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Immunology and Infection

Mesure de la grippe neuraminidase Inhibition Titres d'anticorps par-enzymatique lectine Assay

Published: September 6, 2016 doi: 10.3791/54573
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Viral Products, CBER, Food and Drug Administration

Abstract

Les anticorps dirigés contre la neuraminidase (NA), la seconde protéine de surface la plus abondante sur le virus de la grippe, contribuer à la protection contre la grippe. Les méthodes traditionnelles de mesure de NA inhibant (NI) des titres d'anticorps ne sont pas pratiques pour la sérologie de routine. Ce protocole décrit la lectine de dosage lié à une enzyme (ELLA), une méthode pratique pour mesurer les titres NI qui est effectué dans des plaques à 96 puits revêtues d'un substrat de grande glycoprotéine, la fétuine. clive NA acides terminaux sialique de fétuine, exposant le sucre avant-dernier, galactose. Agglutinine d'arachide (PNA) est une lectine ayant une spécificité pour le galactose, et donc l'étendue de désialylation peut être quantifié en utilisant un conjugué de peroxydase de raifort PNA, suivi par l'addition d'un substrat chromogène de la peroxydase. La densité optique mesurée est proportionnelle à l'activité de NA. Pour mesurer NI des titres d'anticorps, des dilutions en série de sérums sont incubées à 37 ° CO / N sur des plaques de fétuine-enduit avec un montant fixe of NA. L'inverse de la dilution sérique la plus élevée qui se traduit par ≥50% d'inhibition de l'activité NA est désigné comme un titre d'anticorps NI. Le ELLA fournit un format pratique pour l'évaluation de routine des réponses d'anticorps humains suite à une infection de la grippe ou la vaccination.

Introduction

Neuraminidase (NA) est une glycoprotéine exprimée sur la surface de virions de la grippe. Son activité enzymatique est essentielle pour la libération de particules virales nouvellement formées des cellules infectées 1,2. Des anticorps qui inhibent l' activité NA réduire les titres viraux et des symptômes de la maladie dans des modèles animaux et 3 sont en corrélation avec la résistance contre une maladie chez l'être humain 4. Une augmentation de l'inhibition NA (NI) des titres après la vaccination peut donc servir d'indicateur de l'efficacité du vaccin, mais de nombreuses études d'immunogénicité de la grippe passé ne comprennent pas ce point final, car le dosage traditionnel pour mesurer NI taux d'anticorps est impraticable pour la sérologie de routine.

La méthode traditionnelle pour mesurer les titres NI est basée sur la quantification de la quantité d'acide sialique qui est clivé à partir de glycoconjugués par NA 1. Cette méthode, souvent appelée la méthode acide thiobarbiturique (TBA), utilise des produits chimiques dangereux pour convertir ac sialiqueIdentifiant à un chromophore qui peut être quantifiée par spectrométrie. L'essai ne convient pas pour tester un grand nombre d'échantillons, car des tubes en verre individuels sont utilisés, ce qui rend le dosage encombrant. Miniaturisation de l'essai à un plaques à 96 puits fournit un format plus pratique 5, cependant cet essai nécessite encore l'utilisation de produits chimiques toxiques et par conséquent ne sont pas idéales.

Un test alternatif pour mesurer NI taux d'anticorps a été développé par Lambré et al. 6. Ce dosage quantifie l'activité enzymatique en mesurant la quantité de sucre avant-dernier glycoprotéines, le galactose, qui est exposée lorsque l'acide sialique est libéré par NA. Etant donné que l'arachide agglutinine (PNA) se lie spécifiquement au galactose, une peroxydase de raifort PNA-(HRPO) peut être utilisé pour obtenir une lecture colorimétrique. La densité optique mesurée est donc proportionnelle à l'activité NA dans l'échantillon. Les titres NI sont mesurés en déterminant la plus haute dilutionde sérum qui inhibe au moins 50% de l'activité de NA. Cette lectine dosage lié à une enzyme (ELLA) est réalisée dans des plaques à 96 puits revêtues de fétuine, une protéine de sérum fortement glycosylée, comme substrat pour NA.

Une considération importante pour des dosages qui mesurent les titres NI, est la source de NA. En effet, des sérums d'individus infectés ou vaccinés contiennent des anticorps anti-hémagglutinine (HA), ainsi que des anticorps à NA. Des anticorps qui se lient à HA peuvent interférer avec l'activité de NA et, par conséquent, pour éviter une inhibition non spécifique par des anticorps spécifiques de HA, NA purifié ou d'un virus contenant un ensemble HA antigéniquement mésapparié doit être utilisé dans l'essai. Ces virus peuvent être générés par réassortiment classique ou par génétique inverse; l'objectif est de récupérer un virus qui contient un sous-type HA qui ne soit pas lié à la souche cible, et NA du virus qui est en cours d'étude. Le test décrit dans cet article utilise des virus grippaux A qui sont générés par revErse génétique pour contenir HA du sous - type H6 et la NA ciblée contre les virus de la grippe A, sous - types H1N1 et H3N2 5.

