Summary
Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor fenotypische en kwantitatieve analyse van de aldaar gevestigde macrofagen van rat nieren door middel van flowcytometrie. De resulterende gekleurde cellen kunnen ook worden gebruikt voor andere toepassingen, zoals celsortering, genexpressie analyse of functionele studies, aldus verkregen in het experimentele modelinformatie verhogen.
Protocol
Dit protocol werd goedgekeurd door de lokale Institutional Animal Care en gebruik commissies naar aanleiding van de Richtlijn 2010/63 / EU van het Europees Parlement en de National Guideline 53/2013.
1. Voorbereiding van de reagentia en oplossingen
- Bereid alle reagentia en oplossingen onder steriele omstandigheden en gebruiken onder een laminaire stroming kap. Een oplossing bij 4 ° C.
- Bereid vlekken buffer (2% foetaal runderserum (FBS) in 1 x Dulbecco's PBS).
- Bereid collagenase door toevoeging van 0,5 mg collagenase elk ml zoutoplossing.
- Bereid anesthesie oplossing van ketamine / xylazine (2: 1 v / v).
2. Nier Perfusie en Extraction
- Verdoven ratten door intraperitoneale injectie van ketamine / xylazine (75 mg / 12 mg / kg gewicht). knijpen voorzichtig een kleine huidplooi, om te controleren of het dier voldoende is verdoofd. Vervolgens bedekken ogen dierenarts zalf tot droog voorkomen terwijl onder verdoving. Let op: 4-month oude Wistar ratten werden gebruikt in deze test.
- Zodra de rat volledig verdoofd, leg het op een chirurgische tafel in een liggende positie.
- Toepassen 70% ethanol aan de buik.
- Maak een centrale incisie door de buikhuid en het buikvlies, van het schaambeen aan de ribbenkast, aan de pleura en de buikholte bloot te leggen.
- Injecteer zoutoplossing (0,9%) in de abdominale aorta nieren via perfusie systeem totdat al het bloed uit de nieren wordt verwijderd perfuseren. Snijd de aorta in de buik niveau te helpen het bloed vrij te geven.
- Verwijder beide nieren van de rat door het snijden van de renale hilus (renale ader, slagader en urineleider). Om de nier decapsulate, drukt u op de rand van de nier met de vingers voorzichtig scheiden van de capsule 11.
- Plaats de nier in Hanks 'gebalanceerde zoutoplossing.
3. Nier Spijsvertering en Cell Suspension
- Snijd de helft van een nier met een schaar in kleine stukjes en zet destukjes in een 1,5 ml buis.
Opmerking: Alle volgende concentraties worden berekend voor 1 monster (nier 1/2 rat). - Voeg 1 ml van de collagenase-oplossing en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Meng door inversie om de 5 minuten om ervoor te zorgen dat de collagenase oplossing toegang tot de hele weefsel.
- Verzamel de oplossing en doorgeven door een zeef (40 um) met behulp van een plunjer en resuspendeer in 10 ml vlekken buffer.
- Centrifugeer bij 400 xg gedurende 15 min.
- Resuspendeer de pellet in 1 ml ACK (ammonium-chloride-Kalium) lysisbuffer. Na 1 min 30 sec bij kamertemperatuur, voeg 10 ml vlekken buffer om de reactie te stoppen.
- Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min.
- Resuspendeer de pellet in een toereikend volume kleuring buffer (1 ml) en filtreer de celsuspensie met behulp van een zeef (30 um).
- Tel het aantal cellen met behulp van trypan blauw exclusie op een hemocytometer en voeg 2 miljoen cellen een 1,5 ml buis staining.
4. cel kleuring en Flowcytometrieanalyse
- Centrifugeer cellen bij 100 xg gedurende 5 minuten.
- Resuspendeer de pellet in 100 ul rattenserum (verdund 1: 100) gedurende 10 min bij 4 ° C aan Fc-receptoren te blokkeren.
- Wassen door toevoeging van 1 ml vlekken buffer en centrifugeer 100 xg gedurende 5 minuten.
- Meng de antilichamen voor celoppervlak kleuring in 100 pl buffer kleuring voor elke conditie: CD45 APC-Cy7 (1: 100), CD163 A647 (4: 100) en oplossingen voor levende cellen (: 1000 3) detecteren.
- Resuspendeer de celpellet in het antilichaam mix gedurende 20 minuten bij 4 ° C in het donker.
- Wassen door toevoeging van 1 ml vlekken buffer en centrifugeer bij 100 xg gedurende 5 minuten. Herhaal deze stap.
- Voeg 600 ul van fixatie / permeabilisatie oplossing gedurende 20 minuten bij 4 ° C in het donker.
- Was 2 maal met 1 ml permeabilisatie / Wash buffer en centrifugeer bij 170 xg gedurende 5 minuten.
- Voeg de CD68 FITC antilichaam (35: 1000) voor Intracellaire kleuring met 100 gl permeabilisatie / Wash buffer voor elke conditie.
- Resuspendeer de pellet in de CD68-antilichaamoplossing en incubeer 50 minuten bij 4 ° C in het donker.
- Wassen met 1 ml permeabilisatie / Wash buffer en centrifugeer bij 170 xg gedurende 5 minuten.
- Resuspendeer de pellet in 100 pl permeabilisatie / Wash buffer, voeg CD86PE antilichaam (35: 1000) en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C in het donker.
- Wassen door toevoeging van 1 ml permeabilisatie / Wash buffer en centrifugeer bij 100 xg gedurende 5 minuten.
- Resuspendeer de pellet in 100 ui van Permeabilisatie / Wash buffer en door te geven aan een flowcytometrie buis.
- Analyseer monsters door middel van flowcytometrie. Bepaal CD45 kleuring in levende cellen gated in-Side verstrooide licht / forward-verstrooid licht (/ FSC SSC) venster. In een tweede stap, analyseren CD86 en CD163 expressie in CD68 + cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We analyseerden macrofaag heterogeniteit in een experimenteel model van inflammatoire nierschade geassocieerd met verhoogde aanwezigheid van infiltrerende macrofagen in de nier. In dit model, werd nierschade geïnduceerd door toediening van aldosteron (1 mg kg -1 -1 dag) plus zout (NaCl 1%) in drinkwater gedurende 3 weken in Wistar ratten, zoals eerder vermeld 12.
Het schema van onze experimenten is weergegeven in figuur 1. Eerst werden niercellen geïsoleerd middels mechanische methoden en na enzymatische digestie met collagenase (Figuur 1A). Daarna werden gelyseerd erytrocyten en renale macrofagen werden gedetecteerd met behulp van flowcytometrie. Cellen werden geïncubeerd met antilichamen voor CD45, CD86 en CD163 membraan voor detectie en CD68 voor intracellulaire kleuring (Figuur 1B). Tenslotte het fenotype van macrofagen populations werd geanalyseerd volgens het schema toonde in figuur 1C.
Nier macrofagen werd geanalyseerd door het selecteren van cellen met dubbele positiviteit voor CD45 en CD68 (Figuur 2A). Met het hierboven beschreven protocol, een toename van CD45 + / CD68 + macrofagen waargenomen in aldosteron-behandelde ratten vergeleken met de controlegroep (0,57 ± 0,16 vs 0,25 ± 0,02,% CD45 + / CD68 + macrofagen per totaal niercellen) ( Figuur 2, zie tabel insert). Cellevensvatbaarheid van CD45 + / CD68 + macrofagen, zoals bepaald met flowcytometrie kleuring met violette kleurstof, was routinematig groter dan 95% (gegevens niet getoond) .Thereafter, CD86 (M1 marker) en CD163 (M2 marker) expressie werd bepaald onder CD45 + / CD68 + cellen. Aldosteron administratie verhoogde de inhoud van CD45 + / CD68 + / CD86 + M1macrofagen (2,87 ± 2,3 vs 1,36 ± 0,68;% CD45 + / CD68 + / CD86 + macrofagen per totale CD45 + / CD68 + cellen) (Figuur 2). Echter, een klein aantal CD45 + / CD68 + / CD163 + M2 macrofagen waargenomen in zowel de aldosteron-behandelde en controlegroepen. Om te analyseren of de lage CD163 expressie werd gerelateerd aan proteolytische verlies tijdens de experimentele protocol, herhaalden we deze procedure, waaronder collagenase digestie met macrofagen van rat peritoneum, zoals eerder beschreven 13. Zoals in figuur 2B, CD45 + / CD68 + peritoneale macrofagen waren positief voor zowel CD86 en CD163, valideren het nut van de geselecteerde antilichamen en bevestigen de doeltreffendheid van onze protocol voor de karakterisering van M1 / M2 macrofagen in rat nier.
Om deze resultaten te valideren,de ontstekingsreactie geassocieerd met nierbeschadiging in de bovengenoemde experimentele modellen onderzocht door immunohistochemie en real-time PCR. Zoals in figuur 3, verhoogde CD68 + macrofagen waargenomen in aldosteron + zout behandelde ratten, vergeleken met controle. Vervolgens werden macrofaag fenotype markers bepaald karakteriseren renale M1 / M2 macrofaag distributie. Verhoogde mRNA expressie van iNOS en IFN-γ (M1 markers) werd waargenomen na aldosteron + zout behandeling, terwijl Arg1 of IL-10 mRNA expressie (M2 macrofaag markers) veranderde niet na aldosteron toediening. Tezamen bevestigen deze resultaten dat aldosteron + toediening zout bemiddelt inflammatoire M1 macrofaag fenotype in vivo.
Figuur 1: Protocol voor niercellen Isolatie en macrofagen Detectie door flowcytometrie. (A) en macrofaag behulp van flow cytometrie (B). Vertegenwoordiger schema van de verschillende macrofaag fenotypes volgens verschillende distributie voor CD45, CD68, CD86 en CD163 markers (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: M1 en M2 macrofaag Markers in nieren van aldosteron behandelde ratten door flowcytometrie Representatieve dot-plots van CD45 kleuring in levende cellen gated in-Side verstrooide licht / forward-verstrooid licht (/ FSC SSC) venster (A, links. ) van de nier schorsingen in de controle en aldosteron +-zout behandelde dieren. De doos in de puntdiagrammen identificeert levende cellenuitdrukken CD45. Cellen in dit vak werden geanalyseerd om CD86 en CD163 expressie in CD68 + cellen te bepalen (A, rechts). Puntdiagram voor peritoneale macrofagen als positieve controle voor de opsporing van CD45, CD68, CD86 en CD163, met toepassing van dezelfde strategie eerder gebruikte. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: ontstekingsreactie na aldosteron + Salt Administration. (A) Representatieve beelden van CD68 kleuring en (B) kwantitatieve analyse van mRNA-niveaus gemeten met RT-PCR voor M1 markers (iNOS en INFy) en M2 merkers (Arg1 en IL-10) controle en aldosteron +-zout behandelde ratten. De gegevens zijn uitdrukkelijkeed als gemiddelde ± SEM. * P <0,05 versus controle. Schaal bar:. 100 um Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Macrofagen heterogene cellen die een belangrijke rol spelen in verschillende ontstekingsziekten, waaronder renale stoornissen. Er is steeds meer belangstelling voor het karakteriseren van macrofagen subsets bij nierziekte omdat elke subpopulatie macrofaag draagt op een andere manier om de ontwikkeling van nierschade, zoals in glomerulonefritis, diabetische nefropathie en nierkanker 14-16. In de vroege stadia van acute nierschade, is een overwicht van M1 macrofagen waargenomen, bevordering tubulaire necrose en ontsteking. In latere stadia een hoger gehalte aan M2 macrofagen waargenomen ontsteking lossen en deelnemen hermodelleren van weefsel. In chronische nierziekte, zowel M1 en M2 macrofagen naast elkaar bestaan tegelijkertijd, hoewel M1 overheersende kunnen zijn, en aldus meer en bestendigen inflammatoire nierschade. Daarom is het belangrijk om onze kennis van de pathofysiologische rol van macrofagen subtypes in nierziekten verhogen. Immunohistochemische studies kan het percentage van de macrofaag subsets niet bepalen in een robuuste manier 17. Daarom is het noodzakelijk om nieuwe technieken te ontwikkelen voor het kwantitatief bepalen van de verschillende fenotypes macrofaag en de rol van deze cellen op renale ontstekingsreactie begrijpen.
Dit manuscript beschrijft een protocol voor het aantal en fenotype van nier macrofagen subsets bepalen flowcytometrie bij ratten. In ons onderzoek werden ratten onderworpen aan een inflammatoire model van nierbeschadiging door toediening van aldosteron. In dit model observeerden we verhoogde CD45 + en C68 + macrofaag infiltratie zoals bepaald met flowcytometrie en bevestigd door immunohistochemie. Bovendien is een verrijking van M1 macrofagen (CD68 + / CD86 +), maar niet M2 macrofagen werden waargenomen in aldosteron-behandelde muizen. Deze resultaten werden verder bevestigd door bepaling van mRNA-expressie van M1 (iNOS en IFN-γ) en M2 macrophleeftijd markers (Arg1 of IL-10). Flowcytometrieanalyse gemeld lage cel sterfte tijdens de isolatie protocol. Er zijn verschillende factoren die cellevensvatbaarheid en oppervlaktemarkers detectie kunnen beïnvloeden, zoals het niveau van weefsel dissociatie en duur en het type weefsel digestie (enzymatisch, mechanisch, etc.). Overmatig spijsvertering verhoogt de cel sterfte en activering van macrofagen en vermindert oppervlakte marker expressie, terwijl het tegenovergestelde effect kan het gevolg zijn van lage nier dissociatie. Echter, toen ons protocol werd uitgevoerd in macrofagen van rat peritoneum is een verhoogde aanwezigheid van CD86 en CD163 werd waargenomen in deze cellen.
Ons protocol is geoptimaliseerd om macrofaag heterogeniteit in nieren van ratten met aldosteron-gemedieerde hypertensie bepalen en daardoor kunnen worden geëxtrapoleerd naar andere inflammatoire nieraandoeningmodellen. Echter, kan deze procedure worden aangepast aan elke experimentele conditie omdat ontsteking wijzigtweefsel integriteit, waardoor de snelheid van weefsel spijsvertering door het collagenase beïnvloeden.
Het is belangrijk te vermelden dat voor de bepaling van de totale macrofagen, werden cellen gefixeerd en gepermeabiliseerd intracellulaire labeling met CD68 antilichaam 18 mogelijk. Het protocol voor bevestiging omvatte het gebruik van formaldehyde die fluorochromen kan beïnvloeden geconjugeerd met primaire antilichamen, vooral fycoerythrine. Om dit probleem op te lossen, incubatie met CD86-PE antilichaam werd uitgevoerd na toevoeging van de Bevestiging / permeabilisatie oplossing en verder CD68-kleuring. Anderzijds is het van belang op te merken dat formaldehyde kan ook interfereren met andere assays die uitgevoerd kunnen worden na isolatie macrofagen, zoals mRNA expressie assays. Echter, er zijn commerciële kits beschikbaar voor mRNA te isoleren uit formaldehyde gefixeerde cellen.
Kortom, dit protocol beschrijft een werkwijze voor de fenotypische karakterisatie van renale macrofagen in een quantitative wijze met flowcytometrie. Kortom, de hier beschreven protocol is gebruiksvriendelijk, reproduceerbare en zinvol om verschillende macrofaag populaties onderscheiden van rattennieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminar flow hood | Faster | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Hettich | Or equivalent equipment | |
| Flow cytometer (FACSAria) | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum | BioWest | S1820-500 | |
| PBS 10x | LONZA | BE17-515Q | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 12/1/9001 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher Scientific | A10492-01 | |
| Flow cytometry strainers | BD Biosciences | 340626 | |
| Falcon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 352340 | |
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352052 | 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube |
| Centrifuge tubes | Corning centristar | 430791 | |
| Water bath | Memmert GmbH + Co. KG | WNE 7 | 37 °C |
| Fixation/Permeabilization Solution or Permeabilization/Wash Buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Rompum (Xylazine) | Bayer | Or equivalent | |
| Ketalar (Ketamine) | Pfizer | Or equivalent | |
| Hanks’ balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H8264-500ML | |
| Saline solution | Braun | 622415 | |
| Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7 | Biolegend | 202216 | Diluted 1:100 |
| Anti-CD68 (clone: ED1) FITC | Bio-RAD | MCA341F | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD86 (clone: 24F) PE | Biolegend | 200307 | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647 | Bio-RAD | MCA342R | Diluted 4:100 |
| Live/dead stain | Molecular Probes | L34955 | Diluted 3:1,000 |
References
- Gansevoort, R. T., et al. Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention. Lancet. 382, 339-352 (2013).
- Kon, V., Linton, M. F., Fazio, S. Atherosclerosis in chronic kidney disease: the role of macrophages. Nat. Rev. Nephrol. 7, 45-54 (2011).
- Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Exp. Nephrol. 128, 21-29 (2014).
- Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26, 1363-1377 (2015).
- Kinsey, G. R. Macrophage dynamics in AKI to CKD progression. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 209-211 (2014).
- Lech, M., et al. Macrophage phenotype controls long-term AKI outcomes--kidney regeneration versus atrophy. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 292-304 (2014).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat. Rev. Immunol. 8, 958-969 (2008).
- Ortiz, A., et al. Translational value of animal models of kidney failure. Eur. J. Pharmacol. 759, 205-220 (2015).
- Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of double negative alphabeta T cells from the. J. Vis. Exp. , (2014).
- Martin-Fernandez, B., et al. Aldosterone Induces Renal Fibrosis and Inflammatory M1-Macrophage Subtype via Mineralocorticoid Receptor in Rats. PLoS. One. 11, e0145946 (2016).
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. J. Vis. Exp. (e52749), (2015).
- Komohara, Y., et al. Macrophage infiltration and its prognostic relevance in clear cell renal cell carcinoma. Cancer Sci. 102, 1424-1431 (2011).
- Han, Y., Ma, F. Y., Tesch, G. H., Manthey, C. L., Nikolic-Paterson, D. J. Role of macrophages in the fibrotic phase of rat crescentic glomerulonephritis. Am. J. Physiol Renal Physiol. 304, F1043-F1053 (2013).
- Ndisang, J. F. Role of the heme oxygenase-adiponectin-atrial natriuretic peptide axis in renal function. Curr. Pharm. Des. 21, 4380-4391 (2015).
- Blackbeard, J., et al. Quantification of the rat spinal microglial response to peripheral nerve injury as revealed by immunohistochemical image analysis and flow cytometry. J. Neurosci. Methods. 164, 207-217 (2007).
- Strobl, H., Scheinecker, C., Csmarits, B., Majdic, O., Knapp, W. Flow cytometric analysis of intracellular CD68 molecule expression in normal and malignant haemopoiesis. Br. J. Haematol. 90, 774-782 (1995).
