Summary
Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para fenotípica e análise quantitativa de macrófagos residentes de rins de ratos por citometria de fluxo. As células marcadas resultantes podem também ser utilizados para outras aplicações, incluindo a separação de células, a análise da expressão do gene ou estudos funcionais, aumentando, assim, a informação obtida no modelo experimental.
Protocol
Este protocolo foi aprovado pelo Institutional Animal Care locais e utilizar comités sequência da Directiva 2010/63 / UE do Parlamento Europeu e da Orientação Nacional 53/2013.
1. Preparação de reagentes e soluções
- Preparar todos os reagentes e soluções sob condições estéreis e utilizar sob uma câmara de fluxo laminar. Manter as soluções a 4 ° C.
- Preparar tampão de coloração (2% de Soro Fetal Bovino (FBS) em PBS de Dulbecco 1x).
- Preparar solução de colagenase por adição de 0,5 mg de colagenase para cada ml de solução salina.
- Preparar a solução de anestesia de cetamina / xilazina (2: 1 v / v).
2. Kidney perfusão e Extração
- Anestesiar ratos por injecção intraperitoneal de cetamina / xilazina (75 mg / 12 mg / kg de peso). Cuidadosamente beliscar uma pequena dobra de pele, para verificar se o animal está suficientemente anestesiados. Em seguida, cobrir os olhos com pomada veterinário para evitar a secura e sob anestesia. Nota: 4-monTH-Ratos Wistar são utilizados neste ensaio.
- Uma vez que o rato é totalmente anestesiado, coloque-o sobre uma mesa cirúrgica em decúbito dorsal.
- Aplicar 70% de etanol para o abdômen.
- Faça uma incisão central através da pele abdominal e peritônio, a partir do púbis até a caixa torácica, para expor as cavidades pleural e abdominal.
- Injectar solução salina (0,9%) na aorta abdominal para perfundir rins utilizando um sistema de perfusão até que todo o sangue é removido a partir de rins. Corte a aorta ao nível abdominal para ajudar a liberar o sangue.
- Remova ambos os rins de ratos, cortando a partir do hilo renal (veia renal, artéria e ureter). Para decapsulate o rim, pressionar a borda do rim usando os dedos, separando cuidadosamente a cápsula 11.
- Coloque o rim em solução salina equilibrada de Hanks.
Digestão 3. Rim e suspensão de células
- Cortar a metade de um rim com uma tesoura em pedaços pequenos e coloque opeças em um tubo de 1,5 ml.
Nota: Todas as seguintes concentrações são calculados para 1 amostra (rim 1/2 do rato). - Adicionar 1 ml de solução de colagenase e incubar a 37 ° C durante 30 min. Misturar por inversão a cada 5 minutos para se certificar de que a solução de colagenase acessos do tecido todo.
- Recolher a solução e passá-la através de um filtro (40 um) com o auxílio de um êmbolo, e ressuspender-lo em 10 ml de tampão de coloração.
- Centrifugar a 400 xg durante 15 min.
- Re-suspender o sedimento em 1 ml ACK (Ammonium-cloro e potássio) Tampão de Lise. Após 1 min 30 s, à temperatura ambiente, adicionar 10 ml de tampão de coloração para parar a reacção.
- Centrifugar a 400 xg durante 10 min.
- Re-suspender o sedimento num volume adequado de tampão de coloração (1 ml) e filtrar a suspensão de células através de um filtro (30 um).
- Contar o número de células usando exclusão com azul de tripano num hemocitómetro e adicionar 2 milhões de células para um tubo de 1,5 mL para STAining.
4. Análise celular Coloração e Citometria de Fluxo
- células centrifugar a 100 xg por 5 min.
- Re-suspender o sedimento em 100 ul de soro de rato (diluído 1: 100) durante 10 min a 4 ° C para bloquear os receptores Fc.
- Lavar por adição de 1 ml de tampão de coloração e centrifugar a 100 xg durante 5 min.
- Misturar os anticorpos para a coloração da superfície celular em 100 ul de tampão de coloração para cada condição: CD45-APC Cy7 (1: 100), CD163 A647 (4: 100) e de solução para detectar células vivas (3: 1000).
- Re-suspender o sedimento de células na mistura de anticorpos durante 20 min a 4 ° C no escuro.
- Lavar por adição de 1 ml de tampão de coloração e centrifugar a 100 xg durante 5 min. Repita este passo.
- Adicionar 600 ul de solução / Permeabilização de fixação durante 20 min a 4 ° C no escuro.
- Lavar 2 vezes com 1 ml de tampão de permeabilização / Wash e centrifugar a 170 xg durante 5 min.
- Adicionar o anticorpo CD68 FITC (35: 1000) para a Intracelcoloração lular de 100 ul de tampão de permeabilização / lavagem para cada condição.
- Re-suspender o sedimento em solução de CD68-anticorpo e incubar 50 min a 4 ° C no escuro.
- Lava-se com 1 ml de tampão de permeabilização / Wash e centrifugar a 170 xg durante 5 min.
- Re-suspender o sedimento em 100 ul de tampão de permeabilização / Lavagem, adicionar anticorpo CD86PE (35: 1000) e incubar durante 20 min a 4 ° C no escuro.
- Lavar por adição de 1 ml de permeabilização / tampão de lavagem e centrifugar a 100 xg durante 5 min.
- Re-suspender o sedimento em 100 mL de tampão de permeabilização / Wash e passá-lo para a citometria de fluxo tubo.
- Analisar as amostras por citometria de fluxo. Determinar coloração CD45 em células vivas fechados à luz / light forward-dispersadas-Side janela (SSC / FSC). Num segundo passo, analisar CD86 e CD163 expressão em células CD68 +.
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Representative Results
Analisou-se macrófagos heterogeneidade num modelo inflamatório experimental de lesão renal associada com o aumento da presença de macrófagos infiltrantes no rim. Neste modelo, lesão renal foi induzida pela administração de aldosterona (1 mg kg -1 -1 dia) mais sal (NaCl a 1%) na água de beber durante 3 semanas em ratos Wistar, como previamente relatado 12.
A programação das nossas experiências é mostrado na Figura 1. Em primeiro lugar, as células de rim foram isolados utilizando métodos mecânicos e posterior digestão enzimática com colagenase (Figura 1A). Depois disso, os eritrócitos foram lisados e macrófagos renais foram detectados por citometria de fluxo. As células foram incubadas com anticorpos para CD45, CD86 e CD163 para a detecção de CD68 de membrana e para a coloração intracelular (Figura 1B). Finalmente, o fenótipo do macrófago Populations foi analisada de acordo com o esquema mostrado na Figura 1C.
Conteúdo de macrófagos renal foi analisado por selecção de células com dupla positividade para CD45 e CD68 (Figura 2A). Usando o protocolo acima descrito, um aumento em CD45 + / CD68 + macrófagos foi observada em ratos tratados com aldosterona em comparação com o grupo de controlo (0,57 ± 0,25 ± 0,02,% CD45 + 0,16 vs / CD68 + por macrófagos células renais no total) ( Figura 2, consulte Inserir tabela). A viabilidade das células de CD45 + / CD68 + macrófagos, tal como determinado por citometria de fluxo com coloração com corante violeta, foi rotineiramente superior a 95% (dados não mostrados) .Thereafter, CD86 (marcador M1) e CD163 (M2 marcador) expressão foi avaliada entre o CD45 + / CD68 + células. Administração aldosterona aumentou o teor de CD45 + / CD68 + / CD86 + M1macrófagos (2,87 ± 2,3 vs 1,36 ± 0,68;% CD45 + / CD68 + / CD86 + por macrófagos total de CD45 + / CD68 +) (Figura 2). No entanto, um baixo número de CD45 + / CD68 + foram observados macrófagos / CD163 + M2 em ambos os grupos tratados e de controlo por aldosterona. Para analisar se a baixa expressão CD163 foi relacionada a derramamento proteolítica durante o protocolo experimental, repetimos este procedimento, incluindo a digestão de colagenase, em macrófagos isolados de peritônio de rato, como descrito anteriormente 13. Conforme relatado na Figura 2B, CD45 + / CD68 + macrófagos peritoneais eram positivas tanto para CD86 e CD163, validando a utilidade dos anticorpos seleccionados e confirmando a eficácia do nosso protocolo para a caracterização de macrófagos M1 / M2 no rim de rato.
Para validar esses resultados,a resposta inflamatória associada com o dano renal nos modelos experimentais anteriores foi estudada por imuno-histoquímica e PCR em tempo real. Como apresentado na Figura 3, o aumento da CD68 + macrófagos foram observados em ratos tratados sal aldosterona +, em comparação com o controlo. Em seguida, marcadores fenótipo de macrófagos foram determinados para caracterizar a distribuição renal de macrófagos M1 / M2. A expressão aumentada de ARNm de iNOS e IFN-γ (marcadores M1) foi observada após aldosterona + sal de tratamento, ao passo que Arg1 ou IL-10 de expressão de ARNm de (marcadores de macrófagos M2) não se alterou após a administração de aldosterona. Em conjunto, estes resultados confirmam que a aldosterona + administração sal medeia o fenótipo inflamatória de macrófagos M1 in vivo.
Figura 1: Protocolo para Renal celas de isolamento e detecção de macrófagos por citometria de fluxo. (A) e detecção de macrófagos por citometria de fluxo (B). Esquema representativo dos diferentes fenótipos de macrófagos de acordo com a distribuição diferente para CD45, CD68, CD86 e marcadores CD163 (C). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: M1 e M2 macrófagos Marcadores em rins de aldosterona ratos tratados por citometria de fluxo representativos dot-parcelas de coloração CD45 em células vivas fechados à luz / light forward-dispersadas-Side janela (SSC / FSC) (A, à esquerda. ) a partir de suspensões de rim no controle e aldosterona + animais tratados com sal. A caixa de dentro dos gráficos de pontos identifica células vivasexpressando CD45. As células incluídas neste quadro foram analisadas para determinar a expressão de CD86 e CD163 nas células CD68 + (A, direita). gráfico de pontos para os macrófagos peritoniais como controle positivo para a detecção de CD45, CD68, CD86 e CD163, aplicando a mesma estratégia usada anteriormente. Os dados são apresentados como média ± SEM (B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resposta Inflamatória após aldosterona + Administração de sal. (A) Imagens representativas da coloração de CD68 e (B) as análises quantitativas de níveis de mRNA medido por RT-PCR para marcadores M1 (iNOS e INFγ) e marcadores M2 (Arg1 e IL-10) em ratos tratados com sal de controle e aldosterona +. Os dados são expressEd como média ± SEM. * P <0,05 controle vs.. Barra de escala:. 100 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os macrófagos são células heterogéneas que desempenham um papel importante em doenças inflamatórias, incluindo doenças renais. Existe um interesse crescente na caracterização de subconjuntos de macrófagos na doença renal, porque cada sub-população de macrófagos contribui de uma maneira diferente para o desenvolvimento de lesão renal, como relatado na glomerulonefrite, nefropatia diabética e cancro renal 14-16. Nas fases iniciais da lesão renal aguda, uma predominância de macrófagos M1 é observado, a promoção de necrose tubular e inflamação. No entanto, em fases posteriores de um teor mais elevado de macrófagos M2 é observado para resolver a inflamação e participar na remodelação de tecidos. Na doença renal crônica, tanto M1 e M2 macrófagos co-existir simultaneamente, embora M1 pode ser predominante, aumentando e perpetuando o dano renal inflamatória. Portanto, é importante para aumentar o nosso conhecimento sobre o papel fisiopatológico dos subtipos de macrófagos na doença renal. Estudos imunohistoquímicos não pode determinar a percentagem de subconjuntos de macrófagos de forma robusta 17. Portanto, é necessário o desenvolvimento de novas técnicas para determinar quantitativamente os diferentes fenótipos de macrófagos e para compreender o papel destas células na resposta inflamatória renal.
Este manuscrito descreve um protocolo para determinar o número e o fenótipo de macrófagos subconjuntos renais por citometria de fluxo em ratos. No nosso estudo, os ratos foram submetidos a um modelo inflamatório de lesão renal através da administração de aldosterona. Neste modelo, foi observado aumento da CD45 + e C68 + infiltração de macrófagos, conforme determinado por citometria de fluxo e confirmada por imuno-histoquímica. Além disso, um enriquecimento de macrófagos M1 (CD68 + / CD86 +), mas não M2 macrófagos, foram observados em ratinhos tratados com aldosterona. Estes resultados foram ainda confirmados por determinação da expressão de ARNm de M1 (iNOS e IFN-γ) e M2 macrophmarcadores (em geral Arg1 ou IL-10). Citometria de fluxo relataram baixa mortalidade celular durante o protocolo de isolamento. Existem vários factores que podem afectar a viabilidade celular e a detecção de marcadores de superfície, tais como o nível de dissociação de tecidos, bem como a duração e tipo de digestão do tecido (enzimática, mecânica, etc.). digestão excessiva aumenta a mortalidade celular e a activação de macrófagos e diminui a expressão do marcador de superfície, enquanto que o efeito oposto pode resultar de baixa dissociação do rim. No entanto, quando o protocolo foi realizado em macrófagos isolados a partir de peritoneu de rato, observou-se uma presença aumentada de CD86 e CD163 nestas células.
Nosso protocolo foi optimizado para determinar heterogeneidade de macrófagos em rins de ratos com hipertensão mediada pela aldosterona, e, portanto, podem ser extrapolados para outros modelos de doenças inflamatórias renais. No entanto, este procedimento pode ser adaptado para cada condição experimental porque modifica inflamaçãointegridade dos tecidos, afetando a taxa de digestão do tecido pela colagenase.
É importante notar que para a determinação do teor total de macrófagos, as células foram fixadas e permeabilizadas para permitir a marcação intracelular com anticorpo CD68 18. O protocolo para a fixação incluído o uso de formaldeído que podem afectar fluorocromos conjugados com anticorpos primários, especialmente ficoeritrina. Para resolver este problema, a incubação com anticorpo CD86-PE foi realizada após a adição da solução de f ixação / Permeabilização e mais CD68-coloração. Por outro lado, é importante notar que o formaldeído pode também interferir com outros ensaios que podem ser realizados depois de isolamento macrófagos, tais como ensaios de expressão de ARNm. No entanto, existem kits comerciais disponíveis para isolar ARNm a partir de células de formaldeído fixo.
Em resumo, este protocolo descreve um método para a caracterização fenotípica dos macrófagos renais num quantitative forma citometria de fluxo. Em geral, o protocolo aqui descrito é fácil de usar, reproduzível, e útil para discriminar diferentes populações de macrófagos de rins de ratos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminar flow hood | Faster | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Hettich | Or equivalent equipment | |
| Flow cytometer (FACSAria) | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum | BioWest | S1820-500 | |
| PBS 10x | LONZA | BE17-515Q | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 12/1/9001 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher Scientific | A10492-01 | |
| Flow cytometry strainers | BD Biosciences | 340626 | |
| Falcon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 352340 | |
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352052 | 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube |
| Centrifuge tubes | Corning centristar | 430791 | |
| Water bath | Memmert GmbH + Co. KG | WNE 7 | 37 °C |
| Fixation/Permeabilization Solution or Permeabilization/Wash Buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Rompum (Xylazine) | Bayer | Or equivalent | |
| Ketalar (Ketamine) | Pfizer | Or equivalent | |
| Hanks’ balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H8264-500ML | |
| Saline solution | Braun | 622415 | |
| Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7 | Biolegend | 202216 | Diluted 1:100 |
| Anti-CD68 (clone: ED1) FITC | Bio-RAD | MCA341F | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD86 (clone: 24F) PE | Biolegend | 200307 | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647 | Bio-RAD | MCA342R | Diluted 4:100 |
| Live/dead stain | Molecular Probes | L34955 | Diluted 3:1,000 |
References
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