Les résultats générés par ELLA et des essais de TBA miniaturisés montrent ces méthodes sont comparables, avec une spécificité de sous - type similaire et de sensibilité 7. ELLA ne nécessite pas l'utilisation de produits chimiques dangereux et est donc la méthode préférée pour mesurer les titres NI. Il est facile à réaliser, avec seulement quelques étapes (figure 1): Les échantillons sont dilués et transférés dans une plaque de fétuine revêtu auquel le virus (la source de NA) est ajouté. La plaque est incubée O / N et lavé avant d'ajouter PNA-HRPO. Après une incubation de 2 heures, la plaque est lavée et le substrat de la peroxydase est ajoutée; la réaction colorée est arrêtée et, enfin, la densité optique est mesurée et l'inverse de la dilution de l'échantillon qui a donné lieu à au moins 50% d'inhibition de l'activité NA est rapportée comme le titre à point final de 50%. Une étude intra-laboratoire pour évaluer reproducibility de l'ELLA, a montré que la variabilité plaque à la plaque est minime et la répétabilité opérateur à opérateur a donné lieu à aucune différence de plus de 2 fois à titre 7. Une étude inter-laboratoire ultérieur de ELLA variabilité a montré que le test a une bonne reproductibilité lorsqu'il est effectué dans des laboratoires différents et que l' inclusion d'une norme peut réduire davantage la variabilité des résultats 8. Le ELLA est adapté à la mesure des titres d'anticorps NI dans les panneaux de sérum provenant d' études précliniques et cliniques vaccins contre la grippe et 7 peut également être utilisé pour évaluer les différences antigéniques entre les agences nationales de virus grippaux 9.

Protocol

Tous les virus réassortis vivants avec des composants aviaires doivent être traitées à l'aide du niveau de biosécurité 2 (NSB2) pratiques -Amélioration dans un laboratoire agréé pour une utilisation par le United States Department of Agriculture (USDA) et le comité de biosécurité institutionnelle.

1. Préparation des réactifs et matériaux de départ

Remarque: Se référer à la table des matières pour obtenir la source de tous les réactifs.

  1. Assiettes Fetuin revêtu
    1. Préparer un tampon de revêtement en mélangeant 10 ml de 10 x tampon de revêtement avec 90 ml H 2 O déminéralisée
    2. Préparer une solution mère de fétuine à 25 mg / ml dans un tampon de revêtement 1x et stocker dans 500 aliquotes à -20 ° C.
    3. Préparer une solution de travail de fétuine (25 pg / ml) immédiatement avant des plaques de revêtement en diluant la solution mère de 1000 fois dans le tampon 1x revêtement.
    4. Utiliser une pipette multicanaux pour distribuer 100 pl de la solution de travail de fétuine dans all puits d'une plaque de 96 puits qui a la capacité de liaison de protéine élevée.
    5. Couvrir chaque plaque avec un scellant pour plaques puis empiler les plaques en groupes de 10 et les envelopper dans du papier.
    6. Placer les plaques dans un réfrigérateur (2-8 ° C) pendant au moins 18 heures avant d'effectuer un essai.
      Nota: Les plaques peuvent être revêtues à l'avance et stockés avec la solution d'enrobage à 2-8 ° C pendant jusqu'à 2 mois.
  2. diluants
    1. Pour préparer le diluant afin de rendre le virus et l' échantillon de dilutions (2- (N - morpholino) éthanesulfonique (MES), pH 6,5, 20 mM de CaCl2, 1% d' albumine de sérum bovin (BSA) et 0,5% de Tween 20), mélanger 94,2 ml 1X MES, pH 6,5 avec 2 ml de CaCl2 (10 mg / ml), 3,3 ml de 30% de BSA et 0,5 ml de Tween 20.
    2. Pour préparer le diluant pour PNA-HRPO (MES, pH 6,5 avec 20 mM de CaCl2 et 1% de BSA), mélanger 94,7 ml 1x MES, pH 6,5 avec 2 ml de CaCl2 (10 mg / ml) et 3,3 ml de 30% de BSA .
  3. Neuraminidase (NA)
    Note: H6Nx virus REASSortants (ceux - ci ont des HA H6 sous - type et la NA d'intérêt), sont générés suivant des méthodes publiées 5,10. Demander flacons de virus inactivé réassorti d'un collaborateur si elles ne sont pas disponibles en interne. Lors de l'utilisation de virus inactivés, confirmer que la préparation est adapté à une utilisation dans le ELLA par la démonstration que le processus d'inactivation n'a pas eu d'impact significatif sur l'activité NA.
    1. Culture d' un stock de virus H6Nx dans des œufs de poule embryonnés 11 et stocker aliquotes de 0,5 ml de liquide allantoïdien pur à -80 ° C.
    2. Utilisez une nouvelle aliquote de virus pour chaque essai. Ne pas congeler et décongeler les aliquotes.
  4. Des échantillons de sérum et contrôles
    1. Heat-inactiver tous les sérums (échantillons d'essai , par exemple, les sérums pré et post-vaccination, ainsi que des contrôles, par exemple, l' échantillon avec connue titre NI) dans un bain d'eau à 56 ° C pendant 45-60 min. Stocker les sérums à -20 ° C et -70 ° C avant ou après le traitement thermique. Si le samples sont à tester à plusieurs reprises, faire plusieurs aliquotes avant la congélation afin que l'échantillon ne soit pas répétée congelé et décongelé.
    2. Utilisez le ELLA pour mesurer les titres NI de sérums humains qui sont disponibles en quantité suffisante (> 5 ml) d'identifier au moins un avec un faible titre et un autre avec un titre élevé. Stocker 100 aliquotes comme ≤-20 ° C, de sorte que le même échantillon peut être utilisé en tant que témoin dans de nombreux essais pour suivre la performance du test.
  5. Peanut agglutinine (PNA) -Horseradish peroxydase (HRPO)
    1. Préparer le diluant PNA-HRPO (MES, pH 6,5 avec CaCl 2 et 1% de BSA).
    2. Préparer une solution mère PNA-HRPO en dissolvant 1 mg de PNA-HRPO dans 1 ml de diluant. Rangez 20-200 aliquotes à -20 ° C.
    3. Avant d'utiliser un nouveau lot PNA-HRPO, essai 1: 500, 1: 750, 1: 1000 et 1: 2000 dilutions de ce réactif pour identifier le montant qui résulte de la DO maximale avec le contrôle positif (virus uniquement) et un fond ( aucun virus) tchapeau est <10% du signal positif.
      1. Faire des dilutions de virus quadruple comme décrit dans la section 2.1.
      2. Transférer les dilutions à une plaque de fétuine revêtu comme décrit dans la section 2.2 et incuber la plaque à 37 ° C.
      3. Laver la plaque 16-18 heures plus tard et ajouter 1: 500, 1: 750, 1: 1000 et 1: 2000 dilutions de PNA-HRPO (100 pl / puits) pour dupliquer les lignes de la plaque.
      4. Remplissez le dosage comme décrit dans les étapes 2.3.4 à 2.3.9.
      5. Examiner les données pour sélectionner la dilution qui a abouti à un signal maximal est> 10 fois l'arrière-plan.
    4. Immédiatement avant utilisation, préparer la dilution optimale du PNA-HRPO identifiés dans 1.5.3.
  6. Préparer un grand volume de tampon de lavage (0,01 M de tampon phosphate salin (PBS), pH 7,4, 0,05% de Tween 20 (PBS-T)). Stocker à température ambiante.
  7. Préparer le substrat de la peroxydase (o-phénylènediamine (OPD)): Nota: Les substrats de peroxydase alternatifs tels que le 3,3 ', 5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB), peut être utilisé
    1. Préparer un tampon phosphate-citrate en dissolvant 1 capsule dans 100 ml de dH2Û le jour du dosage.
    2. Dissoudre 1 comprimé d'OPD (10 mg) dans 20 ml de tampon phosphate-citrate immédiatement avant utilisation.
  8. Préparer la solution d'arrêt (1 NH 2 SO 4): ajouter 27,2 ml Stock 98% H 2 SO 4 à dH 2 O. 973 Mélanger puis stocker à température ambiante.

2. Détermination de la quantité de NA à utiliser dans ELLA

  1. Préparer Dilutions de virus dans une plaque à 96 puits
    1. Distribuer 120 ul échantillon de diluant (section 1.2) dans les colonnes 1-11 de la plaque de dilution.
    2. Pour la colonne 1, ajouter un 96 pi de diluant pour échantillon supplémentaire.
    3. Décongeler puis vortex le flacon de virus avant d'ajouter 24 ul de puits en double dans la colonne 1. Cela donne une dilution 1:10 de virus.
    4. Faire des dilutions en série de 2 fois de virus dans le diluant pour échantillons, en transférant120 ul d'un puits à l'aide de prochaines pointes de pipette propres pour chaque dilution.
  2. Transfert Dilutions de virus à une plaque de Fetuin revêtu
    1. Laver les 3 fois Fetuin revêtu de la plaque avec du PBS-T (section 1.6) et puis épongez chaque plaque sur du papier absorbant pour éliminer tout tampon de lavage en excès.
    2. Ajouter 50 ul de diluant d'échantillon (section 1.2.1) à chaque puits dans les colonnes 1 à 11 de la plaque de fétuine-enduit.
    3. Ajouter 100 ul de diluant d'échantillon à la colonne 12 (ces puits sont le contrôle négatif).
    4. Transfert 50 ul de virus dilué de colonnes 1-11 de la plaque de dilution dans les puits correspondants de la plaque de fétuine-enduit.
    5. Couvrir la plaque avec un scellant de plaque, puis le placer dans un incubateur humidifié à 37 ° C.
    6. Prenez note de l'heure à laquelle les étapes restantes seront effectuées (16-18 heures plus tard).
  3. Remplissez la détermination NA
    1. Lorsque l'incubation est terminée (16-18 h), transférer leplaque sur le banc et retirer le joint de la plaque.
    2. Laver la plaque 6 fois avec du PBS-T (section 1.7), puis inverser et tapotement sur du papier absorbant pour assurer que tout le liquide a été retiré des puits.
    3. Ajouter ul / puits solution 100 PNA-HRPO (à la dilution déterminée 1.5.3) à tous les puits et incuber la plaque pendant 2 heures à la température ambiante.
    4. Moins de 15 minutes avant l'incubation est à la fin, préparer la solution OPD comme décrit dans la section 1.7.
    5. Laver les plaques d'essai 3 fois pour éliminer le PNA-HRPO et sécher avant d'ajouter 100 ul du substrat OPD à chaque puits.
    6. Incuber la plaque pendant exactement 10 minutes à température ambiante.
    7. Arrêter la réaction en ajoutant 100 pl / puits d'acide sulfurique 1N.
    8. Utilisez un lecteur de plaque pour mesurer la densité optique (DO) à 490 nm pour 0,1 sec.
    9. Enregistrer et exporter tous les fichiers de données.
  4. Sélectionnez Dilution Virus qui sera utilisé pour la sérologie
    1. Dessinez un graphique qui trace OD 490nm exemple, la région linéaire de la courbe).
    2. Choisir la dilution de virus qui donne environ 90% du signal maximal et se situe dans la plage linéaire. Assurez-vous que la DO à la dilution choisie est au moins 10 fois plus grand que le signal de fond. Utilisez la dilution du virus sélectionné pour tous les tests qui utilisent ce stock de virus particulier.
      Remarque: Vous pouvez également mesurer l'activité NA du virus et utiliser ~ 15-20 uU NA activité / ml dans le ELLA.

3.-enzymatique lectine Assay

Remarque: Figure 2 shoWs la configuration des plaques de dilution et de dosage.

  1. Faire des dilutions exemples
    1. Placer les échantillons inactivés à la chaleur sur la glace.
      Note: 8 sérums peuvent être dilués dans chaque plaque.
    2. Pour une mise en place en utilisant des dilutions à partir de 01h10 à travers la plaque, ajouter 120 pi de diluant pour échantillon dans tous les puits dans les colonnes 3-11.
    3. À la colonne 2, ajouter 216 ul de diluant d'échantillon et 24 ul de chaque échantillon. Mélanger l'échantillon dans le puits par pipetage de haut en bas 3 fois, puis transférer 120 pi à la colonne suivante.
    4. Après avoir changé les embouts de pipette, mélanger le contenu du puits par pipetage de haut en bas, puis transférer 120 pi à la colonne suivante.
    5. Répétez l'étape 3.1.4 jusqu'à ce que l'échantillon a été transféré à la colonne 11, et les 120 ul restants mis au rebut.
  2. Ajouter des échantillons et Virus à la plaque de Fetuin revêtu
    1. Décongeler une fiole de virus, vortex et resuspendre le virus dans le diluant (section 1.2) à la dilution qui a été sélectionné à l'étape 2.4.2. Préparer au moins 5 ml de virus pour chaque plaque test. Maintenir le virus dilué sur de la glace jusqu'à ce que les plaques sont lavées et des échantillons de sérum ont été ajoutés à la plaque.
    2. Décider du nombre de plaques de fétuine revêtues qui sont nécessaires pour le dosage (appliquer généralement 4 sérums par plaque). Laver les 3 fois Fetuin revêtu de la plaque avec du PBS-T, puis inverser chaque plaque et épongez sur du papier absorbant pour éliminer le tampon de lavage en excès.
    3. Utiliser une pipette multicanaux pour transférer 50 pi de chaque contrôle de sérum ou de dilution de l'échantillon à partir de la plaque de dilution dans les puits en double dans les colonnes 2-11.
    4. Ajouter 50 ul de virus dilué dans tous les puits sauf pour le contrôle négatif (colonne 12).
    5. Ajouter 50 ul de diluant d'échantillon aux puits dans la colonne 1 et ajouter 100 ul de diluant d'échantillon à la colonne 12.
    6. Couvrir les puits avec un scellant pour plaques et puis mélanger en tapotant doucement côtés de la plaque ou la mise sur un agitateur de plaque à vitesse modérée pendant 10 sec.
    7. Placer la plaque dans un Humidifincubateur ied à 37 ° C pendant 16-18 h.
  3. Ajouter PNA-HRPO et compléter le dosage comme décrit dans la section 2.3

Analyse 4. Données

  1. Déterminer la validité des résultats de dosage
    1. Vérifiez que les valeurs de fond (pas de virus) sont inférieures à 10% du contrôle positif (virus et pas de sérum).
    2. Vérifiez que les titres des sérums témoins run dans différents essais en utilisant les mêmes conditions sont à 2 fois le titre médian.
    3. Confirmer que les mesures de DO des puits de contrôle sont compatibles (≤20% différent) et que les mesures de DO des puits d'échantillons en double sont compatibles (≤10% différent).
    4. Déterminer la cause des résultats non valides et répéter le dosage si les critères énumérés au point 4.1.1, 4.1.2 ou 4.1.3, ne sont pas remplies. Tenez compte des facteurs présentés dans le tableau 1 en essayant de résoudre les problèmes.
  2. Attribuer un titre à point final 50%
    1. Pour chaque plaque d'essai, subtract l'arrière-plan moyen (pas d'antigène ajouté aux puits) à partir de toutes les lectures.
    2. Calculer le pour cent d' inhibition à chaque dilution de sérum en utilisant la formule: 100 x (virus OD uniquement de contrôle - OD échantillon de test) / virus OD ne contrôle.
    3. Identifier la plus forte dilution qui a donné lieu à au moins 50% d 'inhibition du signal maximal.
    4. Signaler l'inverse de cette dilution comme titre à point final de 50%.
      Remarque: Si 50% d' inhibition n'a pas été obtenue à la dilution, le titre est inférieur à la première dilution testée, par exemple <10 quand 1:10 est la première dilution testée.
  3. Calculer la concentration inhibitrice 50% (CI 50)
    1. Utilisez quatre régressions logistiques paramètres pour déterminer l'IC 50 titre comme suit: soustraire l'arrière - plan moyen de toutes les lectures et ensuite transférer les résultats à un programme qui effectue une analyse de régression.
    2. Utilisez une régression non linéaire, avec le maximum fixéau virus seul contrôle et le minimum fixé à zéro, pour déterminer la dilution qui correspond à exactement 50% d'inhibition.
    3. Signaler l'inverse de cette dilution comme IC 50 titre.

Representative Results

L'essai présenté dans ce manuscrit est représenté schématiquement sur ​​la figure 1. La figure 2 montre le même agencement 96 de la plaque, et indique que des dilutions en série des échantillons de sérum sont préparées dans une plaque de dilution avant de les transférer à la plaque de fétuine-enduit. Un paramètre critique de l'essai est la quantité de neuraminidase, qui est utilisé dans l'essai; ceci est déterminé par titrage du virus réassorti. Des exemples de H6N1 et H6N2 titrages de virus sont présentés dans la figure 3. 1:10, 1:20 et 1:40 dilutions de H6N1, la densité optique était similaire, ce qui indique que les conditions étaient telles qu'une valeur maximale a été obtenue. A une dilution de 1:80, la température lue était d'environ 90% du maximum, et par conséquent, cette dilution du virus a été utilisé dans des essais ultérieurs. Des exemples de titrages de sérum sont présentés sur la figure 4. La figure montre un échantillon de sérum humain , qui a été titré contre H6N1 et les virus H6N2. Chaque point de donnée représente le pour cent d'inhibition de l'activité de NA qui a été réalisée par des dilutions successives de sérum; la première dilution du sérum dans le dosage était H6N1 1:80; la première dilution du sérum dans le dosage était H6N2 5. Etant donné que la dilution la plus élevée qui se traduit par ≥50% d'inhibition est le titre d'anticorps NI, le titre du sérum indiqué dans cet exemple est de 640 contre le NA NC / 99 (N1) et 160 contre le NA de WI / 05 (N2).

Figure 1
. Figure 1. Un schéma du protocole ELLA (A) Détermination de la dilution d'antigène (virus) à utiliser dans l'essai (étape 2 du protocole): Des dilutions de virus sont ajoutés à une plaque et l'activité NA fétuine revêtue mesurée par quantifier les résidus de galactose terminaux par liaison du PNA-HRPO comme décrit à l'étape 2.3 du protocole; (B g>) Détermination des titres d'anticorps sériques NI (étape 3 du protocole). Les échantillons sont dilués et ensuite transférés à une plaque revêtue fétuine où le virus est ajouté. La plaque est incubée O / N avant d'ajouter PNA-HRPO et en complétant les étapes nécessaires pour générer une réaction colorée. Enfin, la réaction colorée est arrêtée et la densité optique est mesurée. L'inverse de la dilution de l' échantillon qui se traduit par au moins 50% d' inhibition de l' activité NA est rapporté que le titre à point final de 50%. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Schéma de montrer la plaque ELLA mis en place. Des dilutions en série d'échantillons de sérum sont effectués dans une plaque de dilution et ensuite transférés à une plaque revêtue de la fétuine. 3fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Exemples de H6N1 et H6N2 titrages de virus. Des dilutions en série de H6N1 BR / 07 (NA d'A / Brisbane / 59/2007 (H1N1) indiqué dans les symboles bleus) et H6N2 UR / 07 (NA de A / Uruguay / 716 / 2007 (H3N2) montré en symboles rouges) ont été incubées pendant 18 heures dans des plaques de fétuine revêtues et la réactivité avec PNA-HRPO déterminée comme décrit. Moyenne DO 490 nm de 2 puits est tracée en fonction de l'inverse de la dilution du virus. La dilution de H6N1 sélectionné pour être utilisé dans la ELLA était 1:80 et la dilution de 1:40 H6N2 a été choisi parce que ces dilutions ont donné lieu à environ 90% de la densité optique maximale et se situaient dans la plage linéaire.3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Titration de sérum contre NA de N1 (symboles rouges) et N2 (symboles bleus) sous - types. NA titres d'inhibition ont été mesurés contre les virus réassortis H6N1 NC / 99 (contient le NA de A / Nouvelle-Calédonie / 20/1999 (H1N1) ) et H6N2 WI / 05 (contient le NA d'A / Wisconsin / 67/2005 (H3N2)). Pour cent inhibition enzymatique pour des dilutions en série de sérum est représentée avec la ligne horizontale en pointillés indiquant 50% d'inhibition. L'inhibition des titres NA contre l'AN de A / Nouvelle-Calédonie / 20/1999 (H1N1) (NC / 99) et A / Wisconsin / 67/2005 (H3N2) (WI / 05) étaient 2 9.3 (640) et 2 7.3 ( 160), respectivement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.

Problème Causes possibles) Solution
Signal faible ou pas de plateau atteint dans le titrage du virus i) l'activité enzymatique faible NA
ii) stock de virus ne sont pas stockées dans des conditions optimales 		i) confirme que le diluant a un pH qui est optimal pour l'activité de NA; si le pH est optimal, préparer un nouveau stock de virus ou de concentré virus
ii) Regrow et aliquote stocks; flacons snap-gel sur la glace sèche avant de les ranger à -80 ° C
couleur faible ou pas dans les puits témoins de cellules positives i) Virus dilution incorrectement affecté
ii) Vial-à-flacon variabilité aliquotes de virus congelés
iii) PNA- HRPO dénaturé ou trop dilué
iv) préparée de manière incorrecte OPD 		je); Répétition titrage du virus
ii) Titrer plusieurs flacons du même lot pour assurer qu'il n'y a pas de variabilité. Si la variabilité importante, préparer des aliquotes fraîches
iii) une utilisation optimale de dilution de virus à retitrate PNA- HRPO
iv) Répéter l'opération avec la préparation fraîche de OPD
inhibition faible ou pas par les sérums de contrôle positif i) Trop de virus utilisé dans l'essai
ii) Sérum détérioré 		i) titration Repeat virus
ii) Obtenir de nouveaux antisérums Vérifiez les conditions de stockage
Inhibition par des sérums de contrôle négatif i) L'insuffisance de traitement thermique de sérum
ii) Trop peu de virus utilisé dans l'essai 		i) Répéter la chaleur inactivation du sérum
ii) titration Repeat virus
haut de fond i) la contamination possible des plaques
ii) concentration PNA- HRPO trop élevé / trop faible 		i) Répéter en utilisant des plaques fraîchement enduites
ii) Titrer PNA-HRPO pour identifier dilution correcte à utiliser
Virus titration montre l'inhibition apparente de l'activité NA à basses dilutions i) peut contenir du liquide allantoïdien substrat pour NA ii) l'utilisation du virus qui a été granulée à travers un coussin de saccharose

Tableau 1. L'analyse des causes de tests qui ne répondent pas aux critères de performance. Ce tableau présente les causes et les solutions possibles pour les problèmes qui peuvent survenir lors de l'exécution du ELLA.

Discussion

Le dosage de la lectine-enzymatique est une méthode pratique pour mesurer NI des titres d'anticorps dans le sérum. Bien que ELLA a été décrit par Lambre et al., En 1990, son acceptation comme un test sérologique standard est plus récente, avec de nombreux laboratoires qui effectuent le test pour mesurer les titres d'anticorps NI d'échantillons cliniques 12-16. Certaines modifications peuvent être apportées aux étapes du protocole sans un impact important sur les titres NI qui sont mesurés. Par exemple, le PBS peut être utilisé comme diluant, cependant, il est très utile de comparer les courbes de titrage du virus dans le tampon recommandé (MES, pH 6,5) et du PBS avant qu'une décision soit prise, puisque certains sous-types de NA ont réduit de manière significative l'activité enzymatique à pH> 7,0. Lorsque le pH optimal est pas utilisé, le signal maximum du virus peut être réduit, ce qui entraîne l'utilisation d'une quantité excessive de l' antigène ( par exemple, virus) dans le dosage; dans ces conditions, l'essai peut avoir une sensibilité réduite.

Certains nel'inhibition spécifique de n est observée lorsque les sérums non traités sont testés dans le ELLA. Ceci est enlevé par traitement thermique (56 ° C pendant 45 min), ce qui indique la présence d'inhibiteurs de ß-thermolabiles. D'autres inhibiteurs non-spécifiques (α et γ-classe) de la grippe HA ont été décrits, notamment en relation avec le virus H3N2 hémagglutination et l'infectiosité. En effet, une inhibition non spécifique est également observée dans ELLA lorsque H3N2 sont utilisés comme source de NA; cette inhibition est éliminé par traitement des échantillons de sérum avec une petite quantité de 9 sialidase.

Comme pour d'autres tests sérologiques, des témoins négatifs et positifs doivent être inclus dans chaque essai pour fournir un moyen pour évaluer la performance de l'essai. Lorsque le test n'a pas respecté les critères d'acceptation, la raison doit être identifiée. Le tableau 1 donne une liste des étapes potentielles dans le dosage qui peuvent être traitées pour résoudre les problèmes.

Le prov protocole ELLAided dans le présent rapport utilise des virus réassortis qui contiennent le HA provenant d'un virus aviaire, comme source de NA. Ceci présente une limitation à la réalisation du test parce qu'un permis est nécessaire de travailler avec les virus aviaires faiblement pathogènes. virus réassortis H6Nx peuvent être partagés entre les laboratoires après qu'ils ont été inactivés. Par conséquent, le dosage peut être effectué grâce à des collaborations une fois le laboratoire de la génération du virus réassorti a démontré que l'inactivation est complète et la préparation a conservé son activité de NA. La contrainte d'utiliser H6Nx virus réassortis peuvent être surmontés en utilisant des sources non infectieuses de NA. Par exemple, certains laboratoires ont utilisé recombinant purifié NA 17, tandis que d' autres ont utilisé des particules virales (VLP) 15. Cependant, ni recombinant NA ni VLP sont facilement disponibles et donc nous continuons à utiliser des virus de la grippe aviaire avec un HA antigéniquement dépareillés.

Le traditionnelméthode pour mesurer les titres d'anticorps NI est pas pratique pour plusieurs raisons; les plus préoccupants sont les produits chimiques nocifs qui sont nécessaires pour produire une réaction colorée. En outre, de grands volumes d'échantillon sont nécessaires et le dosage est lourde à effectuer. En revanche, le ELLA est facile à réaliser et est dans un format qui permet de titrage d'un nombre suffisant d'échantillons. Les données des études qui ont examiné la variabilité ELLA montrent que les résultats , les rendements d'essai reproductibles 7,8. Le ELLA a donc rendu la mesure de routine des titres possibles d'anticorps NI, et il est prévu qu'il sera utilisé plus fréquemment par les laboratoires effectuant des études sérologiques.

Il y a plusieurs étapes critiques qui doivent être pris en considération lors de l'exécution du ELLA. Tout d'abord, des inhibiteurs non spécifiques de l'activité NA doivent être enlevés. Ces inhibiteurs sont généralement thermolabile et sont détruites par un traitement thermique à 56 ° C pendant 45 min. Le traitement thermique est suffisante pour éliminer non spécifiquefic inhibiteurs à partir d'échantillons où les virus réassortis H6 sont utilisés comme source de NA, cependant, lorsque H3N2 sont utilisés dans le ELLA, des facteurs sériques qui se lient à l'hémagglutinine interfèrent également avec l'ELLA et doivent être éliminés par traitement avec une petite quantité de sialidase avant le traitement thermique 9. D' autre part, une quantité excessive d'antigène, à savoir, un virus réassorti H6Nx, ne devrait pas être utilisé , car cela réduit la sensibilité du dosage. titration soigneuse du virus est donc une étape essentielle; la quantité d'antigène utilisée dans chaque essai doit fournir un signal qui est bien au- dessus du fond, et il doit se situer dans la plage linéaire de la courbe de titrage, soit le signal (densité optique) doit être proportionnelle à la dilution de virus.

En plus de la sérologie de routine, l'ELLA peut être utilisé pour évaluer les différences antigéniques entre NAs de virus de la grippe saisonnière. Cette information peut être très utile lors de la sélection des souches de virus pour l'inclusion d'unes candidats vaccins et facilitera une meilleure compréhension des pressions immunitaires qui se traduisent par une dérive antigénique de NA. En outre, l'analyse antigénique des NAs de virus de la grippe porcine ou aviaire peut fournir des informations cruciales pour déterminer le potentiel pandémique de souches émergentes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coating buffer  KPL 50-84-01
 fetuin Sigma F3385
5x MES, pH 6.5  KD-Medical PBS-0134
CaCl2 Sigma C7902
30% BSA Sigma A8327
Tween 20 Sigma P1379
Lectin PNA-HRPO Sigma  L7759
PBS-T Sigma P3563-10PAK
o-Phenylenediamine dihydrochloride Sigma P8287
Phosphate-citrate buffer Sigma P4922
Sulfuric acid Sigma 258105
96-well  Maxisorp plates NUNC 439454
96-well round bottom well plates NUNC 267245
Plate sealers Thermo Scientific  14-245-192B
Chicken eggs Charles River Laboratories 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) chicken eggs
Multichannel pipette Variety of suppliers e.g., Rainin, Eppendorf 8 or 12 channel manual pipette 50-250 µl volume
Pipette tips Depends on pipettor brand Depends on pipettor brand
Plate reader, with 490 nm filter Perkin Elmer Victor V
Water bath set to 37 °C Variety of suppliers  Variety of models
Water bath set to 56 °C Variety of suppliers  Variety of models
Refrigerator set to 4 °C Variety of suppliers  Variety of models
Incubator set to 37 °C Variety of suppliers  Variety of models

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References

  1. Kilbourne, E. D., Laver, W. G., Schulman, J. L., Webster, R. G. Antiviral activity of antiserum specific for an influenza virus neuraminidase. J Virol. 2 (4), 281-288 (1968).
  2. Compans, R. W., Dimmock, N. J., Meier-Ewert, H. Effect of antibody to neuraminidase on the maturation and hemagglutinating activity of an influenza A2 virus. J Virol. 4 (4), 528-534 (1969).
  3. Schulman, J. L., Khakpour, M., Kilbourne, E. D. Protective effects of specific immunity to viral neuraminidase on influenza virus infection of mice. J Virol. 2 (8), 778-786 (1968).
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  5. Sandbulte, M. R., Gao, J., Straight, T. M., Eichelberger, M. C. A miniaturized assay for influenza neuraminidase-inhibiting antibodies utilizing reverse genetics-derived antigens. Influenza Other Respi Viruses. 3 (5), 233-240 (2009).
  6. Lambre, C. R., Terzidis, H., Greffard, A., Webster, R. G. Measurement of anti-influenza neuraminidase antibody using a peroxidase-linked lectin and microtitre plates coated with natural substrates. J Immunol Methods. 135 (1-2), 49-57 (1990).
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  17. Fritz, R., et al. A vero cell-derived whole-virus H5N1 vaccine effectively induces neuraminidase-inhibiting antibodies. J Infect Dis. 205 (1), 28-34 (2012).

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Immunologie numéro 115 la grippe le vaccin la sérologie la neuraminidase anticorps inhibition
Mesure de la grippe neuraminidase Inhibition Titres d&#39;anticorps par-enzymatique lectine Assay
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Gao, J., Couzens, L., Eichelberger, M. C. Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay. J. Vis. Exp. (115), e54573, doi:10.3791/54573 (2016).

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