Summary
Detta manuskript beskriver ett detaljerat protokoll för fenotypisk och kvantitativ analys av residenta makrofager från råttnjurar med flödescytometri. De resulterande färgade celler kan också användas för andra tillämpningar, inklusive cellsortering, genuttryck analys eller funktionella studier, vilket ökar den information som erhållits i den experimentella modellen.
Protocol
Detta protokoll har godkänts av lokala Institutional Animal Care och användning kommittéer efter direktiv 2010/63 / EG Europaparlamentets och nationella riktlinjer 53/2013.
1. Beredning av reagenser och lösningar
- Förbered alla reagenser och lösningar under sterila betingelser och användning under en huv med laminärt flöde. Håll lösningar vid 4 ° C.
- Förbereda färgning buffert (2% fetalt bovint serum (FBS) i 1 x Dulbeccos PBS).
- Bered kollagenas lösning genom att tillsätta 0,5 mg kollagenas till varje ml saltlösning.
- Förbereda anestesi lösning av ketamin / xylazin (2: 1 v / v).
2. Njure Perfusion och extraktion
- Söva råttorna genom intraperitoneal injektion av ketamin / xylazin (75 mg / 12 mg / kg vikt). Försiktigt nypa en liten hudveck, för att kontrollera att djuret är tillräckligt sövd. Sedan täcker ögonen med veterinär salva för att förhindra torrhet under narkos. Obs: 4-month-gamla Wistar-råttor användes i denna analys.
- När råttan är helt sövda, placera den på ett operationsbord i ryggläge.
- Applicera 70% etanol till buken.
- Göra en central snitt genom den abdominala huden och peritoneum, från pubis till bröstkorgen, för att exponera de pleurala och bukhålan.
- Injicera saltlösning (0,9%) i den abdominala aortan för att perfundera njurar med användning av ett perfusionssystem tills allt blod tas bort från njurarna. Skär aorta på buken nivå att frigöra blodet.
- Ta bort båda njurar från råtta genom att skära från njur hilum (renal ven, artär och urinledaren). Att decapsulate njuren genom att trycka på kanten av njuren med fingrarna, försiktigt separera kapseln 11.
- Placera njuren i Hanks balanserade saltlösning.
3. Njur Uppslutning och cellsuspensionen
- Skär hälften av en njure med sax i små bitar och sättabitar i ett 1,5 ml rör.
Notera: Alla följande koncentrationer beräknas för ett prov (1/2 råtta njure). - Tillsätt 1 ml av den kollagenaslösning och inkubera vid 37 ° C under 30 min. Blanda genom att vända var 5 min för att säkerställa att den kollagenaslösning accessar hela vävnaden.
- Samla in lösningen och för den genom en sil (40 ^ m) med hjälp av en kolv, och återsuspendera det i 10 ml färgningsbuffert.
- Centrifugera vid 400 xg under 15 min.
- Återsuspendera pelleten i 1 ml ACK (Ammonium-Klorid-Kalium) lyseringsbuffert. Efter 1 min 30 sek vid rumstemperatur, tillsätt 10 ml färgningsbuffert för att stoppa reaktionen.
- Centrifugera vid 400 xg under 10 min.
- Återsuspendera pelleten i en lämplig volym av färgningsbuffert (1 ml) och filtrera cellsuspension med användning av en sil (30 um).
- Räkna antalet celler med användning av trypanblått-uteslutning på en hemocytometer och tillsätt 2 miljoner celler till ett 1,5 ml rör för staining.
4. Cell Färgning och flödescytometrianalys
- Centrifugera cellerna vid 100 xg under 5 min.
- Återsuspendera pelleten i 100 | il av råttserum (utspätt 1: 100) under 10 min vid 4 ° C för att blockera Fc-receptorer.
- Tvätta genom att tillsätta 1 ml färgningsbuffert och centrifugera 100 xg under 5 min.
- Blanda antikropparna för cellytan färgning i 100 pl färgningsbuffert för varje tillstånd: CD45 APC-Cy7 (1: 100), CD163 A647 (4: 100) och lösnings att detektera levande celler (3: 1000).
- Återsuspendera cellpelleten i mixen antikropp under 20 min vid 4 ° C i mörker.
- Tvätta genom att tillsätta 1 ml färgningsbuffert och centrifugera vid 100 xg under 5 min. Upprepa detta steg.
- Lägg 600 pl Fixering / Permeabilization lösning under 20 minuter vid 4 ° C i mörker.
- Tvätta 2 gånger med 1 ml Permeabilization / tvättbuffert och centrifugera vid 170 xg under 5 min.
- Tillsätt CD68 FITC-antikropp (35: 1000) för intracellular färgning till 100 pl av Permeabilization / tvättbuffert för varje tillstånd.
- Återsuspendera pelleten i CD68-antikroppslösningen och inkubera 50 minuter vid 4 ° C i mörker.
- Tvätta med 1 ml Permeabilization / tvättbuffert och centrifugera vid 170 xg under 5 min.
- Återsuspendera pelleten i 100 pl Permeabilization / tvättbuffert, tillsätt CD86PE antikropp (35: 1000) och inkubera i 20 min vid 4 ° C i mörker.
- Tvätta genom att tillsätta 1 ml av Permeabilization / Wash-buffert och centrifugera vid 100 xg under 5 min.
- Återsuspendera pelleten i 100 pl Permeabilization / tvättbuffert och vidarebefordra den till en flödescytometri rör.
- Analysera prov genom flödescytometri. Bestäm CD45 färgning i levande celler gated i Side-spritt ljus / framåt spritt ljus (SSC / FSC) fönster. I ett andra steg analysera CD86 och CD163 uttryck i CD68 + celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi analyserade makrofag heterogenitet i en inflammatorisk experimentell modell av njurskada i samband med ökad närvaro av infiltrerande makrofager i njuren. I denna modell, var njurskada induceras genom administrering av aldosteron (1 mg -1 kg -1 dag) plus salt (NaCl 1%) i dricksvattnet i 3 veckor i Wistar-råttor, som tidigare rapporterats 12.
Schemat för våra experiment visas i figur 1. Först var njurceller isolerades med användning av mekaniska metoder och ytterligare enzymatisk digerering med kollagenas (Figur 1A). Därefter var erytrocyter lyser och njurmakrofager detekterades med hjälp av flödescytometri. Celler inkuberades med antikroppar för CD45, CD86 och CD163 för membran detektering och CD68 för intracellulär färgning (Figur 1B). Slutligen, fenotypen av makrofag populations analyserades enligt schemat visade i figur 1C.
Renal makrofag innehåll analyserades genom att välja celler med dual positivitet för CD45 och CD68 (Figur 2A). Användning av det protokoll som beskrivits ovan, en ökning av CD45 + / CD68 + makrofager observerades i aldosteronbehandlade råttor jämfört med kontrollgruppen (0,57 ± 0,16 vs. 0,25 ± 0,02,% CD45 + / CD68 + makrofager per total njurceller) ( Figur 2, se tabell insats). Cellviabilitet av CD45 + / CD68 + makrofager, såsom bestämts genom flödescytometri färgning med violett färgämne, var rutinmässigt större än 95% (data ej visade) .Thereafter ades CD86 (M1 markör) och CD163 (M2 markör) expression bedömas bland de CD45 + / CD68 + celler. Aldosteron administration ökade halten av CD45 + / CD68 + / CD86 + M1makrofager (2,87 ± 2,3 vs. 1,36 ± 0,68,% CD45 + / CD68 + / CD86 + makrofager per total CD45 + / CD68 + celler) (Figur 2). Men ett lågt antal CD45 + / CD68 + / CD163 + M2 makrofager observerades i både aldosteron-behandlade och kontrollgrupperna. För att analysera huruvida den låga CD163 uttryck var relaterad till proteolytiska utsöndring under försöksprotokollet, upprepade vi detta förfarande, inklusive kollagenas matsmältning, i makrofager som isolerats från rått bukhinnan, som tidigare beskrivits 13. Som rapporterats i figur 2B, CD45 + / CD68 + peritoneala makrofager var positiva för både CD86 och CD163, validera användbarheten av utvalda antikropparna och bekräftar effektiviteten i våra protokoll för karakterisering av M1 / M2 makrofager i råttnjure.
För att validera dessa resultat,det inflammatoriska svaret associerat med njurskada i de ovanstående försöksmodeller studerades genom immunhistokemi och realtids-PCR. Såsom rapporteras i Figur 3, ökad CD68 + makrofager observerades i aldosteron + saltbehandlade råttor, jämfört med kontroll. Därefter tillsattes macrophage fenotyp markörer bestämt sig för att karakterisera njur M1 / M2 makrofag fördelning. Ökat mRNA-uttryck av iNOS och IFN-γ (M1 markörer) observerades efter aldosteron + salt behandling, medan ARG1 eller IL-10 mRNA-expression (M2 makrofag markörer) inte förändrades efter aldosteron administrering. Tillsammans utgör dessa resultat bekräftar att aldosteron + salt administration förmedlar den inflammatoriska M1 makrofag fenotypen in vivo.
