Summary
Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour phénotypiques et l'analyse quantitative des macrophages résidents de reins de rats par cytométrie de flux. Les cellules colorées ainsi obtenues peuvent également être utilisées pour d'autres applications, y compris le tri cellulaire, l'analyse de l'expression des gènes ou des études fonctionnelles, augmentant ainsi les informations obtenues dans le modèle expérimental.
Protocol
Ce protocole a été approuvé par des institutions locales de protection des animaux et l'utilisation des comités suite à la directive 2010/63 / UE du Parlement européen et la ligne directrice nationale 53/2013.
1. Préparation des réactifs et solutions
- Préparer tous les réactifs et les solutions dans des conditions stériles et à utiliser sous une hotte à flux laminaire. Conserver les solutions à 4 ° C.
- Préparer tampon de coloration (2% de sérum bovin fœtal (FBS) dans du PBS 1x Dulbecco).
- Préparer une solution de collagénase en ajoutant 0,5 mg de collagénase à chaque ml de solution saline.
- Préparer une solution d'anesthésie de la kétamine / xylazine (2: 1 v / v).
2. Kidney Perfusion et Extraction
- Anesthésier les rats par injection intraperitoneale de kétamine / xylazine (75 mg / 12 mg / kg de poids). pincer délicatement un petit pli de la peau, pour vérifier que l'animal est suffisamment anesthésiée. Ensuite, couvrir les yeux avec vétérinaire onguent pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. Note: 4-mone rats Wistar sont utilisés dans cet essai.
- Une fois que le rat est totalement anesthésié, placez-le sur une table chirurgicale en position couchée.
- Appliquer 70% d'éthanol dans l'abdomen.
- Faire une incision centrale à travers la peau abdominale et le péritoine, du pubis à la cage thoracique afin d'exposer les cavités pleurale et abdominale.
- Injecter une solution saline (0,9%) dans l'aorte abdominale pour perfuser les reins en utilisant un système de perfusion jusqu'à ce que tout le sang est retiré du rein. Couper l'aorte au niveau abdominal pour aider à libérer le sang.
- Retirer les deux reins du rat en coupant du hile rénal (veine rénale, l'artère et de l'uretère). Pour décapsuler le rein, appuyez sur le bord du rein en utilisant les doigts, séparer soigneusement la capsule 11.
- Placer le rein dans une solution saline équilibrée de Hanks.
3. Rein Digestion et Cell Suspension
- Coupez la moitié d'un rein avec des ciseaux en petits morceaux et mettez-lemorceaux dans un tube de 1,5 ml.
Remarque: Toutes les concentrations suivantes sont calculés pour 1 échantillon (de rein de 1/2 rat). - Ajouter 1 ml de la solution de collagénase et incuber à 37 ° C pendant 30 min. Mélanger par inversion toutes les 5 minutes pour vous assurer que la solution de collagénase accède au tissu entier.
- Recueillir la solution et le faire passer à travers un filtre (40 pm) à l'aide d'un piston, et remettre en suspension dans 10 ml de tampon de coloration.
- Centrifuger à 400 g pendant 15 min.
- Re-suspendre le culot dans 1 ml ACK (Ammonium-Chloride-potassium) Lyse Buffer. Au bout de 1 min 30 sec à la température ambiante, on ajoute 10 ml de tampon de coloration pour arrêter la réaction.
- Centrifuger à 400 g pendant 10 min.
- Remettre en suspension le culot dans un volume suffisant de tampon (1 ml) et filtrer la coloration de la suspension cellulaire à l'aide d'un filtre (30 pm).
- Comptez le nombre de cellules en utilisant l'exclusion du bleu trypan sur un hémocytomètre et ajouter 2 millions de cellules dans un tube de 1,5 ml pour staining.
4. Cellule d'analyse Coloration et cytométrie de flux
- Centrifuger les cellules à 100 g pendant 5 min.
- Remettre en suspension le culot dans 100 pl de sérum de rat (dilution 1: 100) pendant 10 min à 4 ° C pour bloquer les récepteurs Fc.
- Lavage en ajoutant 1 ml de tampon de coloration et de centrifugation 100 g pendant 5 min.
- Mélanger les anticorps pour la coloration de la surface cellulaire dans 100 pi de tampon de coloration pour chaque condition: CD45 APC-Cy7 (1: 100), CD163 A647 (4: 100) et de solution pour détecter des cellules vivantes (3: 1000).
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans le mélange d'anticorps pendant 20 minutes à 4 ° C dans l'obscurité.
- Lavage en ajoutant 1 ml de tampon de coloration et centrifuger à 100 g pendant 5 min. Répétez cette étape.
- Ajouter 600 ul d'une solution / perméabilisation de fixation pendant 20 min à 4 ° C dans l'obscurité.
- Laver 2 fois avec 1 ml de tampon perméabilisation / Wash et centrifuger à 170 g pendant 5 min.
- Ajouter l'anticorps CD68 FITC (35: 1000) pour le Intracelcoloration lular à 100 pi de tampon de perméabilisation / Wash pour chaque condition.
- Remettre en suspension le culot dans la solution de CD68-anticorps et incuber pendant 50 min à 4 ° C dans l'obscurité.
- Laver avec 1 ml de tampon perméabilisation / Wash et centrifuger à 170 g pendant 5 min.
- Re-suspendre le culot dans 100 ul de tampon de perméabilisation / Wash, ajouter un anticorps CD86PE (35: 1000) et incuber pendant 20 min à 4 ° C dans l'obscurité.
- Laver en ajoutant 1 ml de perméabilisation / tampon de lavage et de centrifugation à 100 g pendant 5 min.
- Re-suspendre le culot dans 100 ul de tampon perméabilisation / Wash et de passer à une cytométrie en flux tube.
- Analyser les échantillons par cytométrie de flux. Déterminer CD45 coloration dans les cellules vivantes gated à la lumière / lumière diffusée vers l'avant-Side dispersés (SSC / FSC) fenêtre. Dans une deuxième étape, l' analyse de CD86 et de l' expression de CD163 dans des cellules CD68 +.
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Representative Results
Nous avons analysé l'hétérogénéité des macrophages dans un modèle expérimental de lésion rénale inflammatoire associée à une présence accrue de l'infiltration des macrophages dans le rein. Dans ce modèle, les lésions rénales a été induite par l' administration de l' aldostérone (1 mg -1 kg -1 jour) plus de sel (NaCl 1%) dans l' eau potable pendant 3 semaines chez les rats Wistar, comme indiqué précédemment 12.
L'horaire de nos expériences est représentée sur la figure 1. Tout d' abord, les cellules rénales ont été isolées en utilisant des procédés mécaniques et en outre une digestion enzymatique avec de la collagénase (figure 1A). Ensuite, les erythrocytes ont été lysés et les macrophages rénaux ont été détectés en utilisant la cytométrie de flux. Les cellules ont été incubées avec des anticorps pour CD45, CD86 et CD163 pour la détection de la membrane et CD68 pour coloration intracellulaire (figure 1B). Enfin, le phénotype de macrophage populations a été analysé selon le schéma montré à la figure 1C.
Teneur macrophage rénale a été analysée par la sélection de cellules à double positivité pour CD45 et CD68 (Figure 2A). En utilisant le protocole décrit ci - dessus, une augmentation de + / CD68 + macrophages CD45 a été observée chez les rats aldostérone traités par rapport au groupe témoin (0,57 ± 0,16 vs 0,25 ± 0,02,% CD45 + / CD68 + macrophages par des cellules rénales total) ( Figure 2, voir tableau insert). La viabilité des cellules de CD45 + / CD68 + macrophages, tel que déterminé par cytométrie en flux coloration avec colorant violet, était systématiquement supérieure à 95% (données non présentées) .Thereafter, CD86 (marqueur M1) et CD163 (marqueur M2) expression a été évaluée chez les CD45 + / CD68 + cellules. L' administration de l' aldostérone a augmenté le contenu de CD45 + / CD68 + / CD86 + M1macrophages (2,87 ± 2,3 vs 1,36 ± 0,68;% CD45 + / CD68 + / CD86 + macrophages par totale CD45 + / CD68 + cellules) (Figure 2). Cependant, un faible nombre de CD45 + / CD68 + macrophages / CD163 + M2 ont été observées dans les deux groupes de l' aldostérone-traité et de contrôle. Pour analyser si la faible expression de CD163 a été liée à l' excrétion protéolytique pendant le protocole expérimental, nous avons répété cette procédure, y compris la collagénase digestion, dans les macrophages isolés de péritoine de rat, comme décrit précédemment 13. Comme indiqué dans la figure 2B, CD45 + / CD68 + macrophages péritonéaux ont été positifs pour les deux CD86 et CD163, valider l'utilité des anticorps sélectionnés et confirmant l'efficacité de notre protocole pour la caractérisation des macrophages M1 / M2 dans le rein de rat.
Pour valider ces résultats,la réponse inflammatoire associée à des lésions rénales dans les modèles expérimentaux ci-dessus a été étudiée par immunohistochimie et PCR en temps réel. Comme il est indiqué sur la figure 3, l' augmentation des macrophages CD68 + ont été observées chez les rats aldostérone + sel traité, par rapport au témoin. Ensuite, les marqueurs phénotypiques macrophage ont été déterminées pour caractériser la distribution rénale macrophagique M1 / M2. L'expression d'ARNm de iNOS et une augmentation de l'IFN-γ (marqueurs M1) a été observée après traitement aldostérone + sel, tandis que Arg1 ou l'IL-10 expression de l'ARNm (marqueurs de type macrophage M2) n'a pas changé après l'administration de l'aldostérone. Ensemble, ces résultats confirment que aldostérone + administration de sel médie la M1 phénotype inflammatoire macrophage in vivo.
Figure 1: Protocole pour Renal cellules d' isolement et de détection des macrophages par cytométrie de flux. (A) et la détection des macrophages par cytométrie de flux (B). Régime représentatif des différents phénotypes macrophage selon une répartition différente pour CD45, CD68, CD86 et marqueurs CD163 (C). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: M1 et M2 Macrophage Marqueurs dans Reins de aldostérone représentatifs dot-parcelles de CD45 coloration des rats traités par cytométrie de flux dans des cellules vivantes gated à la lumière / lumière diffusée vers l' avant Side diffusée (/ FSC SSC) fenêtre (A, à gauche. ) à partir de suspensions de rein dans le contrôle et l'aldostérone + animaux de sel traité. La boîte à l'intérieur des tracés de points identifie les cellules vivantesexprimant CD45. Les cellules incluses dans cette boîte ont été analysés pour déterminer CD86 et l' expression de CD163 en CD68 + cellules (A, droite). Dot parcelle pour les macrophages péritonéaux comme témoin positif pour la détection de CD45, CD68, CD86 et CD163, en appliquant la même stratégie utilisée précédemment. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM (B). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: réponse inflammatoire après aldostérone + sel Administration. (A) Des images représentatives de CD68 coloration et (B) analyse quantitative des niveaux d' ARNm mesurés par RT-PCR pour les marqueurs M1 inductible (iNOS et INFy) et des marqueurs M2 (Arg1 et IL-10) dans le contrôle et l' aldostérone + rats traité au sel. Les données sont expressed en moyenne ± SEM. * P <0,05 vs. contrôle. Barre d' échelle:. 100 um S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les macrophages sont des cellules hétérogènes qui jouent un rôle important dans diverses maladies inflammatoires, y compris les troubles rénaux. Il y a un intérêt croissant pour la caractérisation des sous - ensembles des macrophages dans la maladie rénale parce que chaque sous - population macrophage contribue d'une manière différente au développement des lésions rénales, comme indiqué dans la glomérulonéphrite, la néphropathie diabétique et le cancer du rein 14-16. Dans les premiers stades de la lésion rénale aiguë, une prédominance de macrophages M1 est observée, la promotion de la nécrose tubulaire et l'inflammation. Cependant, dans les étapes ultérieures d'une teneur plus élevée des macrophages M2 est observée pour résoudre l'inflammation et de participer à un remodelage tissulaire. Dans la maladie rénale chronique, à la fois M1 et M2 macrophages co-existent simultanément, bien que M1 peut être prédominant, augmentant ainsi la perpétuation et des lésions rénales inflammatoires. Par conséquent, il est important d'accroître notre connaissance du rôle physiopathologique des sous-types de macrophages dans la maladie rénale. Les études immunohistochimiques ne peuvent pas déterminer le pourcentage de sous - ensembles macrophage de manière robuste 17. Par conséquent, il est nécessaire de développer de nouvelles techniques pour déterminer quantitativement les différents phénotypes de macrophages et de comprendre le rôle de ces cellules dans la réponse inflammatoire rénale.
Ce manuscrit décrit un protocole pour déterminer le nombre et le phénotype des macrophages rénaux sous-ensembles par cytométrie de flux chez le rat. Dans notre étude, les rats ont été soumis à un modèle inflammatoire des lésions rénales par l'administration de l'aldostérone. Dans ce modèle, nous avons observé augmenté CD45 + et C68 + infiltration macrophagique tel que déterminé par cytométrie en flux et confirmée par immunohistochimie. En outre, un enrichissement des macrophages M1 (CD68 + / CD86 + de ), mais pas M2 macrophage, ont été observés chez les souris aldostérone traitées. Ces résultats ont été confirmées par détermination de l'expression d'ARNm de M1 inductible (iNOS et l'IFN-γ) et M2 macrophmarqueurs d'âge (arg1 ou IL-10). Cytométrie de flux faible mortalité des cellules d'analyse rapporté au cours du protocole d'isolement. Il existe plusieurs facteurs qui peuvent affecter la détection de la viabilité cellulaire et des marqueurs de surface tels que le degré de dissociation des tissus ainsi que la durée et le type de digestion du tissu (enzymatique, mécanique, etc.). la digestion excessive augmente la mortalité des cellules et l'activation des macrophages et diminue l'expression des marqueurs de surface, tandis que l'effet inverse peut résulter d'une faible dissociation du rein. Cependant, alors que notre protocole a été effectuée dans des macrophages isolés à partir du péritoine de rat, une présence accrue de CD86 et CD163 a été observée dans ces cellules.
Notre protocole a été optimisé pour déterminer l'hétérogénéité macrophage dans les reins des rats atteints d'hypertension aldostérone médiée, et par conséquent, peut être extrapolée à d'autres modèles de maladies rénales inflammatoires. Toutefois, cette procédure peut être adaptée à chaque condition expérimentale, car modifie l'inflammationl'intégrité des tissus, affectant ainsi la vitesse de digestion des tissus par la collagénase.
Il est important de noter que , pour la détermination de la teneur totale macrophage, des cellules ont été fixées et perméabilisées pour permettre marquage intracellulaire avec un anticorps CD68 18. Le protocole de fixation inclus l'utilisation du formaldéhyde qui peuvent affecter fluorochromes conjugués à des anticorps primaires, en particulier la phycoérythrine. Pour résoudre ce problème, l'incubation avec l'anticorps CD86-PE a été réalisée après addition de la solution de fixation / perméabilisation et encore CD68-coloration. D'autre part, il est important de noter que le formaldéhyde peuvent également interférer avec d'autres analyses qui peuvent être effectuées après l'isolement des macrophages, tels que les essais d'expression de l'ARNm. Cependant, il existe des kits disponibles dans le commerce pour isoler l'ARNm à partir de cellules de formaldéhyde fixe.
En résumé, ce protocole décrit une méthode pour la caractérisation phénotypique des macrophages rénaux dans un quantitative manière en utilisant la cytométrie de flux. Dans l'ensemble, le protocole décrit ici est facile à utiliser, reproductible et utile pour distinguer les populations de macrophages différentes de reins de rats.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminar flow hood | Faster | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Hettich | Or equivalent equipment | |
| Flow cytometer (FACSAria) | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum | BioWest | S1820-500 | |
| PBS 10x | LONZA | BE17-515Q | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 12/1/9001 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher Scientific | A10492-01 | |
| Flow cytometry strainers | BD Biosciences | 340626 | |
| Falcon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 352340 | |
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352052 | 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube |
| Centrifuge tubes | Corning centristar | 430791 | |
| Water bath | Memmert GmbH + Co. KG | WNE 7 | 37 °C |
| Fixation/Permeabilization Solution or Permeabilization/Wash Buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Rompum (Xylazine) | Bayer | Or equivalent | |
| Ketalar (Ketamine) | Pfizer | Or equivalent | |
| Hanks’ balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H8264-500ML | |
| Saline solution | Braun | 622415 | |
| Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7 | Biolegend | 202216 | Diluted 1:100 |
| Anti-CD68 (clone: ED1) FITC | Bio-RAD | MCA341F | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD86 (clone: 24F) PE | Biolegend | 200307 | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647 | Bio-RAD | MCA342R | Diluted 4:100 |
| Live/dead stain | Molecular Probes | L34955 | Diluted 3:1,000 |
References
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