Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Экспресс-анализ циркадных фенотипы в Arabidopsis протопластов трансфицируют Люминесцентные Clock Reporter

doi: 10.3791/54586 Published: September 17, 2016

Summary

Циркадные часы регулирует около трети транскриптома Arabidopsis, но процент генов, которые питаются обратно в хронометраже остается неизвестным. Здесь мы представляем метод быстрой оценки циркадных фенотипы в любой мутантной линии Arabidopsis с использованием люминесцентного визуализации циркадного репортера скоротечно, выраженной в протопласты.

Introduction

Большинство живых организмов обладают эндогенной хронометристу для помощи эффективного переговорного процесса ежедневных изменений в окружающей среде. Это хронометрист, циркадные часы, регулирует многие аспекты метаболизма и физиологии организма предвидеть предсказуемые изменения во внешней среде. В растениях, например, ожидание во времени предсказуемых патогена или травоядных атак сильно снижает общую восприимчивость 1 - 4. Крахмал метаболизм жестко регулируется циркадных часов, чтобы гарантировать , что запасы крахмала в прошлом до рассвета ли выращивали при длинных или коротких условиях 5 -й день. Действительно, растения с циркадных часов , соответствующих 24 часа в сутки окружающей среды показывают повышенные темпы роста, темпы фиксации углерода и показатели выживаемости по сравнению с растениями , работающих под управлением часы ложноспаренной периода 6. Обширное влияние циркадных ритмов во всех этих процессах возникает в значительной степени от ритмической регуляции до третиот общего транскриптома в Arabidopsis 7. Эти ритмические генные продукты участвуют в широком диапазоне клеточных процессов , включая метаболических путей, сигнализации гормонов, а также реакции на стресс 7. Кроме того, прямое циркадный регуляция функции белка устанавливается циркадный регуляции фосфорилирования 8 и , скорее всего , других посттрансляционных модификаций (PTMs).

В центре циркадных часов , который приводит этот ежедневный транскрипционный перепрограммирование лежит сеть транскрипционных / поступательной петли обратной связи (TTFLs), включая утренние экспрессируется генов циркадных часов , СВЯЗАННЫЕ 1 (CCA1) и позднюю УДЛИНЕННЫЕ гипокотиля (LHY) , которые подавляют экспрессию в вечерние гены СРОКАХ САВ 1 (МТЗ 1), Gigantea (GI) и членов вечернего комплекса (ЕС), LUX ARRHYTHMO (LUX), ранним цветением 3 (ELF3) и ELF4 9 - 11. Вместе остроумиеч Регулятора -genes ПСЕВДО RESPONSE (PRR3, 5, 7 и 9), МТЗ 1 репрессирует экспрессию CCA1 / LHY в то время как ЕС выступает в качестве положительного регулятора 12 - 14. В дополнение к механизмам обратной связи, пост-транскрипционных и пост-трансляционной регулирование TTFL сетевых компонентов играет важную роль в настройке циркадных ритмов. На сегодняшний день наиболее распространенным PTM идентифицированы на циркадные белки часы фосфорилирование 15. Фосфорилирования CCA1 по казеинкиназой 2 (СК2) влияет на его связывание с целевой промоутеров 16 и имеет важное значение для температурной компенсации циркадных часов 17. ПРР белки фосфорилируются дифференцированно по циркадного цикла и фосфорилирования МТЗ 1 влияет на взаимодействие с отрицательным регулятором, вечером-фазированной часы компонент ZEITLUPE (ЗТЛ) 18. Эти примеры иллюстрируют, как PTMs и белок-белковых взаимодействий настраивать сеть TTFL в 24-чтранскрипционный осциллятора. Для более детального введения в транскрипционный сети тактовой частоты и ее регулирования, отличные недавние обзоры доступны (например , ссылка 15).