Figur 1: Protokoll för njurcellerna Isolering och Macrophage Detection med flödescytometri. (A) och makrofag detektion genom flödescytometri (B). Representativa system av olika makrofag fenotyper enligt annan fördelning för CD45, CD68, CD86 och CD163 markörer (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: M1 och M2 Macrophage markörer i njurar från Aldosteron råttor med flödescytometri Representativa punkt tomter av CD45 färgning i levande celler gated i Side-spritt ljus / framåt spritt ljus (SSC / FSC) fönster (A, vänster. ) från njur suspension i kontroll och aldosteron + saltbehandlade djur. Rutan i punkt tomter identifierar levande cellersom uttrycker CD45. Celler som ingår i denna ruta analyserades för att bestämma CD86 och CD163 uttryck i CD68 + celler (A, höger). Punktdiagram för peritoneala makrofager som positiv kontroll för att upptäcka CD45, CD68, CD86 och CD163, tillämpar samma strategi som användes tidigare. Uppgifterna presenteras som medelvärde ± SEM (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Inflammatory Response efter Aldosteron + Salt Administration. (A) Representativa bilder av CD68-färgning och (B) kvantitativa analyser av mRNA-nivåer som uppmätts med hjälp av RT-PCR för M1-markörer (iNOS och INFy) och M2 markörer (arg1 och IL-10) i kontroll och aldosteron + saltbehandlade råttor. Data är uttryckceras som medelvärde ± SEM. * P <0,05 jämfört med kontrollen. Skala bar:. 100 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Makrofager är heterogena celler som spelar en viktig roll vid olika inflammatoriska sjukdomar, inklusive njursjukdomar. Det finns ett ökande intresse för karakterisering av makrofager undergrupper i njursjukdom eftersom varje makrofag subpopulation bidrar på ett annat sätt till utvecklingen av njurskada, som rapporterats i glomerulonefrit, diabetisk nefropati och njurcancer 14-16. I de tidiga stadierna av akut njurskada, är en dominans av M1 makrofager observeras, främja tubulär nekros och inflammation. Emellertid i senare stadier en högre halt av M2 makrofager observeras att lösa inflammation och delta i vävnadsombildning. Vid kronisk njursjukdom, samexistera både M1 och M2 makrofager samtidigt, även om M1 kan vara dominerande, vilket ökar och vidmakthålla inflammatoriska njurskador. Därför är det viktigt att öka kunskapen om den patofysiologiska roll macrophage subtyper i njursjukdom. Immunhistokemiska studier kan inte bestämma andelen macrophage grupper i en robust sätt 17. Därför är det nödvändigt att utveckla nya tekniker för att kvantitativt bestämma de olika makrofager fenotyper och att förstå vilken roll dessa celler på njur inflammatoriskt svar.
Detta manuskript beskriver ett protokoll för att bestämma antalet och fenotypen av njurmakrofager undergrupper med flödescytometri hos råttor. I vår studie, fick råttorna genomgå en inflammatorisk modell av njurskada genom administration av aldosteron. I denna modell, observerade vi en ökad CD45 + och C68 + makrofag infiltration som bestäms genom flödescytometri och bekräftades genom immunohistokemi. Dessutom en anrikning av M1 makrofager (CD68 + / CD86 +), men inte M2 makrofag observerades i aldosteronbehandlade möss. Dessa resultat bekräftades ytterligare genom att bestämma mRNA-uttryck av M1 (iNOS och IFN-γ) och M2 macrophåldersmarkörer (arg1 eller IL-10). Flödescytometrianalys rapporterade låg celldödlighet under isoleringsprotokollet. Det finns flera faktorer som kan påverka cellernas livskraft och ytmarkörer upptäckt, såsom nivån av vävnadsdissociering samt varaktighet och typ av vävnad matsmältningen (enzymatisk, mekaniker, etc.). Överdriven digestion ökar celldödlighet och makrofagaktivering och minskar ytmarkör uttryck, medan motsatt effekt kan bero på låga njure dissociation. Men när våra protokoll utfördes i makrofager som isolerats från rått peritoneum ades en förstärkt närvaro av CD86 och CD163 observerades i dessa celler.
Vår protokoll har optimerats för att bestämma makrofag heterogenitet i njurar från råttor med aldosteron-medierad hypertoni, och kan därför extrapoleras till andra inflammatoriska modeller njursjukdom. Men Detta förfarande kan anpassas till varje experimentell tillstånd eftersom inflammations modifierarvävnadsintegritet, vilket påverkar graden av vävnads matsmältningen genom kollagenas.
Det är viktigt att notera att för bestämning av den totala makrofag innehåll fixerades celler och permeabiliserades att tillåta intracellulär märkning med CD68-antikroppen 18. Protokollet för fixering ingår användning av formaldehyd som kan påverka fluorokromer konjugerad till primära antikroppar, särskilt fykoerytrin. Att lösa detta problem, var inkubation med CD86-PE-antikropp utfördes efter tillsats av Fixering / Permeabilization lösning och ytterligare CD68-färgning. Å andra sidan är det viktigt att notera att formaldehyd kan också störa andra analyser som kan utföras efter makrofager isolering, såsom mRNA expressionsanalyser. Det finns emellertid kommersiella kit tillgängliga för att isolera mRNA från formaldehydfixerade celler.
Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll en metod för fenotypisk karakterisering av njurmakrofager i en quantitative sätt med användning av flödescytometri. Totalt sett är det protokoll som beskrivs här lätt att använda, reproducerbar, och användbar för att särskilja olika makrofager populationer från råttnjurarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminar flow hood | Faster | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Hettich | Or equivalent equipment | |
| Flow cytometer (FACSAria) | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum | BioWest | S1820-500 | |
| PBS 10x | LONZA | BE17-515Q | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 12/1/9001 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher Scientific | A10492-01 | |
| Flow cytometry strainers | BD Biosciences | 340626 | |
| Falcon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 352340 | |
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352052 | 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube |
| Centrifuge tubes | Corning centristar | 430791 | |
| Water bath | Memmert GmbH + Co. KG | WNE 7 | 37 °C |
| Fixation/Permeabilization Solution or Permeabilization/Wash Buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Rompum (Xylazine) | Bayer | Or equivalent | |
| Ketalar (Ketamine) | Pfizer | Or equivalent | |
| Hanks’ balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H8264-500ML | |
| Saline solution | Braun | 622415 | |
| Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7 | Biolegend | 202216 | Diluted 1:100 |
| Anti-CD68 (clone: ED1) FITC | Bio-RAD | MCA341F | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD86 (clone: 24F) PE | Biolegend | 200307 | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647 | Bio-RAD | MCA342R | Diluted 4:100 |
| Live/dead stain | Molecular Probes | L34955 | Diluted 3:1,000 |
References
- Gansevoort, R. T., et al. Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention. Lancet. 382, 339-352 (2013).
- Kon, V., Linton, M. F., Fazio, S. Atherosclerosis in chronic kidney disease: the role of macrophages. Nat. Rev. Nephrol. 7, 45-54 (2011).
- Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Exp. Nephrol. 128, 21-29 (2014).
- Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26, 1363-1377 (2015).
- Kinsey, G. R. Macrophage dynamics in AKI to CKD progression. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 209-211 (2014).
- Lech, M., et al. Macrophage phenotype controls long-term AKI outcomes--kidney regeneration versus atrophy. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 292-304 (2014).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat. Rev. Immunol. 8, 958-969 (2008).
- Ortiz, A., et al. Translational value of animal models of kidney failure. Eur. J. Pharmacol. 759, 205-220 (2015).
- Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of double negative alphabeta T cells from the. J. Vis. Exp. , (2014).
- Martin-Fernandez, B., et al. Aldosterone Induces Renal Fibrosis and Inflammatory M1-Macrophage Subtype via Mineralocorticoid Receptor in Rats. PLoS. One. 11, e0145946 (2016).
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. J. Vis. Exp. (e52749), (2015).
- Komohara, Y., et al. Macrophage infiltration and its prognostic relevance in clear cell renal cell carcinoma. Cancer Sci. 102, 1424-1431 (2011).
- Han, Y., Ma, F. Y., Tesch, G. H., Manthey, C. L., Nikolic-Paterson, D. J. Role of macrophages in the fibrotic phase of rat crescentic glomerulonephritis. Am. J. Physiol Renal Physiol. 304, F1043-F1053 (2013).
- Ndisang, J. F. Role of the heme oxygenase-adiponectin-atrial natriuretic peptide axis in renal function. Curr. Pharm. Des. 21, 4380-4391 (2015).
- Blackbeard, J., et al. Quantification of the rat spinal microglial response to peripheral nerve injury as revealed by immunohistochemical image analysis and flow cytometry. J. Neurosci. Methods. 164, 207-217 (2007).
- Strobl, H., Scheinecker, C., Csmarits, B., Majdic, O., Knapp, W. Flow cytometric analysis of intracellular CD68 molecule expression in normal and malignant haemopoiesis. Br. J. Haematol. 90, 774-782 (1995).
