Abstract
nöraminidaz antikorları (NA), grip virüsü bulunan en bol yüzey proteini, gribe karşı koruma doğru katkıda bulunur. Geleneksel yöntemler NA inhibe ölçmek için (NI) antikor titreleri rutin seroloji için pratik değildir. Bu protokol, enzim-bağlantılı lektin tahlili (ELLA), büyük bir glikoprotein alt-tabaka, fetuin ile kaplanmış 96 oyuklu plakalarda gerçekleştirilir NI titrelerini ölçmek için pratik bir alternatif metodu tarif eder. NA böler terminal siyalik fetuin gelen asitler, sondan bir önceki şeker açığa, galaktoz. Yer fıstığı aglutinini (PNA) bir kromojenik peroksidaz substrat ilave edildikten sonra, bir PNA-at turbu peroksidaz eşleniği kullanılarak belirlenebilir galaktoz özgünlük ve desialylation dolayısıyla ölçüde bir lektindir. ölçülen optik yoğunluğu NA aktivitesi ile orantılıdır. NI antikor titrelerini ölçmek için, seranın seri haldeki seyreltileri 37 ° CO inkübe edilir / sabit bir miktar O ile fetuin kaplı plakalar üzerine Kf NA. UA aktivitesinin ≥50% inhibisyonu ile sonuçlanır en yüksek serum seyreltisi karşılığı NI antikor titresi olarak belirlenmiştir. Ella influenza enfeksiyonu veya aşılamadan sonra insan antikor yanıtlarının rutin değerlendirilmesi için pratik bir format sağlar.
Introduction
Nöraminidaz (NA) grip virüslerinin yüzeyinde eksprese edilen bir glikoproteindir. Bu enzim aktivitesi, enfekte olmuş hücreleri 1,2 yeni oluşan virüs partikülü için gereklidir. Aktivitesi Na önleyen antikorlar, hayvan modellerinde 3 virüs titrelerini ve hastalık belirtilerini azaltır ve insanlarda 4 hastalığa karşı direnç ile ilişkilidir. Geleneksel tahlil rutin seroloji için pratik değildir NI antikor titreleri ölçmek için, çünkü NA inhibisyonu (NI) titreleri aşağıdaki aşılama artış, bu nedenle ancak çok geçmiş grip immünojenite çalışmaları bu son nokta içermiyordu, aşının etkinliğinin bir göstergesi hizmet edebilir.
NI titrelerini ölçmek için geleneksel bir yöntemdir yok 1 ile gliko yarılır sialik asit miktarının miktarının dayanır. genellikle thiobarbituric asit (TBA) yöntemi olarak adlandırılan bu yöntem, sialik ac dönüştürmek için tehlikeli kimyasallar kullanmaktadırspektrometresi ile tayin edilebilir bir kromofor id. Deney ayrı cam borular kullanılmaktadır, çünkü, örneklerin çok sayıda test deneyi hantal yapmak için uygun değildir. 96 gözenekli plakalara tahlilin minyatürleştirme, ancak bu deney de zehirli kimyasal kullanımı gerektirir ve bu nedenle ideal değildir, daha pratik bir biçimde 5 elde edilir.
NI, antikor titrelerini ölçecek alternatif bir deney Lambre ve ark., 6 tarafından geliştirilmiştir. Bu deney, sialik asit Na tarafından serbest bırakıldığında açıkta kalır glikoproteinler, galaktoz sondan bir önceki şeker miktarı ölçülerek enzim aktivitesini ifade etmektedir. yer fıstığı aglutinini (PNA) galaktoz spesifik olarak bağlanan bu yana, bir PNA-yaban turpu peroksidaz (HRPO) konjügat kolorimetrik okunmasını elde etmek için kullanılabilir. ölçülen optik yoğunluğu numunede NA aktivitesi orantılıdır. NI titerleri yüksek dilüsyon saptanmasıyla ölçülürUA aktivitesinin en az% 50 inhibe eden serum. Bu enzim-bağlanmış lektin deneyi (ELLA) NA için alt-tabaka olarak, fetuin, yüksek glikosile serum proteini ile kaplanmış 96 oyuklu plakalarda yapılır.
NI titreleri ölçen tahliller için önemli bir, NA kaynağıdır. Aşılanmış veya enfekte bireylerden elde edilen serumlar NA'ya hemaglutinin (HA) için antikorlar gibi antikorlar içeriyor olmasıdır. HA bağlanan antikorlar NA aktivitesine müdahale edebilir ve bu nedenle, testte kullanılan gereken bir antijenik uyuşmayan HA ihtiva eden HA-özel antikorlarla spesifik olmayan inhibisyonu, arıtılmış, Na ya da bütün virüs önlemek için. Bu virüsler, klasik reassortment veya ters genetik ile üretilebilir; Amaç çalışılmaktadır virüsün hedef suşu ile ilgili olmayan bir alt tip HA içeren bir virüs kurtarmak için, ve NA. Bu makalede açıklanan tahlil dev tarafından oluşturulan influenza A virüsleri istihdaminfluenza A virüsleri, alt tipleri H1N1 ve H3N2 5'ten alt tip H6 ve HA ve hedeflenen NA içeren genetik ERSE.
ELLA tarafından oluşturulan Sonuçlar ve minyatür TBA deneyleri bu yöntemlerin benzer alt tip özgüllük ve duyarlılık 7 ile karşılaştırılabilir olduğunu göstermektedir. ELLA tehlikeli kimyasalların kullanılmasını gerektirir ve bu nedenle NI titrelerini ölçmek için tercih edilen bir yöntemdir etmez. Sadece birkaç adımda (Şekil 1), gerçekleştirilmesi kolaydır: Örnekler seyreltilir ve eklenen bir fetuin-kaplı plakaya virüsü (NA kaynağı) aktarılır. Plaka O / N inkübe ve PNA-HRPO eklemeden önce yıkanır. 2 saat inkübasyondan sonra, plaka yıkanmış ve peroksidaz substratı ilave edilir; Renk reaksiyonu durdurulur ve son olarak optik yoğunluk ölçülür NA aktivitesinin en az% 50 inhibisyon ile sonuçlanmıştır örnek inceltilmesi ile karşılıklı% 50 uç-nokta titeri olarak rapor edilir. Içi laboratuvar çalışması reproducibili değerlendirmek içinELLA Ty plaka-plaka değişkenliği az ve operatör için işleticinin tekrarlanabilirlik titresi 7 en fazla 2 misli farklar ile sonuçlandığını göstermiştir. Ella değişkenlik Bir sonraki arası laboratuar çalışması farklı laboratuarlarda yapılan ve bir standardın bu içerme ayrıca sonuçlarında 8 değişkenliği azaltabilir zaman tahlil iyi tekrarlanabilirlik sahip olduğunu göstermiştir. ELLA klinik öncesi ve klinik çalışmalara influenza aşısı 7 serum panelleri NI antikor titreleri ölçmek için uygun olan ve aynı zamanda influenza virüsleri 9 NBS arasında antijenik farklılıkları değerlendirmek için de kullanılabilir.
Protocol
Kuş bileşenleri ile tüm canlı yeniden düzenlenmiş virüsler biyogüvenlik düzeyi Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı (USDA) ve kurumsal biyogüvenlik komitesi tarafından kullanım için onaylanmıştır bir laboratuvarda -Gelişmiş uygulamaları 2 (BSL2) kullanılarak ele alınması gerekir.
Reaktifler ve başlangıç materyalinin hazırlanması 1.
Not: Tüm reaktiflerin kaynağını elde etmek için malzemeler Tablo bakın.
- Fetuin kaplı plakalar
- 90 ml 10 mi 10x kaplama tampon karıştırarak kaplama tamponu hazırlayın H2O deiyonize
- -20 ° C'de 500 ul alikolar içinde 1x kaplama tamponu ve mağaza 25 mg / ml'de fetuin bir stok çözelti hazırlayın.
- 1x kaplama tamponu içinde 1000 kat stok çözelti seyreltilerek kaplama hemen Plakalar, önceden fetuin (25 ug / ml) bir çalışma çözeltisi hazırlayın.
- al içine fetuin çalışma çözeltisi 100 ul dağıtmak için bir çok kanallı pipet kullanınyüksek protein bağlama kapasitesine sahip 96 oyuklu bir plakanın l kuyu.
- Daha sonra 10 kişilik gruplar halinde plakaları yığını ve folyo sarın bir plaka kapatıcı ile her plaka örtün.
- bir deney yapmadan önce bir buzdolabına (2-8 ° C) en az 18 saat tabak yerleştirin.
Not: Levhalar önceden kaplandı ve 2 aya kadar 2-8 ° C'de kaplama çözeltisi ile depolanabilir.
- Dilüentler
- 94.2 ml karıştırın virüsü ve Numune seyreltileri (2- (N-morfolino) etansülfonik asit (MES), pH 6.5, 20 mM CaCl2,% 1 sığır serumu albümini (BSA) ve% 0.5 Tween 20) yapmak için seyreltici hazırlamak 1X MES, 2 mi CaCl2 (10 mg / ml) ile pH 6.5, 3.3 ml% 30 BSA ve 0.5 ml Tween 20.
- 2 mi CaCl2 (10 mg / ml) ile 94.7 mi 1 x MES, pH 6.5 karışımı, PNA-HRPO (MES, 20 mM CaCl2 ve% 1 BSA ile pH 6.5) seyreltici hazırlamak ve 3.3 ml% 30 BSA .
- Nöraminidaz (NA)
Not: H6Nx virüsü reassyayınlanan yöntemler 5,10 aşağıdaki ortants (bu H6 alt tipi HA ve ilgi NA var), oluşturulur. onlar in-house mevcut değilse bir ortak çalışan inaktive reassortant virüsü şişeleri talep edin. inaktif virüs kullanırken, hazırlık inaktivasyonu süreci NA aktivitesi üzerinde önemli bir etkisi yoktu gösteri yoluyla ELLA kullanıma uygun olduğunu teyit etmektedir.- Kültür, bir embriyo halindeki tavuk yumurtalarının 11 H6Nx Virüsün stok ve -80 ° C'de susuz alantoik akışkan, 0.5 ml lik kısımlar halinde saklayın.
- Her bir deney için yeni bir virüs kısım kullanın. dondurmak ve alikotları çözülme etmeyin.
- Serum numuneleri ve Kontroller
- Tüm serum Isı inaktive (test örnekleri, örneğin, ön ve son aşılama serumlar, hem de kontrol, örneğin, bilinen NI titeri ile, örnek) 45-60 dakika boyunca 56 ° C'de bir su banyosu içinde. ısıl işlem öncesi veya sonrasında -20 -70 ° C 'de sera saklayın. samp Eğerles defalarca test edilmiş numune Tekrar tekrar dondurulup çözülmüş değildir, böylece dondurmadan önce birkaç alikotları yapmak gerekmektedir.
- Burada inceliği yüksek olan en azından düşük titreye sahip bir başka tespit etmek (> 5 mi), uygun bir miktarda mevcuttur, insan serumlarının NI titrelerini ölçmek için Ella'yı kullanın. olarak 100 ul alikotları Mağaza ≤-20 ° C aynı örnek deney performansı izlemek için bir çok deneylerde bir kontrol olarak kullanılabilir, böylece.
- Yer fıstığı aglutinini (PNA) -Horseradish peroksidaz (HRPO)
- PNA-HRPO seyreltici (MES, CaCI2 ve% 1 BSA ile pH 6.5) hazırlayın.
- 1 ml seyreltici PNA-HRPO, 1 mg eriterek PNA-HRPO stok çözelti hazırlayın. -20 ° C'de 20-200 ul alikotları saklayın.
- (Pozitif kontrol ile maksimal OD sonuçlanan miktarını belirlemek için bu reaktifin 2000 dilüsyonları (virüs sadece) ve bir arka plan: 500, 1: 750, 1: 1000 ve 1 yeni PNA-HRPO çok test 1 kullanmadan önce Resim virüsü) tşapka <pozitif sinyal% 10.
- bölüm 2.1'de anlatıldığı gibi dörtlü virüs dilüsyonları olun.
- Bölüm 2.2'de tarif edildiği gibi, bir fetuin-kaplı plakaya dilüsyonları aktarın ve 37 ° C'de inkübe plakası.
- 16-18 saat sonra plaka yıkanır ve 1 ekleyin: plaka satır çoğaltmak için, PNA-HRPO 2.000 seyreltileri (100 ul / oyuk): 500, 1: 750, 1: 1,000 ve 1 ile.
- 2.3.9 adımları 2.3.4 anlatıldığı gibi tahlil tamamlayın.
- > 10 kez arka plan maksimum sinyal sonuçlandı seyreltme seçmek için verileri gözden geçirin.
- Kullanımdan hemen önce, 1.5.3 tanımlanan PNA-HRPO optimal dilüsyon hazırlanır.
- Yıkama tampon maddesi (0.01 M fosfat tamponlu tuz (PBS), pH 7.4,% 0.05 Tween 20 (PBS-T)) büyük hacim hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın.
- Peroksidaz substratı (o-fenilendiamin dihidroklorür (OPD)) hazırlanması: Not: 3,3 alternatif peroksidaz alt tabakalar 'Kullanılabilir,, 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB)
- Deney gününde 100 mi dH 2 O 1 kapsül çözülmesiyle fosfat sitrat tamponu hazırlayın.
- Kullanımdan hemen önce, fosfat sitrat tamponu, 20 ml 1 OPD tablet (10 mg) içinde çözülür.
- Durdurma solüsyonu (1 NH 2 SO 4) hazırlayın: SO 4 973 ml dH 2 O. 27,2 ml stok% 98 H 2 eklemek Karıştırın ve daha sonra oda sıcaklığında saklayın.
NA Miktarının Belirlenmesi 2. ELLA kullanın için
- 96 oyuklu bir plaka içerisinde virüs seyreltmeleri hazırlanması
- sütun seyreltme plaka 1-11 içine 120 ul numune seyreltici (bölüm 1.2) koyun.
- sütun 1 için ek 96 ul örnek seyreltici ekleyin.
- Çözülme ve sonra bu virüsün 1:10 seyreltme verir sütunda 1. kuyuları çoğaltmak için 24 ul eklemeden önce virüs şişesini vorteks.
- aktararak, örnek seyreltici içinde virüs seri 2 kat seyreltileri yapmakbirinden her iyi seyreltme için bir sonraki kullanarak temiz pipet uçları 120 ul.
- Bir Fetuin kaplı Plate virüs seyreltmeleri aktarın
- PBS-T (bölüm 1.6) ile fetuin kaplı plaka 3 kere yıkayın ve daha sonra herhangi bir aşırı yıkama tamponu çıkarmak için emici kağıt havlu üzerine her plaka kurulayın.
- fetuin kaplı plaka 11 sütun her bir kuyucuğa 1 Örnek seyreltici (bölüm 1.2.1) 50 ul ekle.
- sütun 12 numune seyreltici 100 ul (Bu kuyular, negatif kontrol olarak) eklenir.
- Aktarım sütun fetuin kaplı levhanın tekabül eden gözleri seyreltme plaka 1-11 seyreltilmiş virüs, 50 ul.
- Bir plaka kapatıcı ile örtün ve plaka daha sonra 37 ° C de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde yerleştirin.
- Geri kalan adımlar (16-18 saat sonra) yapılacaktır hangi zaman not alın.
- NA Tayini tamamlayın
- inkübasyon (16-18 saat) tamamlandığında, aktarmaktezgah plaka ve plaka mühürleyen çıkarın.
- PBS-T (bölüm 1.7) ile plaka 6 kez yıkayın ve sonra ters ve emici kağıt havlu üzerinde pat tüm sıvı kuyulardan kaldırıldı sağlamak.
- tüm oyuklara (1.5.3 belirlenen seyreltmede) 100 ul / oyuk PNA-HRPO solüsyonu ilave edin ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca plaka inkübe edin.
- Kuluçka sonunda için az 15 dakika önce, Bölüm 1.7'de tarif edildiği gibi, OPD solüsyon hazırlanır.
- PNA-HRPO kaldırmak ve her kuyuya OPD substrat 100 ul eklemeden önce kuru leke test plakaları 3 kere yıkayın.
- Oda sıcaklığında tam olarak 10 dakika boyunca inkübasyona bırakılır.
- 100 ul / 1 N sülfürik asit ilave ederek reaksiyonu durdurun.
- 0.1 saniye süreyle 490 nm'de optik yoğunluk (OD) ölçmek için, bir plaka okuyucu kullanarak.
- Kaydedin ve tüm veri dosyalarını ihracat.
- Seroloji için kullanılır edilecek Virüs Seyreltme seçin
- OD 490 araziler bir grafik çizmek (eğrisinin, yani lineer bölge) ile orantılıdır OD neden virüs seyreltmeleri.
- maksimum sinyal yaklaşık% 90 verir ve doğrusal aralıkta virüs seyreltme seçin. Seçilen seyreltme OD en azından arka plan sinyali daha fazla 10 kat olduğunu doğrulayın. Bu, özellikle virüs stokları kullanan tüm deneyleri için seçilen bir virüs seyreltme kullanın.
Alternatif virüsün NA aktivitesini ölçmek ve ELLA 15-20 ~ μU NA faaliyet / ml kullanın: Not.
3. Lektin Deneyi enzim-bağlanmış
Not: Şekil 2 shoSeyreltme ve deney plakalarının setup ws.
- Numune seyreltileri yapmak
- buz üzerinde ısı ile inaktive örnekleri yerleştirin.
Not: 8 sera, her plaka seyreltilebilir. - Bir plaka üzerinde 1:10 başlayan dilüsyonları kullanarak kurmak için, sütunlar 3-11 tüm kuyulara 120 ul örnek seyreltici ekleyin.
- 2. sütun için, örnek seyreltici 216 ul her bir numune için 24 ul ekle. yukarı pipetleme ve 3 kez aşağı iyi numune karıştırın ve daha sonra bir sonraki sütuna 120 ul aktarın.
- pipet uçları değiştirdikten sonra, aşağı yukarı pipetleme kuyu içeriğini karıştırın ve daha sonra bir sonraki sütuna 120 ul aktarın.
- numunenin kadar adımı yineleyin 3.1.4 sütuna 11 devredilmiştir ve kalan 120 ul atılır.
- buz üzerinde ısı ile inaktive örnekleri yerleştirin.
- Fetuin kaplı Plate Örnekleri ve Virüs ekle
- Virüs, girdap bir şişe çözülme ve 2. adımda seçilen seyreltme de seyreltici (bölüm 1.2) virüs tekrar süspansiyon.4.2. Her bir deney plakası için virüsün en az 5 ml hazırlayın. Plakalar yıkanır ve serum numuneleri plakaya ilave edilinceye kadar buz üzerinde seyreltilmiş virüs tutun.
- Deney için gerekli olan fetuin kaplı plakaların sayısına dair karar (genellikle plaka başına 4 sera uygulanır). PBS-T ile fetuin kaplı plaka 3 kere yıkayın ve sonra her plaka ters ve aşırı yıkama tamponu çıkarmak için emici kağıt havlu üzerine leke.
- sütun 2-11 yinelenen kuyulara seyreltme plaka her serum kontrolü veya dilusyonun 50 ul aktarmak için çok kanallı pipet kullanın.
- Negatif kontrol (sütun 12) dışında tüm oyuklara seyreltilmiş virüs, 50 ul ekle.
- sütun 1 çukurlara örnek seyreltici 50 ul ilave edin ve kolon 12 örnek seyreltici 100 ul ilave edin.
- Bir plaka kapatıcı ile kuyu Kapak ve yavaşça plaka kenarlarına dokunarak ya da 10 sn orta hızda bir plaka karıştırıcısı üzerinde koyarak karıştırın.
- Bir humidif plaka koyun16-18 saat boyunca 37 ° C'de ied inkübatör.
- PNA-HRPO ekleyin ve bölüm 2.3'de anlatıldığı gibi tahlil tamamlamak
4. Veri Analizi
- Analiz Sonuçlarının Geçerlilik belirleyin
- Arka plan değerleri (hiçbir virüs) pozitif kontrol (virüs ve hiçbir serumu)% 10'dan daha az olduğundan emin olun.
- aynı koşullar kullanılarak farklı deneylerde kontrol serumları çalıştırmak titreleri medyan titreye 2 kat içinde olduğundan emin olun.
- kontrol kuyuları bu OD ölçümleri (≤20% farklı) tutarlı ve yinelenen örnek kuyuların o OD ölçümleri (≤10% farklı) tutarlı onaylayın.
- Geçersiz sonuçların kök nedenini belirlemek ve 4.1.1, 4.1.2 veya 4.1.3 listelenen kriterler, yerine getirilmediği takdirde tahlil tekrarlayın. Gidermek için çalışırken Tablo 1'de sunulan faktörleri göz önünde bulundurun.
- % 50 uç nokta titerinin atama
- Her bir deney plakası, su içintüm okumalardan ortalama arka plan (oyuklara ilave hiçbir antijen) btract.
- Formülü kullanarak her serum seyreltme de yüzde inhibisyon hesaplayın: 100 x (OD virüs yalnızca kontrol - OD test örneği) / OD virüsü sadece kontrol.
- Maksimum sinyalin en az% 50 inhibisyon ile sonuçlanmıştır yüksek dilüsyon tanımlar.
- % 50 uç-nokta titeri olarak seyreltisinin tersi bildirin.
Not:% 50 inhibisyon herhangi seyreltme elde değil ise, titre, test edilen ilk seyreltme daha az, örneğin, <10 01:10 test ilk seyreltme olduğunu.
- % 50 engelleyici konsantrasyonunun hesaplanması (IC50)
- Regresyon analizi gerçekleştiren bir program sonuçlarını aktarmak sonra tüm okumalardan ortalama arka plan çıkarma ve aşağıdaki gibidir: IC 50 titresi belirlemek için dört parametre lojistik regresyon kullanın.
- Maksimum seti ile, doğrusal olmayan regresyon kullanınvirüs, sadece kontrolü ve minimum tam% 50 inhibisyon ile karşılık gelen seyreltmenin tespit etmek için, sıfıra ayarlanır.
- IC50 titresi olarak seyreltisinin tersi bildirin.
Representative Results
Bu makalede yer alan deney 2 96 çukurlu levha düzenini göstermektedir. Şekil 1 'de şematik olarak gösterilen ve serum numunelerinin seri seyreltmeleri fetuin kaplı plakaya transfer etmeden önce bir seyreltme plakası hazırlanır olduğunu belirtir. deneyinin kritik bir parametre deneyinde kullanılan nöraminidaz miktarıdır; Bu reassortant virüsünün titrasyonu ile belirlenir. H6N1 ve H6N2 virüs titrasyon örnekleri arasında. Şekil 3 'de gösterilmiştir H6N1 1:10, 1:20 ve 1:40 seyreltileri ile optik yoğunluk şartları maksimum okuma elde edildiği gibi olduğu gösteren, benzer. Bir 1:80 seyreltmede, Okuması maksimumunun yaklaşık% 90 olmuştur ve bu nedenle, bu virüs dilüsyon takip eden deneylerde kullanıldı. Serum titrasyonları örnekleri, Şekil 4'te gösterilmiştir. Şekil bir insan serum numunesinin ti gösterirH6N1 ve H6N2 virüslere karşı trated. Her bir veri noktası serum seri seyreltmeleri ile elde edilmiştir NA aktivitesinin yüzde inhibisyonu göstermektedir; H6N1 deneyde ilk serum seyreltisi 1:80 idi; ≥50% inhibisyon ile sonuçlanır en yüksek dilüsyon NC NA / 99 (N1) karşı NI antikor titresi bu örnekte gösterilen serum titresi 640 olduğu H6N2 deneyde serum birinci seyreltme 5. oldu ve WI NA / 05 (N2) karşı 160.
. Şekil 1. ELLA protokolünün şematik bir antijen (virüs) seyreltme (A) belirlenmesi tahlilinde (protokol aşama 2) 'de kullanılacak: virüs seyreltmeleri ile ölçülen bir fetuin kaplı plaka ve NA aktivitesi eklenir protokolün adım 2.3 de tarif edildiği gibi PNA-HRPO bağlanması ile terminal galaktoz artıklarını miktarının; (B Serum NI antikor titreleri (protokol adım 3) g>) belirlenmesi. Örnekler seyreltilir ve daha sonra virüs ilave bir fetuin-kaplı plakaya aktarılır. Plaka O / N PNA-HRPO ekleyerek ve bir renk reaksiyonu oluşturmak için gerekli adımları tamamlamadan önce inkübe edilir. Son olarak, renk reaksiyon durdurulur ve optik yoğunluk ölçülür. NA aktivitesinin en az% 50 inhibisyon ile sonuçlanır dilusyonun karşılıklı% 50 uç nokta titresi olarak bildirilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2 diyagram ELLA plakası ayarlamak gösterir. Serum örneklerinin seri seyreltmeleri bir seyreltme plakası olarak yapılmış ve daha sonra bir fetuin-kaplı plakaya aktarılır. 3fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
H6N1 ve H6N2 virüsü titrasyonları Şekil 3. Örnek. H6N1 BR / 07 seri seyreltileri (A NA / Brisbane / / 2007 (H1N1) 59 mavi sembollerle gösterilmiştir) ile H6N2 UR / 07 (NA A / Uruguay / 716 / kırmızı sembollerin gösterilen 2007 (H3N2)) 18 fetuin kaplı plakalarda sıcak ve tarif edildiği gibi belirlenmiştir PNA-HRPO ile reaktivite için kuluçkalanmıştır. Ortalama 2 kuyu OD 490nm virüsü seyreltinin tersine karşılık karşısına yerleştirilmiştir. ELLA kullanım için seçilen H6N1 seyreltme 1:80 ve bu dilüsyonlar maksimum optik yoğunluk yaklaşık% 90 ile sonuçlanmıştır ve lineer aralığında olduğu için seçilen H6N2 seyreltme 1:40 idi.3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
N1 NA (kırmızı semboller) ve N2 karşı serum (mavi semboller) alt tipleri Şekil 4. Titrasyon. NA engelleme titreleri reassortant virüslere karşı ölçüldü H6N1 NC / 99 (içerdiği A NA / Yeni Kaledonya / / 1999 20 (H1N1) ) ve H6N2 WI / 05 (içerdiği A NA / Wisconsin / 67/2005 (H3N2)). serum seri seyreltmeleri için yüzde enzim inhibisyon% 50 inhibisyon gösteren kesikli yatay çizgi ile gösterilmiştir. A UA karşı NA inhibisyon titreleri / Yeni Kaledonya / / 1999 20 (H1N1) (NC / 99) ve A / Wisconsin / 67/2005 2 9.3 (640) ve 2 7.3 idi (WI / 05) (H3N2) ( 160), sırasıyla. daha büyük bir ettik görmek için buraya tıklayınızBu rakamın rsion.
| Sorun | Olası neden (ler) | Çözüm |
| Zayıf sinyal veya virüs titrasyon ulaşılan hiçbir yayla | i) düşük NA enzim aktivitesi ii) virüs stok optimum koşullarda saklanmayan | i) seyreltici NA aktivite için en uygun olan pH değerine sahip olduğunu teyit; pH değeri en uygunudur ise, yeni bir virüs stoku hazırlamak veya virüs konsantre ii) regrow ve kısım stok; -80 ° C depolamadan önce kuru buz üzerinde ek-freeze küçük şişeler |
| pozitif hücre kontrol kuyuları Zayıf ya da hiç renk | i) Virüs seyreltme yanlış atanmış Dondurulmuş virüsü alikotları ii) Flakon-to-vial değişkenliği iii) PNA- HRPO denatüre ya da çok fazla seyreltildi iv) OPD yanlış hazırlanan | ben); Tekrarlama virüs titrasyonu ii) değişkenlik olmadığından emin olmak için aynı partiden birkaç şişeleri titre edilir. önemli değişkenlik varsa, taze alikotları hazırlamak iii) PNA- HRPO retitrate optimum virüsü hazırlanan çözeltisi iv) OPD taze hazırlanması tekrarlayın |
| Pozitif kontrol serumları ile zayıf veya hiç engelleme | Deneyde kullanılan I) 'in çok fazla virüs ii) Serum kötüleşti | i) tekrar virüs titrasyon ii) yeni antiserumlar Kontrol saklama koşulları elde |
| Negatif kontrol serumları ile Engellenmesi | Serum i) yetersiz ısı işlemi Deneyde kullanılan ii) çok az virüsü | i) serum ısı inaktivasyonu tekrar ii) tekrarlayın virüs titrasyonu |
| yüksek arka plan | plakaların i) Olası bulaşma ii) PNA- HRPO konsantrasyonu çok çok yüksek / düşük | i) yeni kaplanmış plakalar kullanılarak tekrar ii) kullanmak için doğru seyreltme belirlemek için PNA-HRPO titre |
| Virüs titrasyonu düşük sulandırmalarda NA aktivitesinin belirgin inhibisyon göstermektedir | i) alantoik akışkan NA için alt-tabaka içerebilir | Bir sakroz yastığı yoluyla topak haline edilmiştir ii) Kullanım virüsü |
Performans kriterlerine uymayan tahlillerin Tablo 1. Kök neden analizi. Bu tablo, Ella gerçekleştirirken oluşabilecek sorunlar için olası nedenleri ve çözümler sunmaktadır.
Discussion
enzim bağlı lektin deney serumunda NI antikor titreleri ölçmek için pratik bir yöntem. ELLA 1990 tarafından Lambre ve diğ., Tanımlanmış olsa da, standart serolojik test olarak kabul edilmesi klinik örneklerde 12-16 NI antikor titreleri ölçmek için tahlil yapmak sayıda laboratuarlar, daha yakın zamanda olmuştur. Bazı değişiklikler ölçülür NI titerleri için büyük bir etkisi olmadan protokol safhaları yapılabilir. Örneğin, PBS seyreltici olarak kullanılabilir, ancak önerilen tampon maddesi içinde, virüs titrasyon eğrileri (MES, pH 6.5) ve karşılaştırmak için çok yararlıdır, PBS bir karar verilmeden önce, bazı NA alt türleri önemli ölçüde enzim aktivitesi azalmış gibi pH değeri> 7.0. Optimal pH kullanılmadığında, virüsün maksimum sinyal tahlilinde antijen (yani, virüs) aşırı bir miktarının kullanımı ile sonuçlanan, daha az olduğu; Bu koşullar altında, deney düşük bir duyarlılık gösterebilir.
bazı hayırmuamele edilmemiş sera Ella test edilir, n-spesifik inhibisyonu gözlenir. Bu termal olarak β-önleyicileri varlığını gösteren, ısı (45 dakika boyunca 56 ° C) ile ayrıldı. Diğer spesifik olmayan önleyicileri (α ve γ-sınıfı) grip HA özellikle H3N2 virüsü hemaglütinasyon ve enfektivitesini ile ilgili olarak, tarif edilmiştir. H3N2 virüs NA kaynağı olarak kullanılmaktadır Gerçekte, spesifik olmayan inhibisyonunun Ella görülmektedir; Bu inhibisyon sıyalıdaz 9, küçük bir miktarı ile, serum numunelerinin işlenmesi suretiyle uzaklaştırılır.
Diğer serolojik deneylerde olduğu gibi, negatif ve pozitif kontroller deney performansını değerlendirmek için bir araç sağlamak için her bir deneyde dahil edilmelidir. Tahlil kabul kriterlerini yerine getirmediğini zaman neden tespit edilmelidir. Tablo 1 sorunları gidermek için ele alınabilecek deneyde potansiyel adımların bir listesini sağlar.
Ella protokol provBu raporda aryans NA kaynağı olarak, bir kuş gribi virüsünün HA köken ihtiva reassortant virüsleri kullanır. Bu bir izin düşük patojenik kuş virüslerinin ile çalışmak için gerekli olduğundan tahlil yapmadan bir sınırlama sunar. Onlar inaktive edildikten sonra H6Nx reassortant virüsler laboratuarlar arasında paylaşılabilir. Bu nedenle reassortant virüsü üreten laboratuvar inaktivasyonu tam olduğunu göstermiştir kez tahlil işbirlikleri yoluyla yapılabilir ve hazırlık onun NA aktivitesini korumuştur. H6Nx reassortant virüs kullanılarak kısıtlama NA bulaşıcı olmayan kaynaklar kullanılarak aşılabilir. Diğer virüs benzeri partiküller (VLP'ler) 15 kullanılmış Örneğin, Bazı laboratuarlar, yeniden birleştirici NA 17 arıtılmış kullanılmıştır. Ancak, rekombinant NA ne VLP'ler ne hazır ve bu nedenle bir antijenik-uyumsuz kuş HA ile grip virüsleri kullanmaya devam.
GelenekselNI, antikor titrelerini ölçecek bir yöntem çeşitli nedenlerden dolayı pratik değildir; En endişe renk reaksiyonu üretmek için gerekli olan zararlı kimyasallar bulunmaktadır. Buna ek olarak, numunenin büyük hacimleri gerekli ve tahlil gerçekleştirmek için hantal vardır. Bunun aksine, ELLA kolay uygulanabilir ve örneklerin arasında makul sayıda titrasyonunu sağlayan bir biçimde yer almaktadır. Ella değişkenlik göstermek olduğunu tahlil verimleri tekrarlanabilir sonuçlar 7,8 incelenen çalışmalardan elde edilen veriler. Ella dolayısıyla mümkün NI antikor titreleri rutin ölçümünü yaptı, ve o serolojik çalışmalar yürüten laboratuarlar tarafından daha sık kullanılan olacağı tahmin edilmektedir.
Ella yaparken dikkat edilmesi gereken birkaç önemli adım vardır. İlk olarak, UA aktivitesinin spesifik olmayan önleyicileri çıkarılmalıdır. Bu inhibitörler genellikle, ısıya ve 45 dakika boyunca 56 ° C'de ısı işlemi ile yok edilir. Isıl işlem dışı speci temizlemek için yeterlidirH6 reassortant virüs NA kaynağı olarak kullanıldığı zaman H3N2 virüsleri Ella kullanıldığında FIC örneklerinden inhibitörleri, ancak, hemaglutinin bağlanan serum faktörler de ELLA müdahale ve sıyalıdaz küçük bir miktarı ile muamele ile çıkarılmalıdır tedavi 9 ısıtmak için önce. Bu tahlilin duyarlılığı azaltır İkinci olarak, antijen, örneğin, yeniden düzenlenmiş H6Nx virüs aşırı miktarda, kullanılmamalıdır. Virüsün dikkatli titrasyon nedenle önemli bir adımdır; Her bir deneyde kullanılan antijen miktarı de arka plan üzerinde olan bir sinyal sağlaması gerekir, ve titrasyon eğrisinin, yani lineer aralığında olmalıdır sinyali (optik yoğunluk) virüsü seyreltme ile orantılı olması gerekir.
Rutin seroloji ek olarak, Ella mevsimsel grip virüslerinin UA arasındaki antijenik farklılıkları değerlendirmek için kullanılabilir. içerme a virüs suşları seçerken bu bilgiler çok yararlı olabilirs aşı adayları ve NA antijenik sürüklenme sonucu bağışıklık baskıların daha büyük bir anlayış kolaylaştıracaktır. Buna ek olarak, domuz ya da kuş gribi virüslerinden UA antijenik analizi ortaya çıkan suşlarının pandemik potansiyeli belirlenmesinde kritik bilgiler verebilir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coating buffer | KPL | 50-84-01 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| 5x MES, pH 6.5 | KD-Medical | PBS-0134 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| 30% BSA | Sigma | A8327 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Lectin PNA-HRPO | Sigma | L7759 | |
| PBS-T | Sigma | P3563-10PAK | |
| o-Phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
| Phosphate-citrate buffer | Sigma | P4922 | |
| Sulfuric acid | Sigma | 258105 | |
| 96-well Maxisorp plates | NUNC | 439454 | |
| 96-well round bottom well plates | NUNC | 267245 | |
| Plate sealers | Thermo Scientific | 14-245-192B | |
| Chicken eggs | Charles River Laboratories | 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) chicken eggs | |
| Multichannel pipette | Variety of suppliers e.g., Rainin, Eppendorf | 8 or 12 channel manual pipette 50-250 µl volume | |
| Pipette tips | Depends on pipettor brand | Depends on pipettor brand | |
| Plate reader, with 490 nm filter | Perkin Elmer | Victor V | |
| Water bath set to 37 °C | Variety of suppliers | Variety of models | |
| Water bath set to 56 °C | Variety of suppliers | Variety of models | |
| Refrigerator set to 4 °C | Variety of suppliers | Variety of models | |
| Incubator set to 37 °C | Variety of suppliers | Variety of models |
References
- Kilbourne, E. D., Laver, W. G., Schulman, J. L., Webster, R. G. Antiviral activity of antiserum specific for an influenza virus neuraminidase. J Virol. 2 (4), 281-288 (1968).
- Compans, R. W., Dimmock, N. J., Meier-Ewert, H. Effect of antibody to neuraminidase on the maturation and hemagglutinating activity of an influenza A2 virus. J Virol. 4 (4), 528-534 (1969).
- Schulman, J. L., Khakpour, M., Kilbourne, E. D. Protective effects of specific immunity to viral neuraminidase on influenza virus infection of mice. J Virol. 2 (8), 778-786 (1968).
- Murphy, B. R., Kasel, J. A., Chanock, R. M. Association of serum anti-neuraminidase antibody with resistance to influenza in man. N Engl J Med. 286 (25), 1329-1332 (1972).
- Sandbulte, M. R., Gao, J., Straight, T. M., Eichelberger, M. C. A miniaturized assay for influenza neuraminidase-inhibiting antibodies utilizing reverse genetics-derived antigens. Influenza Other Respi Viruses. 3 (5), 233-240 (2009).
- Lambre, C. R., Terzidis, H., Greffard, A., Webster, R. G. Measurement of anti-influenza neuraminidase antibody using a peroxidase-linked lectin and microtitre plates coated with natural substrates. J Immunol Methods. 135 (1-2), 49-57 (1990).
- Couzens, L., et al. An optimized enzyme-linked lectin assay to measure influenza A virus neuraminidase inhibition antibody titers in human sera. J Virol Methods. 210C, 7-14 (2014).
- Eichelberger, M. C., et al. Comparability of neuraminidase inhibition antibody titers measured by enzyme-linked lectin assay (ELLA) for the analysis of influenza vaccine immunogenicity. Vaccine. 34 (4), 458-465 (2016).
- Westgeest, K. B., et al. Optimization of an enzyme-linked lectin assay suitable for rapid antigenic characterization of the neuraminidase of human influenza A(H3N2) viruses. J Virol Methods. 217, 55-63 (2015).
- Hoffmann, E., Neumann, G., Kawaoka, Y., Hobom, G., Webster, R. G. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 6108-6113 (2000).
- WHO. Manual of Animal Influenza Diagnosis and Surveillance. , (2002).
- Cate, T. R., et al. A high dosage influenza vaccine induced significantly more neuraminidase antibody than standard vaccine among elderly subjects. Vaccine. 28 (9), 2076-2079 (2010).
- Couch, R. B., et al. Antibody correlates and predictors of immunity to naturally occurring influenza in humans and the importance of antibody to the neuraminidase. J Infect Dis. 207 (6), 974-981 (2013).
- Fritz, R., et al. Neuraminidase-Inhibiting Antibody Response to H5N1 Virus Vaccination in Chronically Ill and Immunocompromised Patients. Open Forum Infect Dis. 1 (2), (2014).
- Fries, L. F., Smith, G. E., Glenn, G. M. A recombinant viruslike particle influenza A (H7N9) vaccine. N Engl J Med. 369 (26), 2564-2566 (2013).
- Monto, A. S., et al. Antibody to Influenza Virus Neuraminidase: An Independent Correlate of Protection. J Infect Dis. 212 (8), 1191-1199 (2015).
- Fritz, R., et al. A vero cell-derived whole-virus H5N1 vaccine effectively induces neuraminidase-inhibiting antibodies. J Infect Dis. 205 (1), 28-34 (2012).