Тем не менее, то, что остается менее ясно, в какой степени ритмично регулируемые процессы и другие аспекты клеточного метаболизма обратной связи в сам механизм хронометража. Обширный скрининг мутантов Arabidopsis тактовых дефектов может получить дальнейшее понимание того, какие механизмы или сигнальные пути могут быть вовлечены в поколение 24 ч ритмов от сети TTFL. С этой целью, Ким и Сомерс ранее опубликовал метод прорывной для эффективного и быстрого анализа функции часов в любой Arabidopsis строке 19. На основе использования транзиторной экспрессии в протопласты, эта методика превосходит потребность в стабильных трансгенных линий или пересекает с люминесцентными линиями часов маркер. Здесь мы представляем Высокопродуктивное протопластов isolatioп метод 20 в сочетании с оптимизированным протоколом для скрининга циркадные дефектов люминесцентными визуализации скоротечно выраженных маркеров тактового импульса в 96-луночный планшет - ридере.

Мы сравним дикого типа сталкивающихся 0 Arabidopsis хорошо охарактеризованных мутантов часы , чтобы подтвердить методику , описанную здесь успешно обнаруживает измененные циркадные ритмы. Протопласты , полученные из этих линий трансфицированных репортерной конструкцией, выражающего светлячка люциферазы из циркадного CCA1 промотора; CCA1pro: LUC 19. Люциферазы катализирует многоэтапную реакцию , в которой люциферин превращается в электронно - возбужденным оксилюциферин , который излучает свет 21, который визуализируется с течением времени для оценки периода, амплитуды и фазы транскрипционных ритмов в этих протопластов.

Протокол состоит из трех основных частей; изолируя протопластов, трансфекция протопластов с репортерной плазмидой, и люминесцентного имстарения. Эти три части должны быть выполнены в один день, используя свежеприготовленные буферы и реагенты. рост и очистка достаточного количества репортерной плазмиды растений следует проводить заранее и не визуализируются в этом протоколе.

Protocol

Примечание: В этом протоколе, реагенты и объемы, описанные выражаются в Arabidopsis линии, которая испытывается, а также приведет к шести дублирующих скважин для данного генотипа. Умножить материалы с количеством строк, которые будут проанализированы при анализе более одной строки. В видео дикого типа Arabidopsis будет по сравнению с циркадных часов мутантной линии ЗТЛ (хотя представительные результаты дополнительных линий будут предоставлены впоследствии).

Фермент раствор
целлюлазы 0,5% (вес / объем)
Пектиназа R10 0,25% (вес / объем)
D-маннит 400 мМ
CaCl 2 10 мМ
KCl 20 мМ
Бычьим сывороточным альбумином 0,1% (вес / объем)
MES, рН 5,7 20 мМ
решение W5
NaCl 150 мМ
CaCl 2 125 мМ
KCl 5 мМ
MES, рН 5,7 2 мМ
глюкоза 5 мМ
решение ММГ
MES, рН 5,7 4 мМ
D-маннит 400 мМ
MgCl 2 15 мМ
раствор ПЭГ
PEG4000 40% (вес / объем)
D-маннит 200 мМ
CaCl 2 100 мМ
решение визуализации
решение W5 до конечного объема
Фетальная бычья сыворотка 5% (об / об)
Люциферин 1,2 мМ
ампициллин 50 мг / мл

Таблица 1: Список решений.

1. Подготовка материалов и буферами

  1. материалы завода
    1. Хранить Arabidopsis Col -0 семена в воде в 1,5 мл пробирку при 4 ° С в темноте в течение четырех дней. Пипетировать семена в почву в горшке и переносят в длинных дневных условиях (16 ч света 8 ч темноты) при температуре 21 ° С в течение 7 дней. Оставьте крышку на горшок в течение первых трех дней, чтобы обеспечить высокую влажность. Пересадка шесть саженцев на новый 8 см х 13 см х 5 см горшков и продолжают расти растения в тех же условиях для Анофэр 21 дней. Убедитесь, что почва влажная повсюду.
  2. Репортер Плазмида
    1. Очищают CCA1pro: репортер плазмиды LUC 19 из бактериальной культуры заранее, используя набор для выделения ДНК в соответствии с инструкциями изготовителя.
      Примечание: требуется 20 мкг репортерной плазмидой (10 мкл в 2 мкг / мкл в дН 2 O) для трансфекции.
  3. Решения
    Примечание: Для этого протокола необходимы пять решений: ферментного раствора, раствор промывочный раствор 5 (W5), маннитол-магниевый (ММГ), раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ), и решение для отображения (таблица 1). Подготовка перед продолжением к стадии выделения протопластов.
    1. Приготовьте 10 мл раствора фермента согласно таблице 1, добавление ферментов в последний раз , и фильтр стерилизуют раствор через 0,22 мкм шприц - фильтр.
    2. Подготовьте остальные решения в следующих объемах: 15 мл раствора W5, 10 мл MMG sспособность по 1 мл раствора ПЭГ и раствор изображения 1,5 мл в соответствии с таблицей 1.
      Примечание: Это не важно, что раствор ПЭГ готовят не менее чем за час до трансфекции, чтобы гарантировать, что ПЭГ полностью растворяется. Фильтр стерилизовать раствор изображения через шприцевой фильтр 0,22 мкм.

Рисунок 1

Рисунок 1:. Протопластов изоляция Листья взрослых растений Arabidopsis (А) закреплены на автоклавной ленты с нижнего слоя эпидермиса лицевой стороной вверх (B). (С) Magic Tape осторожно прижимают к нижней эпидермальный слой с наконечником 15 мл коническую трубку. (D) Волшебная лента удаляется , чтобы выставить клетки мезофилла (E). (F) Полоски автоклава ленты с отпускомs присоединенные всплывают на раствора фермента, содержащего целлюлазы и пектиназы, выпустив протопластов в раствор. (G) Лист скелеты остаются на автоклава ленты после ферментативного расщепления и отбрасываются, оставляя протопластов в растворе фермента (H). (I) Итоговые результате мезофильные протопласты (Шкала бар = 50 мкм). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

2. Выделение протопластов

  1. Этикетка чашку Петри и добавляют 10 мл стерилизованным фильтрацией раствора ферментного.
  2. Закрепить четыре полосы автоклава ленты с клейкой стороной на чистой поверхности лабораторной и отметьте размер чашки Петри на полоске.
  3. Обрежьте листья 4-недельных растений (рис 1а) и нажмите верхнюю эпидермис на автоклава ленты (т.е. нижней поверхности эпидермиса лицевой стороной вверх (
  4. Осторожно надавите полоски волшебной ленты на нижней поверхности эпидермиса, используя 15 мл коническую трубку. Будьте осторожны , чтобы не раздавить ткани листьев (рис 1в). Осторожно потяните волшебную ленту с раздеться нижнего эпидермиса (рис 1д) и подвергать клетках мезофилла (рис 1E).
  5. Вырезать автоклава ленту , чтобы соответствовать чашку Петри, используйте пинцет , чтобы переместить ленту в чашку Петри и плавать на раствора фермента (рис 1f), листья лицевой стороной вниз. Поворот на 60 оборотов в минуту на платформе шейкера в течение 60 мин, в течение которых протопласты будет выпущен в раствор.
  6. Используйте пинцет , чтобы удалить и выбросить полоски автоклава ленты (рис 1 г) и пипеткой раствор , содержащий протопласты (рис 1 ч) в 50 мл коническую трубку. Использование широким отверстием пипетки (например, кончик P5000 или P1000 наконечник с концом отрезана).
  7. Центрифуга протопластов при 100-кратномг в течение 3 мин при 4 ° C и удалить супернатант с помощью пипетки. Будьте осторожны, так как осадок очень свободно.
  8. Добавьте 10 мл раствора W5 к протопластов и ресуспендируют, осторожно взбалтывая трубку.
  9. Отдых протопластов на льду в течение 30-60 мин. Во время этого этапа оценки урожайности путем подсчета протопластов в гемоцитометра (рис 1i).
  10. Собрать протопласты центрифугированием при 100 х г в течение 3 мин при 4 ° C и удалить супернатант с помощью пипетки. Будьте осторожны, так как осадок очень свободно.
  11. Ресуспендируют протопласты до концентрации 5 × 10 5 протопластов / мл в растворе ММГ.

3. протопластов Трансфекция

  1. Добавляют 10 мкл репортерной плазмидой (2 мкг / мкл) в 15 мл коническую пробирку.
  2. Добавить 400 мкл протопластов в пробирку.
  3. Добавьте один объем (410 мкл) раствора ПЭГ и взболтайте пробирку осторожно 12 раз трансфекция протопластов.
  4. После 8-15 мин вклubation при комнатной температуре, разбавляя смесь протопластов-ДНК-ПЭГ с четырьмя объемами (1640 мкл) раствора W5 и взболтайте осторожно шесть раз.
  5. Собирают трансфецированных протопластов центрифугированием при 100 х г в течение 2 мин при комнатной температуре и удалить супернатант с помощью пипетки. Опять же, будьте осторожны, так как осадок очень свободно.
  6. Ресуспендируют протопласты в растворе 1,250 мкл визуализации.
  7. Аликвотные 200 мкл на шесть реплицировать в лунки 96-луночного планшета, заполнить все пустые лунки раствором W5, и запечатать пластину с клеевым прозрачной крышкой, пригодной для визуализации люминесцентным.

4. обработки изображений

  1. Перенести пластину в любую установку изображения люминесцентного подходящей для работы с изображениями растений. Изменение клеевые крышки на пластинах 10-15 мин после передачи, чтобы избежать конденсации и давления различия между скважинами, а затем начать визуализацию. Читайте Пластинку каждый ~ 45 мин (3 сек на лунку) в течение пяти дней при комнатной температуре.
    Обратите вниманиечастота пластины считывает и время считывания на лунку могут отличаться в зависимости от настройки изображения.

5. Анализ данных

  1. Анализ результатов свечения с помощью любого программного обеспечения для анализа (например, биоритмов Analysis System Software (Brass) 22). Сравните мутантной линии для контроля дикого типа, чтобы выявить циркадные дефекты.

Representative Results

Протопластов дикого типа Arabidopsis сравнивали с известными мутантами тактовыми cca1 / LHY (короткий период мутант 2), ЗТЛ (длительный период мутант 23), а избыточная экспрессия линии CCA1 -ox (аритмичную 24). Все они были трансфицированы с CCA1pro: репортер LUC и отображается в постоянном свете на планшет - ридере в течение 5 дней.

Здесь мы покажем , что в cca1 / LHY мутанта, свободного хода период циркадного экспрессии гена под контролем сокращается (рис 2а), в соответствии с опубликованной анализируемый период по стабильным трансгенная экспрессия люминесцентного часов маркеров 2,9. Период циркадных колебаний в протопластов ZTL мутанта длиннее , чем у дикого типа (Рисунок 2b), в соответствии с ранее опубликованными результатами рассаду, клеточной суспензии cultuРез и протопласты 19,23,25.

Сверхэкспрессия CCA1 фиксирует часы в утренней фазы и глобальной транскрипции становится аритмические 24. Последовательно, мы не наблюдали колебания в CCA1pro: выражение LUC в CCA1 -ox протопластов (рис 2в).

фигура 2
Рисунок 2: протопласта суточным ритмам протопластов сталкивающихся 0, cca1 / LHY, ЗТЛ и CCA1 -ox транзиторно трансформировали CCA1pro: LUC построить и циркадные ритмы в люминесценции были обследованы в течение 5 дней - С). (D) Циркадианные оценки период на основе люминесценции следов в Col -0, cca1 / LHY и ЗТЛ (A - B). меня± SEM, п = 3-5, Т-тест р-значение , как указано. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

ZTL
Генотип Период (протопласты) Период (трансгенной) Сообщает: Рекомендации
сталкивающихся 0 23,0 ± 0,21 24,4 ± 0,09 pCCA1: LUC в Col -0 (2)
cca1 / LHY 20,6 ± 0,13 19,9 ± 0,11 pCCA1: LUC в Col -0 (2)
~ 18 РНК в L эр фоне (9)
25,1 ± 0,12 27,4 ± 0,5 CAB2: LUC в С24 экотипа (22)
CCA1 -ox аритмичный аритмичный pCCA1: LUC (LD только данные) (2)
аритмичный РНК и белка в Col -0 фоне (23)

Таблица 2: суточным ритмам в протопласты По сравнению с трансгенными проростков Циркадная период pCCA1:. Выражение LUC в протопласты по сравнению с длинами первого периода , заявленными за мутации и, если таковые имеются, с pCCA1: выражение LUC в Col -0.

Discussion

Здесь мы представляем быстрый анализ на экран периода циркадного дефектов в Arabidopsis линиях, в том числе изоляции протопластов, трансфекция и визуализации luminecent. Циркадный период дикого типа Arabidopsis и часы мутанты cca1 / LHY, ЗТЛ и CCA1 -ox рассчитывали из измерений люминесценции из CCA1pro: репортера LUC и обнаружили, что согласуется с литературными данными , полученных из целых растений с использованием более время- потребляющие трансгенные подходы (таблица 2). С помощью этого теста для скрининга мутантов Arabidopsis позволяет избежать первоначального требования для создания трансгенных светящихся линий, что отнимает много времени и, возможно, только показывает, что конкретный мутант проявляет ритмы дикого типа. Явным преимуществом этого протокола является то , что любой Arabidopsis линии могут быть подвергнуты скринингу в короткое время для измененных циркадных ритмов транскрипционных, которые помогут идентифицировать более генов , влияющих на хронометраж в растениях.

26,27. Последующее переваривание требует, по меньшей мере, 3 ч инкубации в темноте, чтобы выпустить протопластов в раствор фермента. При вакуумной инфильтрации не применяется, инкубационный время до 18 часов рекомендуется. В протоколе, представленном здесь, вакуумная инфильтрация является ненужным, поскольку слой эпидермальных клеток непроницаемы для ферментов, удаляется с помощью ленты. При создании протопластов путем разрезания растительного материала необходимо отделить протопласты от клеточной стенки мусора после пищеварения; Обычно это делается путем фильтрации раствора или его очистки на сахар градиента 27,26. Здесь любой непереваренной ткани останется на ленте после автоклавнойпищеварение, поэтому фильтрация и очистка сахара градиент протопластов может быть опущена. Существует вероятность того, что стресс в результате длительных процедур protoplasting влияет на жизнеспособность клеток и циркадных часов. Ленту на основе метода protoplasting 20 визуализируется здесь дает большое количество протопластов; и учитывая жизнеспособность клеток в течение циркадного временных рядов и согласующие длин периодов протопластов и целых проростков (таблица 2), методология , описанная здесь , является предпочтительным по сравнению с альтернативными методами для генерации протопласта.

Стадию трансфекция протокола является важным шагом, который влияет на жизнеспособность протопластов. Раствор ПЭГ позволяет ДНК должны быть доставлены в клетку, и оба времени инкубации в этом растворе (этап 3.4) и процент PEG должен быть определен эмпирически. Стандартная концентрация составляет 20%, при более низких концентрациях, снижающих эффективность трансформации и вышеКонцентрации , снижающие жизнеспособность 28. Инкубационный период короче , как пять минут может дать эффективную трансфекцию протопластов 27.

Протопласты могут быть отображены на любой платформе люминесцентный визуализации. В этом видео мы использовали люминесценция планшет-ридер, оснащенный внешними огнями (красный и синий светодиоды, 630 и 470 нм, соответственно, при комбинированной интенсивности ~ 20 мкЕ), что позволяет для скрининга с высокой пропускной способностью и частых измерений. Другое оборудование формирования изображения, которое обнаруживает люминесценцию, такие как читатели альтернативных пластин или установок, основанных вокруг прибор с зарядовой связью (CCD) камеры, могут быть применены одинаково хорошо до тех пор, как освещение для фотосинтеза. Преимущество использования ПЗС-камеры, установленной на контролируемом шкафу, что свет и температура могут быть запрограммированы. Недостатком является то, тем больше времени захвата, вводя длительные периоды темноты, которые могут вызвать стресс протопластов в дополнение к возмущаютING эндогенный хронометража. Вне зависимости от экспериментальной платформы выбрана, настройка параметров, вероятно, будет необходимо по сравнению с установками для рассады или взрослых растений. По нашему опыту, повышение концентрации репортер плазмиды во время трансфекции и / или люциферин в буфере изображений может разрешить любые неустойчивые или быстро сдерживающее ритмы, которые могут возникнуть в первоначальных экспериментах.

В будущих экспериментов, методология, описанная здесь, может быть применена для изучения циркадных фенотип любого мутанта Arabidopsis линии. С небольшими изменениями, влияние например различных препаратов на хронометража могут быть изучены в этой установке. Кроме того, трансфекция может быть изменен , чтобы включать в себя искусственную микроРНК для гена глушителей 19, дальнейшее расширение универсальности этого протокола. Протоколы для генерации протопласты риса хорошо отлаженных 29 и протокол формирования изображения , представленные здесь в равной степени может быть применен для дальнейшего нашего Understanding тактового сигнала в экономически важных однодольных культурных растений.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride  Merck Millipore 219466
Pectinase R10 Sigma Aldrich P2401
D-mannitol Sigma Aldrich M4125 
CaCl2 Sigma Aldrich C4901
KCl Sigma Aldrich P3911
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A4503
MES Acros Organics 327765000
NaCl Acros Organics 327300010
Glucose Fischer Scientific G/0500/60
MgCl2 Sigma Aldrich M2670
Polyethylene glycol (PEG) 4000 Acros Organics 434630010
Fetal Bovine Serum  Sigma Aldrich F4135
D-Luciferin, Firefly Biosynth AG L-8200 Dissolve luciferin powder in 0.1 M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50 mM
Ampicillin Sigma Aldrich A9618
Comply Steam Indicator Tape 3M 1222
Magic Tape 3M 819-1460
Petri Dishes Scientific Laboratory Supplies SLS2002
Microplate, 96 well, flat bottom, white Greiner Bio-One 655075
TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates Perkin Elmer 6050195
Syringe, 10 ml, w/o needle BD Plastipak 302188
Syringe filter 0.22 µm Merck Millipore SLGP033RS
Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS) Free download at amillar.org
QIAfilter Maxiprep Kit Qiagen 12262
Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell Hawksley AC6000
Bright field microscope Optika Microscopes B-150POL-B
LB942 TriStar2 multimode reader, with luminescence module Berthold Technologies Ltd 57947/57948

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (12), 4674-4677 (2012).
  2. Zhang, C., et al. Crosstalk between the circadian clock and innate immunity in Arabidopsis. PLoS Pathog. 9, (6), 1003370 (2013).
  3. Hevia, M. A., Canessa, P., Müller-Esparza, H., Larrondo, L. F. A circadian oscillator in the fungus Botrytis cinerea regulates virulence when infecting Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, (28), 8744-8749 (2015).
  4. Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock. PLoS One. 6, (10), 26968 (2011).
  5. Graf, A., Schlereth, A., Stitt, M., Smith, A. M. Circadian control of carbohydrate availability for growth in Arabidopsis plants at night. Proc. Natl. Acad. Sci. 107, (20), 9458-9463 (2010).
  6. Dodd, A. N., et al. Plant circadian clocks increase photosynthesis, growth, survival, and competitive advantage. Science. 309, (5734), 630-633 (2005).
  7. Covington, M. F., Maloof, J. N., Straume, M., Kay, S. A., Harmer, S. L. Global transcriptome analysis reveals circadian regulation of key pathways in plant growth and development. Genome Biol. 9, (8), 130 (2008).
  8. Choudhary, M. K., Nomura, Y., Wang, L., Nakagami, H., Somers, D. E. Quantitative Circadian Phosphoproteomic Analysis of Arabidopsis Reveals Extensive Clock Control of Key Components in Physiological, Metabolic, and Signaling Pathways. Mol. Cell. Proteomics. 14, (8), 2243-2260 (2015).
  9. Mizoguchi, T., et al. LHY and CCA1 Are Partially Redundant Genes Required to Maintain Circadian Rhythms in Arabidopsis. Dev. Cell. 2, (5), 629-641 (2002).
  10. Kikis, E. A., Khanna, R., Quail, P. H. ELF4 is a phytochrome-regulated component of a negative-feedback loop involving the central oscillator components CCA1 and LHY. Plant J. 44, (2), 300-313 (2005).
  11. Lu, S. X., et al. CCA1 and ELF3 Interact in the Control of Hypocotyl Length and Flowering Time in Arabidopsis. Plant Physiol. 158, (2), 1079-1088 (2012).
  12. Nakamichi, N., et al. PSEUDO-RESPONSE REGULATORS 9, 7, and 5 are transcriptional repressors in the Arabidopsis circadian clock. Plant Cell. 22, (3), 594-605 (2010).
  13. Dixon, L. E., et al. Temporal repression of core circadian genes is mediated through EARLY FLOWERING 3 in Arabidopsis. Curr. Biol. 21, (2), 120-125 (2011).
  14. Gendron, J. M., et al. Arabidopsis circadian clock protein, TOC1, is a DNA-binding transcription factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (8), 3167-3172 (2012).
  15. Hsu, P. Y., Harmer, S. L. Wheels within wheels: the plant circadian system. Trends Plant Sci. 1, 1-10 (2013).
  16. Daniel, X., Sugano, S., Tobin, E. M. CK2 phosphorylation of CCA1 is necessary for its circadian oscillator function in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, (9), 3292-3297 (2004).
  17. Portolés, S., Más, P. The functional interplay between protein kinase CK2 and CCA1 transcriptional activity is essential for clock temperature compensation in Arabidopsis. PLoS Genet. 6, (11), e1001201 (2010).
  18. Fujiwara, S., et al. Post-translational regulation of the Arabidopsis circadian clock through selective proteolysis and phosphorylation of pseudo-response regulator proteins. J. Biol. Chem. 283, (34), 23073-23083 (2008).
  19. Kim, J., Somers, D. E. Rapid assessment of gene function in the circadian clock using artificial microRNA in Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 154, (2), 611-621 (2010).
  20. Wu, F. -H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant Methods. 5, 16 (2009).
  21. Baldwin, T. O. Firefly luciferase: the structure is known, but the mystery remains. Structure. 4, (3), 223-228 (1996).
  22. Edwards, K. D., et al. Quantitative analysis of regulatory flexibility under changing environmental conditions. Mol. Syst. Biol. 6, (424), 424 (2010).
  23. Somers, D. E., Schultz, T. F., Milnamow, M., Kay, S. A. ZEITLUPE Encodes a Novel Clock-Associated PAS Protein from Arabidopsis. Cell. 101, (3), 319-329 (2000).
  24. Wang, Z. -Y., Tobin, E. M. Constitutive Expression of the CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) Gene Disrupts Circadian Rhythms and Suppresses Its Own Expression. Cell. 93, (7), 1207-1217 (1998).
  25. Kim, W. -Y., Geng, R., Somers, D. E. Circadian phase-specific degradation of the F-box protein ZTL is mediated by the proteasome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, (8), 4933-4938 (2003).
  26. Zhai, Z., Jung, H. -I., Vatamaniuk, O. K. Isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. e15-e17 (2009).
  27. Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2, (7), 1565-1572 (2007).
  28. Damm, B., Schmidt, R., Willmitzer, L. Efficient transformation of Arabidopsis thaliana using direct gene transfer to protoplasts. Mol. Gen. Genet. 217, (1), 6-12 (1989).
  29. Zhang, Y., et al. A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes. Plant Methods. 7, (1), 30 (2011).
Экспресс-анализ циркадных фенотипы в Arabidopsis протопластов трансфицируют Люминесцентные Clock Reporter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hansen, L. L., van Ooijen, G. Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter. J. Vis. Exp. (115), e54586, doi:10.3791/54586 (2016).More

Hansen, L. L., van Ooijen, G. Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter. J. Vis. Exp. (115), e54586, doi:10.3791/54586 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter