديدة / 20 / لعام 1999 (H1N1) (NC / 99) و A / ولاية ويسكونسن / 67 / لعام 2005 (H3N2) (WI / 05) كانت 2 9.3 (640) و 2 7.3 ( 160) على التوالي. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر هاءrsion من هذا الرقم.

مشكلة الأسباب المحتملة) حل
إشارة ضعيفة أو معدومة هضبة تم التوصل إليه في المعايرة فيروس ط) انخفاض نشاط انزيم NA
ب) الأسهم الفيروس لا تخزن تحت الظروف المثلى 		ط) التأكد من أن مخفف لديها درجة الحموضة التي هي الأمثل للنشاط غير متيسر. إذا درجة الحموضة المثلى، وإعداد الأوراق المالية الفيروس الجديد أو التركيز فيروس
ب) تنمو من والاسهم قسامة. قارورة الإضافية تجميد الثلج الجاف قبل تخزينها في -80 ° C
اللون ضعيفة أو معدومة في الآبار إيجابية سيطرة خلية ط) تخفيف الفيروسات المخصصة بشكل غير صحيح
ب)-فيال إلى قارورة التباين في قسامات فيروس المجمدة
ج) PNA- HRPO التشويه والتحريف أو تضعف كثيرا
د) العيادات الخارجية أعدت بشكل غير صحيح 		أنا). المعايرة فيروس كرر
ب) عاير عدة قوارير من نفس الدفعة لضمان عدم وجود التباين. إذا قدر كبير من التباين، وإعداد قسامات جديدة
ج) استخدام تخفيف فيروس الأمثل لretitrate PNA- HRPO
د) كرر مع إعداد جديدة من العيادات الخارجية
تثبيط ضعيفة أو معدومة من الأمصال السيطرة إيجابي ط) الكثير من الفيروسات المستخدمة في فحص
ب) تدهورت المصل 		ط) كرر فيروس المعايرة
ب) الحصول على شروط جديدة لتخزين أمصال مضادة تحقق
تثبيط من الأمصال تحكم سلبي ط) عدم كفاية العلاج للحرارة من المصل
ب) فيروس القليل جدا المستخدمة في فحص 		ط) كرر حرارة تعطيل مصل
ب) المعايرة كرر فيروس
خلفية عالية ط) تلوث ممكن من لوحات
ب) التركيز PNA- HRPO عالية جدا / منخفضة جدا 		ط) كرر باستخدام لوحات مطلية حديثا
ب) عاير السلطة الوطنية الفلسطينية-HRPO لتحديد التخفيف الصحيح لاستخدامه
معارض فيروس المعايرة تثبيط واضح من النشاط NA في التخفيفات منخفضة ط) قد تحتوي على السقاء السائل الركيزة لNA ب) استخدام الفيروس الذي تم مكعبات من خلال وسادة السكروز

جدول تحليل الأسباب 1. الجذر من المقايسات التي لا تستوفي معايير الأداء. يوفر هذا الجدول الأسباب والحلول الممكنة للمشاكل التي قد تحدث عند تنفيذ إيلا.

Discussion

وكتين فحص انزيم مرتبط هو طريقة عملية لقياس NI التتر الأجسام المضادة في مصل الدم. وعلى الرغم من وصف إيلا التي كتبها Lambre آخرون، في عام 1990، وقد تم قبولها باعتبارها فحص مصل الدم القياسية أكثر حداثة، مع العديد من المختبرات إجراء فحص لقياس NI التتر الضد من العينات السريرية 12-16. بعض التعديلات يمكن إجراء الخطوات بروتوكول دون تأثير كبير على التتر NI التي يتم قياسها. على سبيل المثال، في برنامج تلفزيوني ويمكن استخدام مخفف، ومع ذلك، فإنه من المفيد جدا لمقارنة منحنيات المعايرة الفيروس في المخزن المؤقت موصى بها (MES، ودرجة الحموضة 6.5) وبرنامج تلفزيوني قبل أن يتم اتخاذ قرار، وبعض أنواع فرعية NA خفضت بشكل كبير من نشاط انزيمي في الرقم الهيدروجيني> 7.0. عندما لا يتم استخدام الرقم الهيدروجيني الأمثل، وربما يتم تخفيض إشارة القصوى من الفيروسات، مما أدى إلى استخدام كمية زائدة من المستضد (أي فيروس) في مقايسة. في ظل هذه الظروف، قد يكون الفحص انخفاض حساسية.

بعض لالوحظ تثبيط ن معين عندما يتم اختبار المصل غير المعالجة في إيلا. تتم إزالة هذا عن طريق العلاج للحرارة (56 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة)، مشيرا إلى وجود بالحرارة β-مثبطات. وقد وصفت مثبطات غير محددة أخرى (α ومن الدرجة γ) من انفلونزا HA، ولا سيما فيما يتعلق التراص فيروس H3N2 والعدوى. في الواقع، لوحظ تثبيط غير محددة أيضا في إيلا عندما تستخدم فيروسات H3N2 كمصدر من غير متيسر. تتم إزالة هذا تثبيط عن طريق العلاج من عينات المصل مع كمية صغيرة من سياليداز 9.

أما بالنسبة للفحوصات مصلية أخرى، ينبغي إدراج ضوابط السلبية والإيجابية في كل فحص لتوفير وسيلة لتقييم أداء الفحص. عندما الفحص لم استيفاء معايير القبول، وينبغي تحديد السبب. ويقدم الجدول 1 قائمة من الخطوات المحتملة في مقايسة التي يمكن أن تكون موجهة إلى استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

في سفر الأمثال بروتوكول إيلاعيديد في هذا التقرير يستخدم الفيروسات اندماج تضاعفي التي تحتوي على منشؤها HA من فيروس انفلونزا الطيور، كمصدر للNA. وهذا يمثل الحد لإجراء فحص لأنه مطلوب على تصريح للعمل مع الفيروسات المسببة للأمراض الطيور منخفضة. يمكن أن تكون مشتركة H6Nx الفيروسات اندماج تضاعفي بين المختبرات بعد أن تم المعطل. لذلك الفحص يمكن أن تتم من خلال التعاون مرة المختبر توليد فيروس اندماج تضاعفي أثبتت أن تعطيل اكتمال وإعداد احتفظت النشاط NA لها. القيد من استخدام H6Nx الفيروسات اندماج تضاعفي يمكن التغلب عليها باستخدام مصادر غير المعدية من NA. على سبيل المثال، استخدمت بعض المختبرات المنقى المؤتلف NA 17، في حين أن آخرين قد استخدمت جزيئات الفيروسات مثل (VLPs) 15. ومع ذلك، ليسوا NA المؤتلف ولا VLPs متاحة بسهولة، وبالتالي فإننا نواصل استخدام فيروسات الأنفلونزا مع HA الطيور مستضديا-متطابقة.

التقليديةطريقة لقياس NI التتر الضد هو غير عملي لعدة أسباب. الأكثر إثارة للقلق هي المواد الكيميائية الضارة التي يتم اللازمة لإنتاج رد فعل اللون. وبالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة إلى كميات كبيرة من العينات والفحص هو مرهق للأداء. في المقابل، فإن إيلا هو السهل القيام بها، وهي في شكل يسمح المعايرة من عدد معقول من العينات. البيانات من الدراسات التي فحصت إيلا تقلب تبين أن النتائج غلة فحص استنساخه 7،8. جعلت إيلا بالتالي القياس الروتيني لالتتر NI الأجسام المضادة المحتملة، ومن المتوقع أن يتم استخدامها بشكل متكرر أكثر من قبل مختبرات إجراء دراسات مصلية.

هناك العديد من الخطوات الهامة التي يجب أخذها في الاعتبار عند تنفيذ إيلا. أولا، يجب إزالة مثبطات غير محددة من النشاط NA. هذه المثبطات عادة بالحرارة ودمرت من قبل المعالجة الحرارية عند 56 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. المعالجة الحرارية كافية لإزالة غير SPECI-المرورية مثبطات من عينات عندما تستخدم H6 الفيروسات اندماج تضاعفي كمصدر للNA، ولكن عندما تستخدم فيروسات H3N2 في إيلا، والعوامل المصل التي تربط لهيماغلوتينين تتدخل أيضا مع إيلا ويجب أن يتم التوقف عن العلاج مع كمية صغيرة من سياليداز قبل المعالجة الحرارية 9. ثانيا، كمية زائدة من المستضد، أي فيروس H6Nx اندماج تضاعفي، لا ينبغي أن تستخدم هذا يقلل من حساسية مقايسة. لذا المعايرة حذرا من فيروس هي خطوة أساسية. كمية المستضد المستخدمة في كل تجربة يجب أن يقدم إشارة إلى أن أعلى بكثير من الخلفية، ويجب أن يكون ضمن مجموعة خطية من منحنى المعايرة، أي يجب أن يكون إشارة (الكثافة البصرية) يتناسب مع تخفيف الفيروس.

بالإضافة إلى الأمصال الروتينية، وإيلا يمكن استخدامها لتقييم الاختلافات المستضدات بين الجديدات فيروسات الأنفلونزا الموسمية. قد تكون هذه المعلومات مفيدة جدا عند اختيار سلالات الفيروس لإدراجها فيالصورة المرشحين لقاح وسيسهل فهم أكبر من الضغوط المناعية التي تؤدي إلى انجراف الأنتيجين من NA. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يوفر تحليل الأنتيجين من ناس من فيروسات إنفلونزا الخنازير أو الطيور المعلومات الهامة في تحديد القدرة على إحداث جائحة من سلالات الناشئة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coating buffer  KPL 50-84-01
 fetuin Sigma F3385
5x MES, pH 6.5  KD-Medical PBS-0134
CaCl2 Sigma C7902
30% BSA Sigma A8327
Tween 20 Sigma P1379
Lectin PNA-HRPO Sigma  L7759
PBS-T Sigma P3563-10PAK
o-Phenylenediamine dihydrochloride Sigma P8287
Phosphate-citrate buffer Sigma P4922
Sulfuric acid Sigma 258105
96-well  Maxisorp plates NUNC 439454
96-well round bottom well plates NUNC 267245
Plate sealers Thermo Scientific  14-245-192B
Chicken eggs Charles River Laboratories 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) chicken eggs
Multichannel pipette Variety of suppliers e.g., Rainin, Eppendorf 8 or 12 channel manual pipette 50-250 µl volume
Pipette tips Depends on pipettor brand Depends on pipettor brand
Plate reader, with 490 nm filter Perkin Elmer Victor V
Water bath set to 37 °C Variety of suppliers  Variety of models
Water bath set to 56 °C Variety of suppliers  Variety of models
Refrigerator set to 4 °C Variety of suppliers  Variety of models
Incubator set to 37 °C Variety of suppliers  Variety of models

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kilbourne, E. D., Laver, W. G., Schulman, J. L., Webster, R. G. Antiviral activity of antiserum specific for an influenza virus neuraminidase. J Virol. 2 (4), 281-288 (1968).
  2. Compans, R. W., Dimmock, N. J., Meier-Ewert, H. Effect of antibody to neuraminidase on the maturation and hemagglutinating activity of an influenza A2 virus. J Virol. 4 (4), 528-534 (1969).
  3. Schulman, J. L., Khakpour, M., Kilbourne, E. D. Protective effects of specific immunity to viral neuraminidase on influenza virus infection of mice. J Virol. 2 (8), 778-786 (1968).
  4. Murphy, B. R., Kasel, J. A., Chanock, R. M. Association of serum anti-neuraminidase antibody with resistance to influenza in man. N Engl J Med. 286 (25), 1329-1332 (1972).
  5. Sandbulte, M. R., Gao, J., Straight, T. M., Eichelberger, M. C. A miniaturized assay for influenza neuraminidase-inhibiting antibodies utilizing reverse genetics-derived antigens. Influenza Other Respi Viruses. 3 (5), 233-240 (2009).
  6. Lambre, C. R., Terzidis, H., Greffard, A., Webster, R. G. Measurement of anti-influenza neuraminidase antibody using a peroxidase-linked lectin and microtitre plates coated with natural substrates. J Immunol Methods. 135 (1-2), 49-57 (1990).
  7. Couzens, L., et al. An optimized enzyme-linked lectin assay to measure influenza A virus neuraminidase inhibition antibody titers in human sera. J Virol Methods. 210C, 7-14 (2014).
  8. Eichelberger, M. C., et al. Comparability of neuraminidase inhibition antibody titers measured by enzyme-linked lectin assay (ELLA) for the analysis of influenza vaccine immunogenicity. Vaccine. 34 (4), 458-465 (2016).
  9. Westgeest, K. B., et al. Optimization of an enzyme-linked lectin assay suitable for rapid antigenic characterization of the neuraminidase of human influenza A(H3N2) viruses. J Virol Methods. 217, 55-63 (2015).
  10. Hoffmann, E., Neumann, G., Kawaoka, Y., Hobom, G., Webster, R. G. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 6108-6113 (2000).
  11. WHO. Manual of Animal Influenza Diagnosis and Surveillance. , (2002).
  12. Cate, T. R., et al. A high dosage influenza vaccine induced significantly more neuraminidase antibody than standard vaccine among elderly subjects. Vaccine. 28 (9), 2076-2079 (2010).
  13. Couch, R. B., et al. Antibody correlates and predictors of immunity to naturally occurring influenza in humans and the importance of antibody to the neuraminidase. J Infect Dis. 207 (6), 974-981 (2013).
  14. Fritz, R., et al. Neuraminidase-Inhibiting Antibody Response to H5N1 Virus Vaccination in Chronically Ill and Immunocompromised Patients. Open Forum Infect Dis. 1 (2), (2014).
  15. Fries, L. F., Smith, G. E., Glenn, G. M. A recombinant viruslike particle influenza A (H7N9) vaccine. N Engl J Med. 369 (26), 2564-2566 (2013).
  16. Monto, A. S., et al. Antibody to Influenza Virus Neuraminidase: An Independent Correlate of Protection. J Infect Dis. 212 (8), 1191-1199 (2015).
  17. Fritz, R., et al. A vero cell-derived whole-virus H5N1 vaccine effectively induces neuraminidase-inhibiting antibodies. J Infect Dis. 205 (1), 28-34 (2012).

Tags

علم المناعة، العدد 115، الأنفلونزا، لقاح، الأمصال، النورامينيداز، الأجسام المضادة، وتثبيط
قياس الأنفلونزا النورامينيداز تثبيط الجسم المضاد التتر من قبل انزيم مرتبط كتين الفحص
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gao, J., Couzens, L., Eichelberger,… More

Gao, J., Couzens, L., Eichelberger, M. C. Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay. J. Vis. Exp. (115), e54573, doi:10.3791/54573 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter