Summary
Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per fenotipici e analisi quantitativa dei macrofagi residenti da reni di ratto mediante citometria di flusso. Le cellule colorate risultanti possono essere utilizzati anche per altre applicazioni, incluse separazione delle cellule, analisi di espressione genica o studi funzionali, aumentando così le informazioni ottenute nel modello sperimentale.
Protocol
Questo protocollo è stato approvato dalla Institutional Animal Care locali e utilizzare i comitati a seguito della direttiva 2010/63 / UE del Parlamento europeo e con la linea guida nazionale 53/2013.
1. Preparazione dei reagenti e soluzioni
- Preparare tutti i reagenti e soluzioni in condizioni sterili e utilizzare sotto una cappa a flusso laminare. Mantenere le soluzioni a 4 ° C.
- Preparare buffer di colorazione (2% siero fetale bovino (FBS) in PBS 1x Dulbecco).
- Preparare la soluzione di collagenasi con l'aggiunta di 0,5 mg di collagenasi per ogni ml di soluzione fisiologica.
- Preparare la soluzione di anestesia di ketamina / xylazina (2: 1 v / v).
2. Rene perfusione e di estrazione
- Anestetizzare topi mediante iniezione intraperitoneale di ketamina / xilazina (75 mg / 12 mg / kg di peso). pizzicare con attenzione una piccola piega della pelle, per controllare che l'animale è sufficientemente anestetizzato. Poi, coprire gli occhi con veterinario unguento per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Nota: 4-month-ratti Wistar sono utilizzati in questo test.
- Una volta che il ratto è completamente anestetizzato, posizionarlo su un tavolo operatorio in posizione supina.
- Applicare etanolo al 70% per l'addome.
- Effettuare una incisione centrale attraverso la cute addominale e del peritoneo, dal pube alla gabbia toracica, per esporre le cavità pleurica e addominali.
- Iniettare soluzione salina (0,9%) in aorta addominale per perfusione reni usando un sistema di perfusione finché tutto il sangue viene rimosso da reni. Tagliare l'aorta a livello addominale per aiutare a liberare il sangue.
- Rimuovere entrambi i reni dal ratto tagliando dal ilo renale (vena renale, arteria e dell'uretere). Per decapsulate rene, premere il bordo del rene con le dita, separando accuratamente la capsula 11.
- Posizionare il rene in soluzione salina bilanciata Hanks '.
3. Rene Digestione e Cell Suspension
- Tagliare la metà di un rene con le forbici in piccoli pezzi e mettere ilpezzi in una provetta da 1,5 ml.
Nota: Tutte le seguenti concentrazioni sono calcolati per 1 campione (rene 1/2 di ratto). - Aggiungere 1 ml di soluzione di collagenasi e incubare a 37 ° C per 30 min. Mescolare per capovolgimento ogni 5 minuti per assicurarsi che la soluzione di collagenasi accede tutto il tessuto.
- Raccogliere la soluzione e farla passare attraverso un filtro (40 micron) con l'ausilio di un pistone, e risospendere in 10 ml di tampone colorazione.
- Centrifugare a 400 xg per 15 min.
- Risospendere il pellet in 1 ml di ACK (ammonio-cloruro-potassio) lisi buffer. Dopo 1 min 30 sec a temperatura ambiente, aggiungere 10 ml di tampone colorazione per arrestare la reazione.
- Centrifugare a 400 xg per 10 min.
- Risospendere il pellet in un volume adeguato di colorazione tampone (1 ml) e filtrare la sospensione cellulare utilizzando un filtro (30 micron).
- Contare il numero di cellule utilizzando trypan blu su un emocitometro e aggiungere 2 milioni di cellule in una provetta da 1,5 ml per stavorazio.
4. cella di analisi di colorazione e citometria a flusso
- cellule centrifugare a 100 xg per 5 min.
- Risospendere il precipitato in 100 microlitri di siero di ratto (diluito 1: 100) per 10 min a 4 ° C per bloccare i recettori Fc.
- Lavare aggiungendo 1 ml di tampone colorazione e centrifugare 100 xg per 5 min.
- Mescolare gli anticorpi per la colorazione della superficie cellulare in 100 microlitri di tampone colorazione per ciascuna condizione: CD45 APC-Cy7 (1: 100), CD163 A647 (4: 100) e soluzione per rilevare le cellule vive (3: 1000).
- Risospendere il pellet cellulare nella miscela di anticorpi per 20 min a 4 ° C al buio.
- Lavare aggiungendo 1 ml di tampone colorazione e centrifugare a 100 xg per 5 min. Ripetere questo passaggio.
- Aggiungere 600 ml di soluzione / Permeabilization fissaggio per 20 min a 4 ° C al buio.
- Lavare 2 volte con 1 ml di tampone permeabilizzazione / Lavare e centrifugare a 170 xg per 5 min.
- Aggiungere l'anticorpo CD68 FITC (35: 1000) per la intracelcolorazione lular a 100 ml di buffer di permeabilizzazione / Wash per ogni condizione.
- Risospendere il pellet in soluzione CD68-anticorpi e incubare 50 min a 4 ° C al buio.
- Lavare con 1 ml di tampone permeabilizzazione / Lavare e centrifugare a 170 xg per 5 min.
- Risospendere il pellet in 100 ml di buffer di permeabilizzazione / Wash, aggiungere anticorpi CD86PE (35: 1000) e incubare per 20 minuti a 4 ° C al buio.
- Lavare con l'aggiunta di 1 ml di permeabilizzazione / tampone di lavaggio e centrifugare a 100 xg per 5 min.
- Risospendere il pellet in 100 ml di buffer di permeabilizzazione / Wash e passarlo a un tubo di citometria a flusso.
- Analizzare i campioni mediante citometria di flusso. Determinare CD45 colorazione in cellule vive gated nella luce laterale luce diffusa / forward-sparsi finestra (SSC / FSC). In una seconda fase, analizzare CD86 e CD163 espressione nelle cellule CD68 +.
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Representative Results
Abbiamo analizzato macrofagi eterogeneità in un modello sperimentale infiammatoria del danno renale associata a maggiore presenza di infiltrazione di macrofagi nel rene. In questo modello, il danno renale è stata indotta mediante somministrazione di aldosterone (1 mg -1 kg -1 die) più sale (NaCl 1%) in acqua potabile per 3 settimane a ratti Wistar, come precedentemente riportato 12.
Il programma dei nostri esperimenti è mostrato in Figura 1. Primo, cellule di rene sono stati isolati con metodi meccanici e ulteriore digestione enzimatica con collagenasi (Figura 1A). Successivamente, gli eritrociti sono stati lisati e macrofagi renali sono stati rilevati utilizzando citometria a flusso. Le cellule sono state incubate con anticorpi per CD45, CD86 e CD163 per il rilevamento di membrana CD68 e per la colorazione intracellulare (Figura 1B). Infine, il fenotipo dei macrofagi populations è stato analizzato secondo lo schema mostrato nella Figura 1C.
Contenuti macrofagi renale è stata analizzata selezionando cellule con doppia positività per CD45 e CD68 (Figura 2A). Utilizzando il protocollo sopra descritto, un aumento delle CD45 + / CD68 + macrofagi è stato osservato nei ratti trattati con aldosterone, rispetto al gruppo di controllo (0,57 ± 0,16 vs 0,25 ± 0,02,% CD45 + / CD68 + macrofagi a cellule renali totali) ( Figura 2, vedi inserto tabella). La vitalità cellulare dei CD45 + / CD68 + macrofagi, come determinato mediante citometria di flusso colorazione con colorante viola, era abitualmente superiore al 95% (dati non riportati) .Thereafter, CD86 (marker M1) e CD163 (indicatore M2) espressione è stata valutata tra i CD45 + / CD68 + cellule. L'aldosterone amministrazione ha aumentato il contenuto di CD45 + / CD68 + / CD86 + M1macrofagi (2.87 ± 2.3 vs 1,36 ± 0,68;% CD45 + / CD68 + / CD86 + macrofagi al totale CD45 + / CD68 + cellule) (Figura 2). Tuttavia, un basso numero di CD45 + / CD68 + macrofagi / CD163 + M2 sono stati osservati in entrambi i gruppi aldosterone trattati e di controllo. Per analizzare se l'espressione basso CD163 era legato a spargimento proteolitici durante il protocollo sperimentale, abbiamo ripetuto questa procedura, tra cui collagenasi digestione, nei macrofagi isolati dal peritoneo di ratto, come descritto in precedenza 13. Come riportato in figura 2B, CD45 + / CD68 + macrofagi peritoneali sono stati positivi sia per il CD86 e CD163, convalidando l'utilità degli anticorpi selezionati e confermando l'efficacia del nostro protocollo per la caratterizzazione dei macrofagi M1 / M2 nel rene di ratto.
Per convalidare questi risultati,la risposta infiammatoria associata a danno renale in modelli sperimentali di cui sopra è stato studiato da immunoistochimica e real-time PCR. Come riportato in figura 3, sono stati osservati aumento CD68 + macrofagi nei ratti trattati sale aldosterone +, rispetto al controllo. Poi, marcatori fenotipici macrofagi sono stati determinati per caratterizzare renale distribuzione dei macrofagi M1 / M2. è stata osservata l'espressione di mRNA Aumento di iNOS e IFN-γ (marcatori M1) dopo aldosterone + sale trattamento, mentre Arg1 o IL-10 espressione di mRNA (M2 marcatori macrofagi) non sono cambiati dopo la somministrazione di aldosterone. Insieme, questi risultati confermano che l'aldosterone + amministrazione sale media l'infiammazione M1 fenotipo dei macrofagi in vivo.
Figura 1: Protocollo per renale celle di isolamento e macrofagi rilevamento mediante citometria di flusso. (A) e rilevamento macrofagi mediante citometria di flusso (B). Schema rappresentativo dei vari fenotipi macrofagi in base alla diversa distribuzione per CD45, CD68, CD86 e CD163 marcatori (C). Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: M1 e M2 macrofagi marcatori nei reni da aldosterone ratti trattati mediante citometria di flusso rappresentativi dot-appezzamenti di CD45 colorazione in cellule vive gated nella luce laterale luce diffusa / forward-sparso (/ FSC SSC) finestra (A, a sinistra. ) da sospensioni di rene nel controllo e aldosterone + animali sale trattati. La scatola dentro le trame di punti identifica cellule viveesprimere CD45. Le cellule contenute in questa casella sono stati analizzati per determinare CD86 e CD163 espressione nelle cellule CD68 + (a, a destra). dot plot per macrofagi peritoneali come controllo positivo per la rilevazione di CD45, CD68, CD86 e CD163, applicando la stessa strategia usata in precedenza. I dati sono presentati come media ± SEM (B). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: risposta infiammatoria dopo aldosterone + Salt Amministrazione. (A) Immagini rappresentative della CD68 colorazione e (B) analisi quantitative dei livelli di mRNA misurati mediante RT-PCR per i marcatori M1 (iNOS e INFγ) e marcatori M2 (Arg1 e IL-10), nel controllo e aldosterone + ratti sale-trattata. I dati sono espressoEd ± SEM come media. * P <0.05 vs controllo. Barra di scala:. 100 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I macrofagi sono cellule eterogenee che svolgono un ruolo importante in diverse malattie infiammatorie, incluse le patologie renali. Vi è un crescente interesse nella caratterizzazione dei macrofagi sottoinsiemi nella malattia renale perché ogni sottopopolazione macrofagi contribuisce in modo diverso allo sviluppo di danno renale, come riportato nella glomerulonefrite, nefropatia diabetica e cancro del rene 14-16. Nelle fasi iniziali di danno renale acuta, una predominanza di macrofagi M1 si osserva, promuovendo necrosi tubulare e infiammazione. Tuttavia, nelle fasi successive un maggior contenuto di macrofagi M2 si osserva per risolvere l'infiammazione e partecipare rimodellamento tissutale. Nella malattia renale cronica, sia M1 e M2 macrofagi co-esistono simultaneamente, anche se M1 può essere predominante, aumentando così e perpetuare danno renale infiammatorio. Pertanto, è importante per aumentare la nostra conoscenza del ruolo fisiopatologico dei sottotipi dei macrofagi nella malattia renale. Studi di immunoistochimica non possono determinare la percentuale di sottoinsiemi dei macrofagi in modo robusto 17. Pertanto, è necessario sviluppare nuove tecniche per determinare quantitativamente i diversi fenotipi macrofagi e comprendere il ruolo di queste cellule in risposta infiammatoria renale.
Questo manoscritto descrive un protocollo per determinare il numero e il fenotipo di macrofagi renali sottoinsiemi mediante citometria di flusso in ratti. Nel nostro studio, i ratti sono stati sottoposti a un modello infiammatoria del danno renale con la somministrazione di aldosterone. In questo modello, abbiamo osservato aumentato CD45 + e C68 + infiltrazione di macrofagi come determinato mediante citometria di flusso e confermato da immunoistochimica. Inoltre, un arricchimento di macrofagi M1 (CD68 + / CD86 +), ma non M2 macrofagi, sono stati osservati nei topi trattati con aldosterone. Questi risultati sono stati ulteriormente confermati da determinare l'espressione di mRNA di M1 (iNOS e IFN-γ) e M2 macrophmarcatori di età (ARG1 o IL-10). Citometria a flusso analisi riportata bassa mortalità delle cellule durante il protocollo di isolamento. Ci sono diversi fattori che possono influenzare il rilevamento vitalità cellulare e marcatori di superficie, quali il livello di dissociazione tissutale nonché la durata e tipo di digestione tessutale (enzimatica, meccanico, ecc). digestione eccessiva aumenta la mortalità cellulare e l'attivazione dei macrofagi e diminuisce l'espressione marcatore di superficie, mentre l'effetto opposto può derivare da basso dissociazione del rene. Tuttavia, quando il nostro protocollo è stato condotto in macrofagi isolati dal peritoneo di ratto, una maggiore presenza di CD86 e CD163 è stata osservata in queste cellule.
Il nostro protocollo è stato ottimizzato per determinare l'eterogeneità dei macrofagi nei reni da ratti con ipertensione aldosterone-mediata, e di conseguenza, possono essere estrapolati ad altri modelli di malattie renali infiammatorie. Tuttavia, questa procedura può essere adattato ad ogni condizione sperimentale perché modifica infiammazionel'integrità dei tessuti, influenzando così il tasso di digestione dei tessuti da collagenasi.
E 'importante notare che per la determinazione del contenuto totale macrofagi, le cellule sono state fissate e permeabilizzate per consentire etichettatura intracellulare con l'anticorpo CD68 18. Il protocollo per la fissazione incluso l'uso di formaldeide che possono influenzare fluorocromi coniugati con anticorpi primari, in particolare ficoeritrina. Per risolvere questo problema, l'incubazione con l'anticorpo CD86-PE è stata eseguita dopo l'aggiunta della Fixation / soluzione permeabilizzazione e l'ulteriore CD68-colorazione. D'altra parte, è importante notare che la formaldeide può anche interferire con altri metodi che possono essere eseguite dopo l'isolamento macrofagi, come saggi di espressione dell'mRNA. Tuttavia, ci sono kit commerciali disponibili per isolare mRNA da cellule di formaldeide fisso.
In sintesi, questo protocollo descrive un metodo per la caratterizzazione fenotipica dei macrofagi renale in un QUANTITATIVAve maniera citometria a flusso. Nel complesso, il protocollo qui descritto è facile da usare, riproducibile e utile per discriminare diverse popolazioni di macrofagi da reni di ratto.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminar flow hood | Faster | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Hettich | Or equivalent equipment | |
| Flow cytometer (FACSAria) | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum | BioWest | S1820-500 | |
| PBS 10x | LONZA | BE17-515Q | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 12/1/9001 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher Scientific | A10492-01 | |
| Flow cytometry strainers | BD Biosciences | 340626 | |
| Falcon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 352340 | |
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352052 | 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube |
| Centrifuge tubes | Corning centristar | 430791 | |
| Water bath | Memmert GmbH + Co. KG | WNE 7 | 37 °C |
| Fixation/Permeabilization Solution or Permeabilization/Wash Buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Rompum (Xylazine) | Bayer | Or equivalent | |
| Ketalar (Ketamine) | Pfizer | Or equivalent | |
| Hanks’ balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H8264-500ML | |
| Saline solution | Braun | 622415 | |
| Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7 | Biolegend | 202216 | Diluted 1:100 |
| Anti-CD68 (clone: ED1) FITC | Bio-RAD | MCA341F | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD86 (clone: 24F) PE | Biolegend | 200307 | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647 | Bio-RAD | MCA342R | Diluted 4:100 |
| Live/dead stain | Molecular Probes | L34955 | Diluted 3:1,000 |
References
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