Summary
Este manuscrito describe un protocolo detallado para fenotípica y análisis cuantitativo de los macrófagos residentes de riñones de rata por citometría de flujo. Las células teñidas resultantes también se pueden utilizar para otras aplicaciones, incluyendo la clasificación de células, el análisis de la expresión génica o estudios funcionales, aumentando así la información obtenida en el modelo experimental.
Protocol
Este protocolo fue aprobado por las autoridades locales Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comités siguiendo la Directiva 2010/63 / UE del Parlamento Europeo y la Directriz Nacional 53/2013.
1. Preparación de Reactivos y Soluciones
- Preparar todos los reactivos y soluciones en condiciones estériles y utilizar bajo una campana de flujo laminar. Mantener las soluciones a 4 ° C.
- Preparar tampón de tinción (2% de suero bovino fetal (FBS) en PBS de Dulbecco 1x).
- Preparar la solución de colagenasa mediante la adición de 0,5 mg de colagenasa a cada ml de solución salina.
- Preparar la solución de anestesia de ketamina / xilazina (2: 1 v / v).
2. riñón de perfusión y Extracción
- Anestesiar las ratas por inyección intraperitoneal de ketamina / xilazina (75 mg / 12 mg / kg peso). pellizcar con cuidado un pequeño pliegue de la piel, para comprobar si el animal está suficientemente anestesiado. A continuación, cubrir los ojos con ungüento veterinario para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. Nota: 4-month-ratas Wistar se utilizan en este ensayo.
- Una vez que la rata está totalmente anestesiado, colocarlo sobre una mesa de operaciones en posición supina.
- Aplicar 70% de etanol en el abdomen.
- Haga una incisión central a través de la piel abdominal y el peritoneo, desde el pubis hasta la caja torácica, para exponer las cavidades pleurales y abdominales.
- Inyectar solución salina (0,9%) en la aorta abdominal para perfundir los riñones utilizando un sistema de perfusión hasta que se elimina toda la sangre de los riñones. Cortar la aorta a nivel abdominal para ayudar a liberar la sangre.
- Retire ambos riñones de las ratas mediante la reducción del hilio renal (vena renal, arteria y uréter). Para decapsulate el riñón, presione el borde del riñón usando los dedos, separando con cuidado la cápsula 11.
- Coloque el riñón en la solución salina equilibrada de Hanks.
La digestión 3. Riñón y suspensión celular
- Cortar la mitad de un riñón con tijeras en trozos pequeños y poner elpedazos en un tubo de 1,5 ml.
Nota: Todas las siguientes concentraciones se calculan para la muestra 1 (1/2 de riñón de rata). - Añadir 1 ml de la solución de colagenasa y se incuba a 37 ° C durante 30 min. Mezclar por inversión cada 5 min para asegurarse de que la solución de colagenasa accede a todo el tejido.
- Recoger la solución y pasarla a través de un colador (40 micras) con la ayuda de un émbolo, y volver a suspender en 10 ml de tampón de tinción.
- Centrifugar a 400 xg durante 15 min.
- Vuelva a suspender el sedimento en 1 ml ACK (amonio-cloruro y potasio) buffer de lisis. Después de 1 minuto 30 segundos a temperatura ambiente, se añaden 10 ml de tampón de tinción para detener la reacción.
- Centrifugar a 400 xg durante 10 min.
- Vuelva a suspender el sedimento en un volumen adecuado de tampón (1 ml) y la tinción y filtrar la suspensión celular utilizando un colador (30 micras).
- Contar el número de células por medio de exclusión de azul de tripano en un hemocitómetro y añadir 2 millones de células a un tubo de 1,5 ml para stanando.
4. Análisis de tinción celular y citometría de flujo
- centrifugar las células a 100 xg durante 5 min.
- Vuelva a suspender el precipitado en 100 l de suero de rata (diluido 1: 100) durante 10 min a 4 ° C para bloquear los receptores Fc.
- Lavar mediante la adición de 1 ml de tampón de tinción y centrifugar 100 xg durante 5 min.
- Mezclar los anticuerpos para la tinción de la superficie celular en 100 l de tampón de tinción para cada condición: CD45 APC-Cy7 (1: 100), CD163 A647 (4: 100) y una solución para detectar células vivas (3: 1000).
- Vuelva a suspender el sedimento celular en la mezcla de anticuerpos durante 20 min a 4 ° C en la oscuridad.
- Lavar mediante la adición de 1 ml de tampón de tinción y se centrifuga a 100 xg durante 5 min. Repita este paso.
- Añadir 600 l de solución / permeabilización de fijación durante 20 min a 4 ° C en la oscuridad.
- Lavar 2 veces con 1 ml de tampón de permeabilización / lavado y centrifugar a 170 xg durante 5 min.
- Añadir el anticuerpo CD68 FITC (35: 1000) para la Intracellular tinción de 100 l de tampón de permeabilización / lavado para cada condición.
- Vuelva a suspender el sedimento en la solución de anticuerpos CD68-e incubar 50 min a 4 ° C en la oscuridad.
- Lavar con 1 ml de tampón de permeabilización / lavado y centrifugar a 170 xg durante 5 min.
- Vuelva a suspender el precipitado en 100 l de tampón de permeabilización / lavado, añadir anticuerpos CD86PE (35: 1000) y se incuba durante 20 min a 4 ° C en la oscuridad.
- Lavar mediante la adición de 1 ml de permeabilización / tampón de lavado y centrifugar a 100 g durante 5 min.
- Vuelva a suspender el precipitado en 100 l de tampón de permeabilización / Lavar y pasarlo a un tubo de citometría de flujo.
- Analizar las muestras por citometría de flujo. Determinar la tinción de CD45 en células vivas cerrados a la luz la luz dispersada lateral / dispersa hacia adelante (/ FSC, SSC) ventana. En un segundo paso, analizar CD86 y la expresión de CD163 en células CD68 +.
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Representative Results
Se analizó la heterogeneidad de los macrófagos en un modelo experimental de lesión inflamatoria renal asociada a la mayor presencia de la infiltración de macrófagos en el riñón. En este modelo, el daño renal fue inducida por la administración de la aldosterona (1 mg kg -1 -1 día) más de sal (NaCl 1%) en agua de bebida durante 3 semanas en ratas Wistar, como se informó anteriormente 12.
El horario de nuestros experimentos se muestra en la Figura 1. En primer lugar, se aislaron células de riñón utilizando métodos mecánicos y más digestión enzimática con colagenasa (Figura 1A). A partir de entonces, los eritrocitos se lisaron y macrófagos renales se detectaron mediante el uso de citometría de flujo. Las células se incubaron con anticuerpos para CD45, CD86 y CD163 para la detección de la membrana y CD68 para la tinción intracelular (Figura 1B). Por último, el fenotipo del macrófago populations se analizó de acuerdo con el esquema mostrado en la Figura 1C.
El contenido de macrófagos renal se analizó mediante la selección de las células con doble positividad para CD45 y CD68 (Figura 2A). Utilizando el protocolo descrito anteriormente, un aumento en CD45 + / CD68 + macrófagos se observó en ratas tratadas con aldosterona en comparación con el grupo control (0,57 ± 0,16 vs. 0,25 ± 0,02,% CD45 + / CD68 + macrófagos por células renales total) ( La figura 2, consulte inserción de la mesa). La viabilidad celular de CD45 + / CD68 + macrófagos, tal como se determina por citometría de flujo de tinción con colorante violeta, fue rutinariamente superior al 95% (datos no mostrados) .Thereafter, CD86 (marcador M1) y CD163 (M2 marcador) expresión se evaluó entre la CD45 + / CD68 + células. La administración de aldosterona aumenta el contenido de CD45 + / CD68 + / CD86 + M1macrófagos (2,87 ± 2,3 frente a 1,36 ± 0,68%; CD45 + / CD68 + / CD86 + macrófagos por células CD45 + totales / CD68 +) (Figura 2). Sin embargo, un número bajo de CD45 + / CD68 + se observaron macrófagos / CD163 + M2, tanto en los grupos tratados con aldosterona y de control. Para analizar si la baja expresión de CD163 se relaciona con derramamiento proteolítica durante el protocolo experimental, repetimos este procedimiento, incluyendo la digestión con colagenasa, en macrófagos aislados de peritoneo de la rata, como se ha descrito previamente 13. Como se informó en la Figura 2B, los macrófagos peritoneales CD45 + / CD68 + fueron positivos tanto para CD86 y CD163, validando la utilidad de los anticuerpos seleccionados y confirmando la eficacia de nuestro protocolo para la caracterización de los macrófagos M1 / M2 en el riñón de rata.
Para validar estos resultados,la respuesta inflamatoria asociada con el daño renal en los modelos experimentales anteriores se estudió por inmunohistoquímica y PCR en tiempo real. Como se informó en la Figura 3, el aumento se observaron macrófagos CD68 + en las ratas tratadas con sal de aldosterona +, en comparación con el control. A continuación, se determinaron los marcadores de fenotipo de macrófagos para caracterizar la distribución renal macrófagos M1 / M2. No se observó aumento de la expresión del ARNm de la iNOS e IFN-γ (marcadores M1) después del tratamiento con aldosterona + sal, mientras que arg1 o IL-10 expresión de ARNm (marcadores de macrófagos M2) no cambiaron después de la administración de aldosterona. En conjunto, estos resultados confirman que la administración de sal de aldosterona + media la fenotipo de macrófagos M1 inflamatoria in vivo.
Figura 1: Protocolo para Renal celdas de aislamiento y detección de macrófagos por citometría de flujo. (A) y la detección de los macrófagos por citometría de flujo (B). Esquema representativo de los diferentes fenotipos de macrófagos de acuerdo con una distribución diferente para CD45, CD68, CD86 y marcadores CD163 (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: M1 y M2 macrófagos marcadores en los riñones de aldosterona ratas tratadas por citometría de flujo representativos punto-parcelas de tinción de CD45 en células vivas cerradas en el (/ FSC, SSC) ventana (Una luz Luz de posición-dispersos / dispersa hacia adelante, a la izquierda. ) a partir de suspensiones de riñón en el control y la aldosterona + sal animales tratados. La caja dentro de los gráficos de puntos identifica células vivasque expresa CD45. Se analizaron las células incluidas en este cuadro para determinar CD86 y la expresión de CD163 en las células CD68 + (a la derecha). gráfico de puntos para los macrófagos peritoneales como control positivo para la detección de CD45, CD68, CD86 y CD163, aplicando la misma estrategia utilizada anteriormente. Los datos se presentan como media ± SEM (B). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Respuesta Inflamatoria tras la administración de aldosterona + sal. (A) Imágenes representativas de tinción CD68 y (B) análisis cuantitativos de los niveles de mRNA medidos por RT-PCR para los marcadores M1 (iNOS y INFγ) y los marcadores M2 (Arg1 y IL-10) en el control y la aldosterona + ratas tratada con sal. Los datos son expresaed como media ± SEM. * P <0,05 frente al control. Barra de escala:. 100 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los macrófagos son células heterogéneas que juegan un papel importante en diferentes enfermedades inflamatorias, incluyendo trastornos renales. Hay un creciente interés en la caracterización de los macrófagos subconjuntos en la enfermedad renal, ya que cada subpoblación de macrófagos contribuye de una manera diferente a la evolución de la lesión renal, como se informa en la glomerulonefritis, la nefropatía diabética y cáncer renal 14-16. En las primeras etapas de la lesión renal aguda, se observa un predominio de macrófagos M1, la promoción de necrosis tubular y la inflamación. Sin embargo, en las etapas posteriores se observó un mayor contenido de macrófagos M2 para resolver la inflamación y participar en la remodelación tisular. En la enfermedad renal crónica, tanto los macrófagos M2 M1 y coexisten simultáneamente, aunque M1 puede ser predominante, lo que aumenta el daño renal y perpetuar inflamatoria. Por lo tanto, es importante aumentar nuestro conocimiento del papel fisiopatológico de los subtipos de macrófagos en la enfermedad renal. Los estudios inmunohistoquímicos no pueden determinar el porcentaje de los subconjuntos de macrófagos en una forma sólida 17. Por lo tanto, es necesario desarrollar nuevas técnicas para determinar cuantitativamente los diferentes fenotipos de macrófagos y para entender el papel de estas células en la respuesta inflamatoria renal.
Este manuscrito describe un protocolo para determinar el número y el fenotipo de los macrófagos subconjuntos renales por citometría de flujo en ratas. En nuestro estudio, las ratas fueron sometidas a un modelo de daño renal inflamatoria mediante la administración de aldosterona. En este modelo, se observó el aumento de CD45 + y C68 + infiltración de macrófagos como se determinó mediante citometría de flujo y se confirmó mediante técnicas de inmunohistoquímica. Además, un enriquecimiento de los macrófagos M1 (CD68 + / CD86 +), pero no los macrófagos M2, se observaron en los ratones tratados con aldosterona. Estos resultados se confirmaron adicionalmente determinando la expresión del ARNm de M1 (iNOS y IFN-γ) y macroph M2marcadores de edad (Arg1 o IL-10). La citometría de flujo baja mortalidad celular análisis reportado durante el protocolo de aislamiento. Hay varios factores que pueden afectar a la viabilidad celular y marcadores de la superficie de detección, tales como el nivel de disociación del tejido, así como la duración y el tipo de digestión tisular (enzimática, mecánico, etc.). la digestión excesiva aumenta la mortalidad celular y la activación de los macrófagos y disminuye la expresión de marcadores de superficie, mientras que el efecto opuesto puede ser el resultado de la disociación baja riñón. Sin embargo, cuando el protocolo se llevó a cabo en los macrófagos aislados de peritoneo de la rata, se observó una mayor presencia de CD86 y CD163 en estas células.
El protocolo ha sido optimizado para determinar la heterogeneidad de los macrófagos en los riñones de ratas con hipertensión aldosterona mediada, y por lo tanto, puede ser extrapolado a otros modelos de enfermedades renales inflamatorias. Sin embargo, este procedimiento puede ser adaptado para cada condición experimental porque modifica inflamaciónla integridad del tejido, lo que afecta a la velocidad de digestión de tejido por la colagenasa.
Es importante señalar que para la determinación del contenido total de los macrófagos, las células se fijaron y se permeabilizaron para permitir el etiquetado intracelular con el anticuerpo CD68 18. El protocolo para la fijación incluyó el uso de formaldehído que pueden afectar fluorocromos conjugado con anticuerpos primarios, especialmente ficoeritrina. Para resolver este problema, la incubación con el anticuerpo CD86-PE se realizó después de la adición de la solución de fijación / permeabilización y más CD68-tinción. Por otra parte, es importante tener en cuenta que el formaldehído también puede interferir con otros ensayos que se pueden realizar después de macrófagos aislamiento, tales como ensayos de expresión mRNA. Sin embargo, hay kits comerciales disponibles para aislar ARNm de células de formaldehído fijo.
En resumen, este protocolo describe un método para la caracterización fenotípica de los macrófagos renal en un quantitative manera usando citometría de flujo. En general, el protocolo descrito aquí es fácil de usar, reproducible, y útil para discriminar las diferentes poblaciones de macrófagos a partir de riñones de rata.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminar flow hood | Faster | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Hettich | Or equivalent equipment | |
| Flow cytometer (FACSAria) | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum | BioWest | S1820-500 | |
| PBS 10x | LONZA | BE17-515Q | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 12/1/9001 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher Scientific | A10492-01 | |
| Flow cytometry strainers | BD Biosciences | 340626 | |
| Falcon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 352340 | |
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352052 | 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube |
| Centrifuge tubes | Corning centristar | 430791 | |
| Water bath | Memmert GmbH + Co. KG | WNE 7 | 37 °C |
| Fixation/Permeabilization Solution or Permeabilization/Wash Buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Rompum (Xylazine) | Bayer | Or equivalent | |
| Ketalar (Ketamine) | Pfizer | Or equivalent | |
| Hanks’ balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H8264-500ML | |
| Saline solution | Braun | 622415 | |
| Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7 | Biolegend | 202216 | Diluted 1:100 |
| Anti-CD68 (clone: ED1) FITC | Bio-RAD | MCA341F | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD86 (clone: 24F) PE | Biolegend | 200307 | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647 | Bio-RAD | MCA342R | Diluted 4:100 |
| Live/dead stain | Molecular Probes | L34955 | Diluted 3:1,000 |
References
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