Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Измерение гриппа нейраминидазы ингибирования Титры антител методом ферментативного лектина Пробирной

Published: September 6, 2016 doi: 10.3791/54573
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Viral Products, CBER, Food and Drug Administration

Abstract

Антитела к нейраминидазы (NA), второй самый распространенный белок на поверхности вируса гриппа, внести свой вклад в сторону защиты от гриппа. Традиционные методы измерения Н.А. ингибирования (NI) титры антител не практичны для рутинного серологического. Этот протокол описывает связанный с ферментом лектин анализа (ELLA), практический альтернативный метод для измерения титр NI, который выполняется в 96-луночные планшеты, покрытые большим гликопротеина субстратом, фетуина. NA отщепляет концевые сиаловой кислоты из фетуина, обнажая предпоследнюю сахара, галактозы. Арахисовое агглютининов (ПНК) является лектин со специфичностью к галактоза и, следовательно, степень десиалилирования может быть определена количественно с помощью конъюгированного с пероксидазой хрена, PNA-, с последующим добавлением хромогенного субстрата пероксидазы. Оптическая плотность, которая измеряется пропорциональна активности NA. Для измерения титра антител NI, серийные разведения сыворотки инкубируют при 37 ° CO / N на фетуина покрытием пластин с фиксированным количеством OF NA. Обратную самого высокого разведения сыворотки, что приводит к ≥50% -ное ингибирование активности NA обозначается как титр антител NI. ELLA предоставляет практический формат для рутинной оценки ответов антител человека после заражения гриппом или вакцинации.

Introduction

Нейраминидазы (NA) представляет собой гликопротеин, экспрессируется на поверхности вирионов гриппа. Его активность фермента необходима для высвобождения вновь образованных вирусных частиц из инфицированных клеток 1,2. Антитела , которые ингибируют активность NA уменьшают вирусные титры и симптомы болезни на животных моделях 3 и коррелирует с устойчивостью к болезни у человека 4. Поэтому увеличение ингибирования NA (NI) титра после вакцинации может служить показателем эффективности вакцины, однако многие в прошлом гриппа исследования иммуногенности не включили эту конечную точку, потому что традиционный тест для измерения титров антител NI непрактичен для рутинного серологического.

Традиционный метод измерения титр NI основан на определения количества сиаловой кислоты , которая отщепляется от гликоконъюгатами по NA 1. Этот метод, который часто называют в качестве метода тиобарбитуровой кислоты (ТБК), использует опасные химические вещества для преобразования переменного тока сиаловойID к хромофора, что может быть определена количественно с помощью спектрофотометрии. Анализ не подходит для тестирования большого количества образцов, так как используются отдельные стеклянные трубки, что делает анализ громоздки. Миниатюризация анализа в 96 - луночные планшеты , обеспечивает более практичный формат 5, тем не менее до сих пор этот анализ требует использования токсичных химических веществ , и , следовательно , не является идеальным.

Альтернативный анализ для измерения титра антител NI был разработан Lambre и др. 6. Этот анализ дает количественную активность фермента путем измерения количества предпоследнем сахара гликопротеинов, галактоза, которая обнажается, когда сиаловой кислоты высвобождается NA. Так как арахисовое агглютининов (ПНК) специфически связывается с галактозой, А ПНК-пероксидаза хрена (HRPO) конъюгат может быть использован для получения колориметрического считыванием. Оптическая плотность, которая измеряется, следовательно, пропорциональна активности NA в пробе. Титры Н.И. измеряются путем определения наибольшего разведениясыворотки, которая ингибирует по меньшей мере, 50% от деятельности НС. Этот фермент-связанный лектин анализ (ELLA) осуществляют в 96-луночных планшетах, покрытых фетуина, высоко гликозилированный белок сыворотки, в качестве субстрата для NA.

Важным фактором для анализов, которые измеряют титр NI, является источником НС. Это происходит потому, что сывороток от вакцинированных или инфицированных индивидуумов содержат антитела к гемагглютинина (HA), а также антитела к NA. Антитела, которые связываются с HA может помешать деятельности НС и, следовательно, чтобы избежать неспецифического ингибирование HA-специфических антител, очищенный Атмосферный или целый вирус, содержащий антигенно-непригодность HA следует использовать в анализе. Эти вирусы могут быть получены с помощью классического реассортирования или путем обратной генетики; цель состоит в том, чтобы спасти вирус, который содержит HA подтипа, который не связан с целевым штамма и NA вируса, который изучается. Анализ, описанный в этой статье, использует вирусы гриппа А, которые генерируются оборотERSE генетика содержит HA подтипа H6 и целенаправленную NA от вирусов гриппа А, подтипа H1N1 и H3N2 5.

