Summary
이 원고는 표현형 및 유동 세포 계측법에 의해 쥐의 신장에서 거주하는 대 식세포의 정량 분석을위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 얻어진 염색 된 세포는 이에 실험 모델에서 얻어진 정보를 증가, 세포 선별, 유전자 발현 분석 또는 기능적 연구를 포함하는 다른 응용에 사용될 수있다.
Protocol
이 프로토콜은 지침 유럽 의회의 63분의 2,010 / EU 및 국가 가이드 라인 2천13분의 53 다음 지역 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었다.
시약 및 솔루션 1. 준비
- 무균 조건 하에서 모든 시약 및 솔루션을 준비하고 층류 후드 사용합니다. 4 ° C에서 솔루션을 유지합니다.
- 염색 버퍼를 준비 (2 % 태아 소 혈청 1 배 둘 베코의 PBS에서 (FBS)).
- 식염수의 각 ml의 콜라게나 제 0.5 mg을 추가하여 콜라겐 솔루션을 준비합니다.
- 케타민 / 자일 라진의 마취 솔루션을 준비합니다 (2 : 1 v / v)로.
2. 신장 관류 및 추출
- 케타민 / 자일 라진의 복강 내 주사 (75 밀리그램 / 12 ㎎ / ㎏ 체중)로 쥐를 마취. 조심스럽게 동물이 충분히 마취되어 있는지 확인하기 위해, 피부의 작은 배를 꼬집어. 그런 다음, 마취 동안 건조를 방지하기 위해 수의사 연고와 눈을 다룹니다. 참고 : 4 월을일짜리 위 스타 쥐이 분석에 사용됩니다.
- 쥐가 완전히 마취되면, 앙와위에서 수술 테이블에 놓습니다.
- 복부에 70 % 에탄올을 적용합니다.
- 흉막과 복강을 노출, 흉곽의 치골에서, 복부 피부와 복막을 통해 중앙 절개를합니다.
- 모든 혈액 신장에서 제거 될 때까지 관류 시스템을 사용하여 신장을 관류하는 복부 대동맥에 생리 식염수 (0.9 %)을 주입한다. 피를 해제하기 위해 복부 수준에서 대동맥을 잘라.
- 신장 폐문 (신장 정맥, 동맥과 요관)에서 절단하여 쥐에서 모두 신장을 제거합니다. 신장을 디 캡슐주의 깊게 캡슐 (11)을 분리, 손가락을 사용하여 신장의 가장자리를 누른다.
- 행크스 '균형 소금 용액에 신장을 놓습니다.
3. 신장의 소화와 세포 현탁액
- 작은 조각으로 가위 신장의 절반을 잘라 넣어1.5 ML 튜브에 조각.
참고 : 모든 다음의 농도는 1 샘플 (1/2 쥐의 신장)에 대해 계산된다. - 콜라게나 제 용액 1 ㎖를 첨가하고 30 분 동안 37 ℃에서 배양한다. 콜라게나 제 용액을 전체 조직에 접근하는지 확인 반전하여 매 5 분 혼합한다.
- 솔루션을 수집하고 플런저의 도움으로 스트레이너 (40 μm의)를 통해 통과하고, 염색 버퍼 10ml에 그것을 재현 탁.
- 15 분 동안 400 XG에 원심 분리기.
- 1 ml의 ACK (암모늄 - 염화 - 칼륨) 용균 버퍼에 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 1 분, 실온에서 30 초 후, 반응을 중지 염색 완충액 10 ㎖를 추가한다.
- 10 분 동안 400 XG에 원심 분리기.
- 다시 중단 완충액 (1 ml)로 염색 적절한 부피 펠릿 및 스트레이너 (30 μm의)을 사용하여 세포 현탁액을 필터.
- 혈구에 트리 판 블루 배제를 이용하여 세포의 수를 세어 STA하는 1.5 ㎖의 튜브에 2 백만 세포를 추가ining.
4. 세포 염색 및 유동 세포 계측법 분석
- 5 분 100 XG에 원심 분리기 세포.
- Fc 수용체를 차단하기 위해 39 ° C에서 10 분 동안 : 다시 일시 래트 혈청 100 ㎕에서 펠렛 (1 : 100 희석).
- 5 분 동안 염색 버퍼와 원심 분리기 (100) XG 1 ㎖을 첨가하여 세척 하였다.
- 살아있는 세포 (1,000 3) 감지 및 솔루션 CD45 APC-Cy7 (1 : 100), CD163 A647 (100 4) 각 조건에 대한 염색 버퍼 100 ㎕의 세포 표면 얼룩에 대한 항체를 섞는다.
- 어둠 속에서 4 ° C에서 20 분 동안 항체 믹스 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
- 5 분 동안 100 XG에 염색 버퍼 원심 1 ㎖을 첨가하여 세척 하였다. 이 단계를 반복합니다.
- 어둠 속에서 4 ° C에서 20 분 동안 고정 / Permeabilization 솔루션의 600 μl를 추가합니다.
- 5 분 동안 170 XG에 1 ml의 Permeabilization / 워시 버퍼와 원심 분리하는 과정을 2 회 반복한다.
- intracel의 경우 : CD68 FITC 항체 (1000 35)를 추가각 조건에 대한 Permeabilization / 워시 버퍼 100 ㎕에적인 다공질 염색.
- CD68 항체 용액에 펠렛을 다시 중단하고 어둠 속에서 4 ° C에서 50 분을 품어.
- 5 분 동안 170 XG에 1 ml의 Permeabilization / 워시 버퍼와 원심 분리기로 씻으십시오.
- , Permeabilization / 워시 버퍼 100 ㎕의 펠렛을 다시하면 일시 중지 CD86PE 항체 (35 : 1000)를 추가하고 어둠 속에서 4 ° C에서 20 분 동안 품어.
- 5 분 동안 100 XG에서 버퍼와 원심 분리기 Permeabilization / 워시 1 ㎖를 추가하여 씻으십시오.
- Permeabilization / 워시 버퍼 100 ㎕의 펠렛을 다시 중단하고 관 세포 계측법 흐름에 전달합니다.
- 유동 세포 계측법에 의해 샘플을 분석 할 수 있습니다. 측면 산란 빛 / 앞으로 산란 빛 (SSC / FSC) 창에 문이 살아있는 세포에서 CD45 염색을 결정합니다. 제 2 단계에서, CD68 + 세포에서 CD86 및 CD163의 발현을 분석한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
우리는 신장에서 대 식세포 침투의 증가 존재와 관련된 신 손상의 염증 실험 모델에서 대 식세포의 이질성을 분석 하였다. 이전 12보고 된이 모델에서 신장 손상, 위 스타 쥐 3 주 동안 물을 마시는 알도스테론 (1 mg의 -1 kg -1 일)을 더한 소금 (염화나트륨 1 %)의 투여에 의해 유도했다.
우리 실험 스케줄이도 1에 도시되어있다. 우선, 신장 세포를 분리 하였다 기계적 방법 및 콜라겐 (도 1a)와 상기 소화 효소를 사용. 그 후, 적혈구가 용해시켰다 신장 식세포는 유동 세포 계측법을 사용하여 검출 하였다. 세포 막 탐지 및 CD68 세포 염색 (그림 1B)에 대한 CD45, CD86 및 CD163에 대한 항체로 배양 하였다. 대 식세포 (p)의 마지막으로, 표현형opulations 그림 1C에서 보여 방식에 따라 분석 하였다.
신장 식세포 콘텐츠는 CD45 및 CD68 (도 2a)와 이중 양성 세포를 선택하여 분석 하였다. (상술 한 프로토콜 대조군 (총 신장 세포 당 + 식세포 0.57 ± 0.16 대 0.25 ± 0.02 %의 CD45 + / CD68)에 비해 알도스테론 - 처리 된 래트에서 관찰 된 CD45 + / CD68 + 마크로파지의 증가 사용 그림 2) 테이블 삽입을 참조하십시오. 바이올렛 염료로 염색을 유동 세포 계측법에 의해 결정되는 CD45 + / CD68 + 대 식세포의 세포 생존율은 통상적이었다 95 % 이상 (데이터 미도시) .Thereafter는 CD86 (M1 마커) 및 CD163 (M2 마커) 식은 중에서 평가 하였다 CD45 + / CD68 + 세포. 알도스테론 행정부는 CD45 + / CD68 + / CD86 + M1의 함량을 증가대 식세포 (2.87 ± 2.3 대 1.36 ± 0.68; %의 CD45 + / CD68 + / CD86 + 총 CD45 + / CD68 + 세포 당 대 식세포) (그림 2). 그러나, CD45 + / CD68의 낮은 번호 + / CD163 + M2 식세포 모두 알도스테론 - 처리 군과 대조군에서 관찰되었다. 이전 13 바와 같이 저 CD163의 발현은 실험 프로토콜 동안 단백질 분해 흘림과 관련되었는지 여부를 분석하기 위해, 래트 복막 마크로파지의 분리 콜라게나 제 소화를 포함하여이 과정을 반복했다. 도 2b에 보도 된 바와 같이, CD45 + / CD68 + 복강 대 식세포는 선택된 항체의 유용성을 검증하고 쥐의 신장에서 M1 / M2의 대 식세포의 특성에 대한 우리의 프로토콜의 효과를 확인, CD86와 CD163 모두 긍정적이었다.
이러한 결과를 확인하려면,상기 실험 모델에서 신장 손상과 연관된 염증 반응은 면역 조직 화학 및 실시간 PCR로 조사 하였다. 도 3에보고 된 바와 같이, 제어에 비해 CD68 + 대 식세포는 알도스테론 + 염 처리 된 래트에서 관찰 된 증가. 이어서, 대 식세포 표현형 마커 신장 M1 / M2 대식 분포의 특성을 측정 하였다. 이며 Arg1 또는 IL-10 mRNA 발현 (M2 식세포 마커) 알도스테론 투여 후 변경되지 않은 반면, 증가 인 iNOS의 mRNA 발현 및 IFN-γ (M1 마커), 알도스테론 + 염 처리 후 관찰되었다. 함께, 이러한 결과는 알도스테론 + 소금 정부가 생체 내에서 염증 M1 대식 세포 표현형을 매개 확인합니다.
그림 1 : 프로토콜 유동 세포 계측법에 의해 신장 세포의 분리 및 대 식세포 감지합니다. (B)에 의한 신장 세포 분리 (A)와 대 식세포 검출 g> 도식 표현. CD45, CD68, CD86 및 CD163 마커 (C)에 대해 서로 다른 분포에 따라 서로 다른 대식 세포 표현형의 대표적인 방식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 알도스테론에서 M1과 신장에서 M2 대 식세포 마커, 측면 산란 빛 / 앞으로 산란 빛 (SSC / FSC) 창 (A에서 게이트 살아있는 세포에서 유동 세포 계측법에 의해 CD45 염색의 대표 도트 플롯을 쥐를 치료 왼쪽 ) 제어 및 알도스테론 + 소금 처리 된 동물에서 신장 현탁액에서. 도트 플롯 내부 상자 생균 식별CD45을 표현. 이 상자에 들어있는 세포 (오른쪽, A) CD68 + 세포에서 CD86와 CD163의 발현을 결정하기 위해 분석 하였다. 이전에 사용 된 것과 같은 전략을 적용 CD45, CD68, CD86 및 CD163의 검출을위한 양성 대조군으로 복강 대 식세포에 대한 도트 플롯. 데이터는 SEM (B) ± 평균으로 표시하고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 알도스테론 + 소금 투여 후 염증 반응. (A) CD68 염색 및 대표 이미지 (B) 제어 및 알도스테론 + 염 처리 된 래트에서 M1 마커에 대한 RT-PCR (iNOS의 및 INFγ) 및 M2 마커 (이며 Arg1 및 IL-10)에 의해 측정 된 mRNA 수준의 정량적 분석한다. 데이터는 명시 적입니다에드으로 평균 ± SEM. * P <0.05 대 제어 할 수 있습니다. 스케일 바 :. 100 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
대 식세포는 신장 질환 등 다양한 염증 질환에 중요한 역할을 이종 세포이다. 각 모집단 식세포는 사구체 신염, 당뇨 성 신장 병증 및 신장 암 14-16에서보고 된 바와 같이, 신장 손상의 발달에 다른 방식으로 기여하기 때문에 신장 질환 식세포 서브 세트의 특성에 대한 관심이 높아지고있다. 급성 신장 손상의 초기 단계에서, M1 식세포의 우세는 관상 괴사 및 염증 촉진이 관찰된다. 그러나, 이후의 단계에서 M2 식세포의 높은 함량은 염증을 해결하고 조직 재 형성에 참여 관찰된다. M1이 우세 할 따라서 증가 및 염증성 신장 손상을 영속 수 있지만 만성 신장 질환에서 M1과 M2의 대 식세포 모두 동시에 공존. 따라서, 신장 질환에서 대 식세포 아형의 병태 생리 학적 역할에 대한 지식을 증가하는 것이 중요하다. 면역 조직 화학적 연구는 강력한 방법으로 17 대 식세포 부분 집합의 비율을 확인할 수 없습니다. 따라서, 양적으로 다른 식세포 표현형을 결정하는 신장 염증 반응에 대한 이들 세포의 역할을 이해하기 위해 새로운 기술을 개발하는 것이 필요하다.
이 논문은 래트에서 유동 세포 계측법에 의해 신장 식세포 서브 세트의 개수 및 표현형을 결정하기위한 프로토콜을 설명한다. 우리의 연구에서, 쥐 알도스테론의 투여에 의한 신장 손상의 염증 모델로 하였다. 유동 세포 계측법에 의해 결정 면역에 의해 확인 된 모델에서는, CD45 + 및 C68 + 대 식세포의 침윤이 증가 관찰했다. 또한, M1 식세포 (CD68 + / CD86 +의) 아니지만 M2 식세포의 보충은 알도스테론 - 처리 마우스에서 관찰되었다. 이러한 결과는 상기 M1 (은 iNOS 및 IFN-γ)의 mRNA 발현과 M2의 macroph을 결정함으로써 확인 하였다나이 마커 (이며 Arg1 또는 IL-10). 격리 프로토콜 동안 분석보고 낮은 세포 사망률 유동 세포 계측법. 여러 티슈 해리 레벨과 세포 생존 및 표면 마커 검출에 영향을 미칠 수있는 요인들뿐만 아니라 시간과 조직 소화 (효소, 정비공 등)의 종류가있다. 과도한 소화 세포 사망과 대 식세포의 활성을 증가시키고 반대의 효과가 낮은 신장 해리 발생할 수있는 반면, 표면 마커의 발현을 감소시킨다. 우리 프로토콜 래트 복막 마크로파지의 분리 하였다 그러나, CD86 및 CD163의 향상된 존재는 이들 세포에서 관찰되었다.
우리 프로토콜은 알도스테론 - 매개 된 고혈압 쥐 신장 식세포 이질성을 결정하기 위해 최적화되었으며, 따라서 다른 염증성 신장 질환 모델을 추정 할 수있다. 그러나,이 과정은 각 실험 조건에 적합 할 수있다 염증 수정하므로이에 의하여 조직 콜라겐 분해 속도에 영향을 미치는 조직의 무결성.
그것은 총 식세포 내용의 결정을 위해 점에 유의하는 것이 중요하다, 세포는 고정 CD68 항체 (18)와 세포 내 표시를 허용하도록 투과성이되었다. 고정 용 프로토콜은 형광 색소 일차 항체, 특히 피코 에리 트린에 접합에 영향을 미칠 수 포름 알데히드의 사용을 포함했다. 이 문제를 해결하려면, CD86-PE 항체 배양은 고정 / Permeabilization 솔루션 및 추가 CD68-염색을 첨가 한 후 실시 하였다. 한편, 또한 mRNA 발현 분석 등 식세포 분리 후 수행 될 수있는 다른 분석법 방해 할 수있는 포름 알데히드를 주목하는 것이 중요하다. 그러나, 포름 알데히드 고정 세포의 mRNA를 분리 할 수 상용 키트가 있습니다.
요약하면,이 프로토콜은 quantitati에서 신장 식세포의 표현형 특성에 대한 방법을 기술적이 방식으로 유동 세포 계측법 사용. 전반적으로, 여기에 설명 된 프로토콜은 쥐의 신장에서 다른 대식 세포 집단을 차별하는 사용하기 쉽고 재현성, 그리고 유용합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminar flow hood | Faster | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Hettich | Or equivalent equipment | |
| Flow cytometer (FACSAria) | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum | BioWest | S1820-500 | |
| PBS 10x | LONZA | BE17-515Q | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 12/1/9001 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher Scientific | A10492-01 | |
| Flow cytometry strainers | BD Biosciences | 340626 | |
| Falcon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 352340 | |
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352052 | 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube |
| Centrifuge tubes | Corning centristar | 430791 | |
| Water bath | Memmert GmbH + Co. KG | WNE 7 | 37 °C |
| Fixation/Permeabilization Solution or Permeabilization/Wash Buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Rompum (Xylazine) | Bayer | Or equivalent | |
| Ketalar (Ketamine) | Pfizer | Or equivalent | |
| Hanks’ balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H8264-500ML | |
| Saline solution | Braun | 622415 | |
| Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7 | Biolegend | 202216 | Diluted 1:100 |
| Anti-CD68 (clone: ED1) FITC | Bio-RAD | MCA341F | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD86 (clone: 24F) PE | Biolegend | 200307 | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647 | Bio-RAD | MCA342R | Diluted 4:100 |
| Live/dead stain | Molecular Probes | L34955 | Diluted 3:1,000 |
References
- Gansevoort, R. T., et al. Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention. Lancet. 382, 339-352 (2013).
- Kon, V., Linton, M. F., Fazio, S. Atherosclerosis in chronic kidney disease: the role of macrophages. Nat. Rev. Nephrol. 7, 45-54 (2011).
- Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Exp. Nephrol. 128, 21-29 (2014).
- Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26, 1363-1377 (2015).
- Kinsey, G. R. Macrophage dynamics in AKI to CKD progression. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 209-211 (2014).
- Lech, M., et al. Macrophage phenotype controls long-term AKI outcomes--kidney regeneration versus atrophy. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 292-304 (2014).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
- Gordon, S.
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat. Rev. Immunol. 8, 958-969 (2008).
- Ortiz, A., et al. Translational value of animal models of kidney failure. Eur. J. Pharmacol. 759, 205-220 (2015).
- Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of double negative alphabeta T cells from the. J. Vis. Exp. , (2014).
- Martin-Fernandez, B., et al. Aldosterone Induces Renal Fibrosis and Inflammatory M1-Macrophage Subtype via Mineralocorticoid Receptor in Rats. PLoS. One. 11, e0145946 (2016).
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. J. Vis. Exp. (e52749), (2015).
- Komohara, Y., et al. Macrophage infiltration and its prognostic relevance in clear cell renal cell carcinoma. Cancer Sci. 102, 1424-1431 (2011).
- Han, Y., Ma, F. Y., Tesch, G. H., Manthey, C. L., Nikolic-Paterson, D. J. Role of macrophages in the fibrotic phase of rat crescentic glomerulonephritis. Am. J. Physiol Renal Physiol. 304, F1043-F1053 (2013).
- Ndisang, J. F. Role of the heme oxygenase-adiponectin-atrial natriuretic peptide axis in renal function. Curr. Pharm. Des. 21, 4380-4391 (2015).
- Blackbeard, J., et al. Quantification of the rat spinal microglial response to peripheral nerve injury as revealed by immunohistochemical image analysis and flow cytometry. J. Neurosci. Methods. 164, 207-217 (2007).
- Strobl, H., Scheinecker, C., Csmarits, B., Majdic, O., Knapp, W. Flow cytometric analysis of intracellular CD68 molecule expression in normal and malignant haemopoiesis. Br. J. Haematol. 90, 774-782 (1995).