Результаты , полученные с помощью Эллы и миниатюрными TBA анализы показывают эти методы сопоставимы с аналогичной подтипа специфичности и чувствительности 7. ELLA не требует использования опасных химических веществ и, следовательно, является предпочтительным методом для измерения титр NI. Это легко выполнить, с помощью всего нескольких шагов (рисунок 1): образцы разводили и переносили на планшет фетуина покрытием , к которому вирус (источник NA) добавляется. Планшет инкубируют O / N и промывают перед добавлением PNA-HRPO. После 2 ч инкубации планшет промывают и пероксидазы добавляют субстрат; реакция цвета прекращается и, наконец, измеряется оптическая плотность и обратная разбавления образца, что в результате по меньшей мере, 50% ингибирование активности NA сообщается как титр на 50% конечной точки. Внутри лабораторного исследования для оценки reproducibiliти от ELLA, показал , что пластины к пластине вариабельность минимальна и оператор к оператору повторяемостью приводит к не более чем в 2 раза различий в титре 7. Последующее межлабораторная исследование изменчивости ELLA показало , что анализ имеет хорошую воспроизводимость , когда выполняется в разных лабораториях и что включение стандарта может еще больше снизить изменчивость результатов 8. Эллы подходит для измерения титра антител NI в сыворотке крови панелей из доклинических и клинических исследований вакцины против гриппа 7 , а также могут быть использованы для оценки антигенных различий между САМ вирусов гриппа 9.

Protocol

Все живые вирусы реассортантный с птичьим компонентами должны быть обработаны с использованием биологической безопасности 2-го уровня (BSL2) -Enhanced практику в лаборатории, одобренной для использования в Министерство сельского хозяйства США (USDA) и Комитетом по институциональной биобезопасности.

1. Приготовление реагентов и исходных материалов

Примечание: Обратитесь к таблице материалов для получения источника всех реагентов.

  1. Фетуина покрытием Пластины
    1. Подготовка буфера для нанесения покрытия путем смешивания 10 мл 10x покрытия буфера с 90 мл деионизованной H 2 O.
    2. Готовят раствор фетуина в дозе 25 мг / мл в 1х буфере для покрывания и хранят в 500 мкл аликвотах при -20 ° C.
    3. Приготовить рабочий раствор фетуина (25 мкг / мл) непосредственно перед нанесением покрытия пластин путем разбавления исходного раствора в 1000 раз в 1X буфера для нанесения покрытия.
    4. Используйте многоканальную пипетку для дозирования 100 мкл рабочего раствора фетуина в алл лунки 96-луночного планшета, который имеет высокую протеином связывающая способность.
    5. Накройте каждую пластину с уплотнителем пластины затем укладывают плиты в группах 10 и завернуть их в фольгу.
    6. Место пластин в холодильнике (2-8 ° С) в течение по крайней мере 18 ч перед выполнением анализа.
      Примечание: Пластины могут быть покрыты заранее и хранить с раствором для нанесения покрытия при температуре 2-8 ° С в течение до 2-х месяцев.
  2. Разбавители
    1. Для приготовления разбавителя , чтобы сделать вирусные и разведения образца (2- (N -morpholino) этансульфоновой кислоты (MES), pH 6,5, 20 мМ CaCl 2, 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,5% Tween 20), смешивают 94,2 мл 1X MES, рН 6,5 с помощью 2 мл CaCl 2 (10 мг / мл), 3,3 мл 30% БСА и 0,5 мл Tween 20.
    2. Для приготовления разбавителя для PNA-HRPO (MES, рН 6,5 с помощью 20 мМ CaCl 2 и 1% бычьего сывороточного альбумина), смесь 94,7 мл 1x MES, рН 6,5 с помощью 2 мл CaCl 2 (10 мг / мл), и 3,3 мл 30% БСА ,
  3. Нейраминидазы (NA)
    Примечание: H6Nx вирус reassortants (они имеют га H6 подтипа и NA интереса), генерируются следующие опубликованных методов 5,10. Запрос ампул инактивированный вирус реассортантного от соавтора, если они не доступны в доме. При использовании инактивированный вирус, подтверждают, что препарат пригоден для использования в ELLA путем демонстрации того, что процесс инактивации не оказывают значительное влияние на деятельность НС.
    1. Культура запас вируса H6Nx в куриные эмбрионы 11 и хранить 0,5 мл аликвоты аккуратным аллантоисной жидкости при температуре -80 ° C.
    2. С помощью нового аликвоты вируса для каждого анализа. Не замораживать и оттаивать аликвот.
  4. Образцы сыворотки и контроли
    1. Тепло-инактивировать все сывороток (тестовые образцы , например, до и после вакцинации сывороток, а также элементы управления, например, образец с известным титром NI) в водяной бане при температуре 56 ° С в течение 45-60 мин. Хранить сывороток при температуре от -20 до -70 ° С до или после термообработки. Если SAMPле должны быть испытаны повторно, сделать несколько аликвот до замораживания таким образом, чтобы образец не повторно замораживают и оттаивают.
    2. Используйте Ella для измерения титров NI человеческой сыворотки, которые доступны в достаточном количестве (> 5 мл), чтобы определить, по меньшей мере, один с низким титром и другой с высоким титром. Хранить в 100 мкл аликвоты, как ≤-20 ° С, так что тот же образец может быть использован в качестве контроля во многих тестах с целью отслеживания характеристик анализа.
  5. Арахис Agglutinin (PNA) -Horseradish пероксидазой (HRPO)
    1. Подготовка ПНК-HRPO разбавителя (MES, рН 6,5 с CaCl 2 и 1% BSA).
    2. Готовят раствор ПНК-HRPO путем растворения 1 мг PNA-HRPO в 1 мл разбавителя. Храните 20-200 мкл аликвоты при -20 ° С.
    3. Перед использованием новой ПНК-HRPO много, тест 1: 500, 1: 750, 1: 1000 и 1: 2000 разбавление этого реагента для определения количества, которое приводит к максимальной OD с положительным контролем (вирус только) и фона ( нет вирусов) тшапка <10% от положительного сигнала.
      1. Сделать учетверять вирусные разведений, как описано в разделе 2.1.
      2. Перенесите разведений на тарелку фетуина покрытием, как описано в разделе 2.2 и инкубируйте при 37 ° C.
      3. Промыть пластины 16-18 ч позже и добавить 1: 500, 1: 750, 1: 1000 и 1: 2000 разбавление ПНК-HRPO (100 мкл / лунку), чтобы дублировать строки пластины.
      4. Завершите определение, как описано в пунктах 2.3.4 до 2.3.9.
      5. Просмотрите данные для выбора разбавления, что привело к максимальному сигналу, который в 10 раз> фон.
    4. Непосредственно перед использованием, подготовить оптимальное разведение ПНК-HRPO определены в 1.5.3.
  6. Подготовьте большой объем промывочного буфера (0,01 М фосфатном буферном растворе (PBS), рН 7,4, 0,05% Tween 20 (PBS-T)). Хранить при комнатной температуре.
  7. Приготовьте субстрат пероксидазы (о-фенилендиамина дигидрохлорид (OPD)): Примечание: альтернативные пероксидазы подложки, такие как 3,3 ', 5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ), могут быть использованы
    1. Готовят фосфатно-цитратном буфере растворением 1 капсула в 100 мл дН 2 O в день анализа.
    2. Растворите 1 таблетку OPD (10 мг) в 20 мл фосфатно-цитратном буфере непосредственно перед использованием.
  8. Подготовка стоп - раствора (1 NH 2 SO 4): добавить 27,2 мл запаса 98% H 2 SO 4 до 973 мл дН 2 O. Смешать, а затем хранить при комнатной температуре.

2. Определение количества НС для использования в ELLA

  1. Подготовка вирусов разведений в 96-луночный планшет
    1. Разлить 120 мкл разбавителя образца (раздел 1.2) в столбцы 1-11 для разбавления пластины.
    2. В колонке 1, добавить дополнительные 96 мкл разбавителя образца.
    3. Оттепель, а затем вихрь пузырек вируса перед добавлением 24 мкл продублировать лунок в колонке 1. Это дает разведение 1:10 вируса.
    4. Сделать серийный 2-кратные разведения вируса в образце разбавителя, путем передачи120 мкл от одной скважины к другой с помощью чистых пипеток для каждого разведения.
  2. Передача Вирус разведений на планшет фетуина покрытием
    1. Вымойте фетуина покрытием пластины 3 раза PBS-T (раздел 1.6), а затем промокните каждую пластину на абсорбирующий бумажным полотенцем, чтобы удалить лишнюю промывочный буфер.
    2. Добавьте 50 мкл разбавителя образца (раздел 1.2.1), в каждую лунку в колонках 1 по 11 из пластины фетуина покрытием.
    3. Добавьте 100 мкл разбавителя образца в колонке 12 (эти скважины отрицательный контроль).
    4. Передача 50 мкл разведенного вируса из колонок 1-11 смесительный пластины к соответствующим лунки планшета фетуина покрытием.
    5. Накройте тарелку с тарелкой герметиком, а затем поместить его в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С.
    6. Обратите внимание на время, в которое будет выполняться остальные этапы (16-18 ч позже).
  3. Завершить Определение NA
    1. Когда инкубация завершена (16-18 ч), передачапластины к стенду и снимите пластину герметиком.
    2. Промыть пластины в 6 раз с PBS-T (раздел 1.7), а затем инвертировать и погладить на впитывающие бумажные полотенца, чтобы гарантировать, что все жидкости были удалены из скважин.
    3. Добавьте 100 мкл / лунку раствора ПНК-HRPO (при разведении, определенной в 1.5.3) во все лунки и инкубируйте в течение 2 ч при комнатной температуре.
    4. Менее 15 минут до инкубации до конца, подготовить OPD решение, как описано в разделе 1.7.
    5. Промыть Тестируемые планшеты 3 раза, чтобы удалить PNA-HRPO и промокнуть сухой перед добавлением 100 мкл OPD субстрата в каждую лунку.
    6. Инкубируйте планшет в течение ровно 10 минут при комнатной температуре.
    7. Остановить реакцию добавлением 100 мкл / лунку 1 н серной кислоты.
    8. Используйте планшет-ридер для измерения оптической плотности (OD) при 490 нм в течение 0,1 сек.
    9. Сохранить и экспортировать все файлы данных.
  4. Выберите Virus Разбавление, который будет использоваться для серология
    1. Нарисуйте график , OD 490 нм (т.е. линейный участок кривой).
    2. Выберите разведение вируса, которое дает примерно 90% от максимального сигнала и находится в пределах линейного диапазона. Убедитесь, что оптическую плотность при выбранном разведении, по крайней мере в 10 раз выше, чем фоновый сигнал. С помощью выбранного вируса разбавления для всех анализов, которые используют этот специфический вирус запас.
      Примечание: В качестве альтернативы, измерения активности NA вируса и использовать ~ 15-20 мкЕд NA активность / мл в ELLA.

3. Фермент-связанный лектин Анализ

Примечание: На рисунке 2 шоWs настройку разбавления и планшеты для анализа.

  1. Сделать разбавлений образца
    1. Поместите термически инактивированные образцы на льду.
      Примечание: 8 Сера может быть разведен в каждой пластине.
    2. Для настройки с использованием разведений, начиная с 1:10 по всей пластине, добавляют 120 мкл разбавителя образца во все лунки в колонках 3-11.
    3. В колонку 2, добавьте 216 мкл разбавителя образца и 24 мкл каждого образца. Смешайте образец в скважину с помощью пипетки вверх и вниз 3 раза, а затем передать 120 мкл в следующую колонку.
    4. После изменения пипеток, смешать содержимое колодца с помощью пипетки вверх и вниз, а затем передать 120 мкл в следующую колонку.
    5. Повторите шаг 3.1.4, пока образец был передан в колонну 11, а остальные 120 мкл отбрасывается.
  2. Добавьте образцы и вирус к фетуина покрытием плиты
    1. Оттепель флакон вируса, вихря и ресуспендируют вируса в разбавителе (раздел 1.2) в разведении, который был выбран в шаге 2.4.2. Приготовьте по крайней мере, 5 мл вируса для каждого планшета для анализа. Хранить разбавленный вирус на льду до тех пор, пока планшеты промывают и образцы сыворотки, которые были добавлены к пластине.
    2. Принятие решения о количестве пластин фетуина покрытием, которые необходимы для анализа (как правило, применяют 4 сывороток на планшет). Промыть фетуина покрытием пластины 3 раза PBS-T и затем инвертировать каждую пластину и пятно на абсорбирующий бумажным полотенцем, чтобы удалить избыток промывочного буфера.
    3. Используйте многоканальную пипетку для переноса 50 мкл каждого контрольного сыворотки или разбавления образца из смесительного пластины в дублирующих лунок в колонках 2-11.
    4. Добавляют 50 мкл разведенной вируса во все лунки для отрицательного контроля (столбец 12), за исключением того.
    5. Добавьте 50 мкл разбавителя образца в лунки в колонке 1 и добавляют 100 мкл разбавителя образца в колонке 12.
    6. Накройте лунки с герметиком и пластины затем перемешать, аккуратно постукивая стороны пластины или размещения на шейкере при умеренной скорости в течение 10 сек.
    7. Поместите пластину в увлажIED инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 16-18 ч.
  3. Добавить PNA-HRPO и завершить испытание, как описано в разделе 2.3

Анализ 4. Данные

  1. Определить обоснованность данного анализа результатов
    1. Убедитесь, что фоновые значения (без вируса) составляют менее 10% от положительного контроля (вирус и без сыворотки).
    2. Убедитесь, что титры контрольных сывороток выполняться в различных анализах с использованием тех же условий, находятся в 2 раза от среднего титра.
    3. Убедитесь, что измерения оптической плотности контрольных скважин соответствуют (≤20% отличается) и что измерения оптической плотности дубликатов образцов скважин согласуются (≤10% различны).
    4. Определить причину неправильных результатов и повторить анализ, если критерии, перечисленные в разделах 4.1.1, 4.1.2 или 4.1.3, не выполняются. Рассмотрим факторы , представленные в таблице 1 , при попытке устранить неисправность.
  2. Назначают 50% конечной точки титр
    1. Для каждого планшета для анализа, суbtract средний фон (без антигена добавляли в лунки) от всех показаний.
    2. Рассчитывают процент ингибирования при каждом разведении сыворотки по следующей формуле: 100 х (вирус О.Д. только контроль - О.Д. тестируемый образец) / вируса ОП только контроль.
    3. Определить наибольшее разведение, в результате которого по меньшей мере, 50% ингибирование максимального сигнала.
    4. Сообщить обратную этого разведения как титр 50% конечной точки.
      Примечание: Если ингибирование 50% не было достигнуто при любом разведении, титр меньше , чем первое разведение испытуемого, например, <10 , когда 1:10 первое разведение испытания.
  3. Рассчитывают 50% ингибирующей концентрации (IC 50)
    1. С помощью четырех параметров логистической регрессии для определения титра IC 50 следующим образом : вычесть средний фон из всех показаний , а затем передать результаты в программу , которая выполняет регрессионный анализ.
    2. С помощью нелинейной регрессии, с максимальным наборомк вирусу только контролировать и минимальный устанавливается равным нулю, чтобы определить разведение, соответствующее ингибирование ровно 50%.
    3. Сообщить обратную этого разведения в качестве титра IC 50.

Representative Results

Анализ представлен в этой рукописи схематически показано на рисунке 1. Рисунок 2 показывает также расположение 96 пластин, а также указывает на то, что серийные разведения образцов сыворотки готовят в разводящей пластине перед передачей их к пластине фетуина покрытием. Критическим параметром анализа является количество нейраминидазы, который используется в анализе; это определяется путем титрования вируса реассортантного. Примеры H6N1 и H6N2 вируса титрованиях показаны на рисунке 3. 1:10, 1:20 и 1:40 разведениях H6N1, оптическая плотность была одинаковой, что указывает , что условия были таковы , что максимальное значение параметра было получено. При разведении 1:80, неизменяемый составляла приблизительно 90% от максимума, и поэтому это разведение вируса, использовали в последующих анализах. Примеры сыворотки титрованиях показаны на рисунке 4. На рисунке показан образец сыворотки человека , который был тиtrated против H6N1 и H6N2 вирусы. Каждая точка данных показывает процент ингибирования активности НС, что было достигнуто за счет серийных разведений сыворотки; первое разведение сыворотки в H6N1 анализе было 1:80; первое разведение сыворотки в H6N2 анализе было 5. Так как наибольшее разведение, которое приводит к ингибированию ≥50% является титр антител Н.И., титр сыворотки, показанной в этом примере, 640 против НС NC / 99 (N1) и 160 против НС WI / 05 (N2).

Рисунок 1
. Рисунок 1. Схема протокола ELLA (A) Определение разведения антигена (вируса) для использования в анализе (этап 2 протокола): Virus разведений добавляют к пластине , покрытой фетуина и деятельностью НС , измеренной количественной оценки концевых остатков галактозы через связывание ПНК-HRPO, как описано в пункте 2.3 протокола; (В г>) Определение сывороточных NI титра антител (этап 3 протокола). Пробы разводили, а затем переносили на пластину фетуина покрытием, где добавляется вирус. Планшет инкубируют O / N перед добавлением PNA-HRPO и выполняя шаги, необходимые для создания цветной реакции. И, наконец, реакция цвета останавливается, и измеряется оптическая плотность. Обратная разбавления образца , что приводит к по меньшей мере , 50% ингибирования активности NA сообщается как титр 50% конечной точки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Диаграмма , чтобы показать планшет ELLA установить. Серийные разведения образцов сыворотки изготовлены в разводящей пластины , а затем переносили на пластину фетуина покрытием. 3fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Примеры H6N1 и H6N2 вируса титрование. Серийные разведения H6N1 BR / 07 (NA А / Брисбен / 59/2007 (H1N1) , показанные в синих символов) и H6N2 UR / 07 (NA А / Уругвай / 716 / 2007 (H3N2), показанных в красных символов) инкубировали в течение 18 ч в фетуина пластинок, покрытых и реакционной способности с ПНК-HRPO, определенной, как описано. В среднем ОД 490 нм из 2 -х скважин в виде зависимости от обратной величины вируса разбавлении. Разбавление H6N1, выбранного для использования в ELLA было 1:80 и разведение H6N2 был выбран 1:40, так как эти разведений привело примерно 90% от максимальной оптической плотности и находились в пределах линейного диапазона.3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Титрование сыворотки против НС N1 (красные символы) и N2 (синие символы) подтипов. Ингибирования Титры NA были измерены против реассортантных вирусов H6N1 NC / 99 (содержит NA А / Новая Каледония / 20/1999 г. (H1N1) ) и H6N2 WI / 05 (содержит NA а / Висконсин / 67/2005 (H3N2)). Процент ингибирования фермента для серийных разведений сыворотки показана пунктирной горизонтальной линией, указывающей 50% ингибирование. Ингибировани Титры НС против САМ А / Новая Каледония / 20/1999 г. (H1N1) (NC / 99) и А / Висконсин / 67/2005 (H3N2) (WI / 05) были 2 9.3 (640) и 2 7.3 ( 160), соответственно. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную веrsion этой фигуры.

проблема Возможные причины) Решение
Слабый сигнал или нет плато достигнуто в титрования вируса я) низкая активность фермента Н.А.
б) вирусный не хранятся в оптимальных условиях 		я) подтверждают, что разбавитель имеет рН, что является оптимальным для деятельности НС; если рН является оптимальным, подготовить новый вирусный или концентрат вируса
II) и аликвоты вырастить запас; Оснастка замораживанием ампул на сухом льду перед хранением при -80 ° C
Слабая или отсутствие цвета в положительных контрольных клеток скважин я) Вирус разбавления был присвоен неправильно
б) колба к Флакон вариабельность в замороженных аликвот вируса
III) PNA- HRPO денатурированный или слишком сильно разбавлен
IV) РОП неправильно подготовлен 		я); Повторите титрование вируса
II) титрование нескольких ампул из той же партии, чтобы гарантировать, что нет изменчивости. Если значительной изменчивостью, готовят свежие аликвоты
III) Использование оптимального разведения вируса к retitrate PNA- HRPO
IV) Повторите с свежеприготовленной РОП
Слабый или отсутствует ингибирование положительной контрольной сыворотки я) Слишком много вирус, используемый в анализе
б) в сыворотке крови ухудшилось 		я) вирус Повторите титрование
б) Получить новые антисыворотки Проверить условия хранения
Ингибирование отрицательной контрольной сыворотки я) Неадекватное термообработка сыворотки
б) Слишком мало вирус, используемый в анализе 		я) Повторите тепловой инактивации сыворотки
б) вирус Повторите титрование
высокий фон я) Возможное загрязнение пластин
б) концентрация PNA- HRPO слишком высокая / слишком низкая 		я) Повторите с использованием пластин с покрытием свеже
б) титрование PNA-HRPO, чтобы определить правильное разведение использовать
Вирус титрование показывает очевидное торможение активности НС при низких разведений я) аллантоисной жидкости может содержать субстрат для NA б) использовать вирус, который был осаждали через подушку сахарозы

Таблица 1. Анализ основных причин анализов , которые не отвечают критериям эффективности. В данной таблице приведены возможные причины и способы решения проблем, которые могут возникнуть при выполнении Эллой.

Discussion

Связанный с ферментом лектин анализ является практическим методом для измерения титров антител NI в сыворотке крови. Хотя ELLA был описан Ламбре и др., В 1990 году, его принятие в качестве стандартного анализа серологических был более недавно, с многочисленными лабораториях при проведении анализа для измерения титра антител NI клинических образцов 12-16. Некоторые модификации могут быть сделаны к шагам протокола без большого влияния на титр NI, которые измеряются. Например, PBS, может быть использован в качестве разбавителя, тем не менее, очень полезно сравнить кривые титрования вируса в рекомендуемых буфере (MES, рН 6,5) и PBS, до того, как решение принято, так как некоторые подтипы Н.А. значительно пониженную активность фермента в рН> 7,0. Когда оптимальное значение рН не используется, максимальный сигнал вируса может быть уменьшено, что приводит к использованию избыточного количества антигена (т.е. вирус) в анализе; в этих условиях, анализ может иметь пониженную чувствительность.

Некоторые нетингибирование н-специфических наблюдается при отсутствии лечения сывороток тестируются в ELLA. Это удаляется с помощью тепловой обработки (56 ° C в течение 45 мин), что указывает на присутствие термолабильных бета-ингибиторов. Другие неспецифические ингибиторы (α и γ-класс) гриппа HA были описаны, в частности, по отношению к H3N2 вируса гемагглютинации и инфекционности. Действительно, неспецифическое ингибирование наблюдается также в ELLA, когда H3N2 вирусы используются в качестве источника NA; Это торможение удаляют путем обработки образцов сыворотки с небольшим количеством сиалидазой 9.

Что касается других серологических анализов, отрицательный и положительный контроль должны быть включены в каждом анализе, чтобы обеспечить средства для оценки результатов анализа. Когда анализ не соответствовали критериям приемлемости, причина должна быть идентифицированы. В таблице 1 приведен список возможных шагов в анализе , которые могут быть решены для устранения неполадок.

Пров протокол ELLAided в этом отчете использует отсортированные вирусы, которые содержат происходящий HA от вируса птичьего гриппа, в качестве источника НС. Это представляет собой ограничение для проведения анализа, поскольку требуется разрешение на работу с низким уровнем патогенных вирусов птичьего гриппа. H6Nx реассортантный вирусы могут быть разделены между лабораториями после того, как они были инактивируется. Поэтому анализ может быть проведен с помощью коллабораций как только лаборатория генерации Реассортант продемонстрировал, что инактивация завершена и препарат сохранил свою активность NA. Ограничение использования H6Nx отсортированные вирусы могут быть преодолены с помощью неинфекционные источники НС. Например, некоторые лаборатории использовали очищенный рекомбинантный NA 17, в то время как другие использовали вирусоподобные частицы (VLP) 15. Тем не менее, ни один рекомбинантный NA, ни VLPs легко доступны, и поэтому мы продолжаем использовать вирусы гриппа с антигенно-несогласованной птичьего HA.

Традиционныйметод измерения титра антител NI не является практичным по нескольким причинам; наибольшую озабоченность вызывают вредные химические вещества, которые необходимы для получения цветной реакции. Кроме того, большие объемы пробы нужны, и анализ является сложной операцией. В противоположность этому, ELLA легко выполнить и в формате, который позволяет титрование разумного количества образцов. Данные исследований , которые изучали ELLA изменчивости , показывают , что доходность анализа воспроизводимые результаты 7,8. ELLA имеет, следовательно, сделал регулярные измерения титров антител NI возможных, и предполагается, что он будет использоваться чаще в лабораториях, проводящих исследования серологические.

Есть несколько важных шагов, которые необходимо учитывать при выполнении Эллой. Во-первых, неспецифические ингибиторы активности NA должны быть удалены. Эти ингибиторы, как правило, термолабильных и разрушаются при тепловой обработке при температуре 56 ° С в течение 45 мин. Термическая обработка достаточно для удаления не специфичнуюFIC ингибиторы из образцов при H6 реассортант вирусы используются в качестве источника NA, тем не менее, когда вирусы H3N2 используются в ELLA, сывороточные факторы, которые связываются с гемагглютинина также мешать Эллы и должны быть удалены путем обработки небольшим количеством сиалидазой до термической обработки 9. Во- вторых, избыточное количество антигена, т.е. реассортантного вируса H6Nx, не следует использовать , так как это снижает чувствительность анализа. Тщательное титрование вируса поэтому является важным шагом; количество антигена , используемого в каждом анализе должен обеспечивать сигнал , который значительно выше фона, и должна быть в пределах линейного диапазона кривой титрования, т.е. сигнал (оптическая плотность) должна быть пропорциональна вируса разбавления.

В дополнение к обычному серологических, Эллы может быть использован для оценки антигенных различий между НАН вирусов сезонного гриппа. Эта информация может быть очень полезным при выборе штаммов вируса для включения аs вакцин-кандидатов и будет способствовать более глубокому пониманию иммунных давлений, которые приводят к антигенного дрейфа НС. Кроме того, антигенный анализ НСБУ от свиного или птичьего гриппа может предоставить важную информацию для определения пандемического потенциала развивающихся штаммов.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coating buffer  KPL 50-84-01
 fetuin Sigma F3385
5x MES, pH 6.5  KD-Medical PBS-0134
CaCl2 Sigma C7902
30% BSA Sigma A8327
Tween 20 Sigma P1379
Lectin PNA-HRPO Sigma  L7759
PBS-T Sigma P3563-10PAK
o-Phenylenediamine dihydrochloride Sigma P8287
Phosphate-citrate buffer Sigma P4922
Sulfuric acid Sigma 258105
96-well  Maxisorp plates NUNC 439454
96-well round bottom well plates NUNC 267245
Plate sealers Thermo Scientific  14-245-192B
Chicken eggs Charles River Laboratories 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) chicken eggs
Multichannel pipette Variety of suppliers e.g., Rainin, Eppendorf 8 or 12 channel manual pipette 50-250 µl volume
Pipette tips Depends on pipettor brand Depends on pipettor brand
Plate reader, with 490 nm filter Perkin Elmer Victor V
Water bath set to 37 °C Variety of suppliers  Variety of models
Water bath set to 56 °C Variety of suppliers  Variety of models
Refrigerator set to 4 °C Variety of suppliers  Variety of models
Incubator set to 37 °C Variety of suppliers  Variety of models

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kilbourne, E. D., Laver, W. G., Schulman, J. L., Webster, R. G. Antiviral activity of antiserum specific for an influenza virus neuraminidase. J Virol. 2 (4), 281-288 (1968).
  2. Compans, R. W., Dimmock, N. J., Meier-Ewert, H. Effect of antibody to neuraminidase on the maturation and hemagglutinating activity of an influenza A2 virus. J Virol. 4 (4), 528-534 (1969).
  3. Schulman, J. L., Khakpour, M., Kilbourne, E. D. Protective effects of specific immunity to viral neuraminidase on influenza virus infection of mice. J Virol. 2 (8), 778-786 (1968).
  4. Murphy, B. R., Kasel, J. A., Chanock, R. M. Association of serum anti-neuraminidase antibody with resistance to influenza in man. N Engl J Med. 286 (25), 1329-1332 (1972).
  5. Sandbulte, M. R., Gao, J., Straight, T. M., Eichelberger, M. C. A miniaturized assay for influenza neuraminidase-inhibiting antibodies utilizing reverse genetics-derived antigens. Influenza Other Respi Viruses. 3 (5), 233-240 (2009).
  6. Lambre, C. R., Terzidis, H., Greffard, A., Webster, R. G. Measurement of anti-influenza neuraminidase antibody using a peroxidase-linked lectin and microtitre plates coated with natural substrates. J Immunol Methods. 135 (1-2), 49-57 (1990).
  7. Couzens, L., et al. An optimized enzyme-linked lectin assay to measure influenza A virus neuraminidase inhibition antibody titers in human sera. J Virol Methods. 210C, 7-14 (2014).
  8. Eichelberger, M. C., et al. Comparability of neuraminidase inhibition antibody titers measured by enzyme-linked lectin assay (ELLA) for the analysis of influenza vaccine immunogenicity. Vaccine. 34 (4), 458-465 (2016).
  9. Westgeest, K. B., et al. Optimization of an enzyme-linked lectin assay suitable for rapid antigenic characterization of the neuraminidase of human influenza A(H3N2) viruses. J Virol Methods. 217, 55-63 (2015).
  10. Hoffmann, E., Neumann, G., Kawaoka, Y., Hobom, G., Webster, R. G. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 6108-6113 (2000).
  11. WHO. Manual of Animal Influenza Diagnosis and Surveillance. , (2002).
  12. Cate, T. R., et al. A high dosage influenza vaccine induced significantly more neuraminidase antibody than standard vaccine among elderly subjects. Vaccine. 28 (9), 2076-2079 (2010).
  13. Couch, R. B., et al. Antibody correlates and predictors of immunity to naturally occurring influenza in humans and the importance of antibody to the neuraminidase. J Infect Dis. 207 (6), 974-981 (2013).
  14. Fritz, R., et al. Neuraminidase-Inhibiting Antibody Response to H5N1 Virus Vaccination in Chronically Ill and Immunocompromised Patients. Open Forum Infect Dis. 1 (2), (2014).
  15. Fries, L. F., Smith, G. E., Glenn, G. M. A recombinant viruslike particle influenza A (H7N9) vaccine. N Engl J Med. 369 (26), 2564-2566 (2013).
  16. Monto, A. S., et al. Antibody to Influenza Virus Neuraminidase: An Independent Correlate of Protection. J Infect Dis. 212 (8), 1191-1199 (2015).
  17. Fritz, R., et al. A vero cell-derived whole-virus H5N1 vaccine effectively induces neuraminidase-inhibiting antibodies. J Infect Dis. 205 (1), 28-34 (2012).

Tags

Immunology выпуск 115 гриппа вакцины серологические нейраминидазы антитело ингибирование
Измерение гриппа нейраминидазы ингибирования Титры антител методом ферментативного лектина Пробирной
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gao, J., Couzens, L., Eichelberger,… More

Gao, J., Couzens, L., Eichelberger, M. C. Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay. J. Vis. Exp. (115), e54573, doi:10.3791/54573 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter