Summary
Bu yazıda fenotipik ve flow sitometri ile sıçan böbreklerden yerleşik makrofajlar kantitatif analizi için ayrıntılı bir protokol açıklar. Elde edilen lekeli hücreler aynı zamanda, böylece deneysel modelinde elde edilen bilgileri, artan hücre sıralama, gen ekspresyon analizi veya fonksiyonel çalışmalar dahil olmak üzere, başka uygulamalar için de kullanılabilir.
Protocol
Bu protokol Direktifi Avrupa Parlamentosu 2010/63 / AB ve Ulusal Rehber 53/2013 aşağıdaki yerel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylandı.
Reaktifler ve Çözümleri 1. Hazırlık
- Steril koşullar altında tüm reaktifler ve çözümler hazırlamak ve bir laminar akış başlığı altında kullanınız. 4 ° C'de çözüm tutun.
- lekeleme tampon maddesi hazırlanması (% 2 fetal sığır serumu 1x Dulbecco PBS (FBS)).
- tuzlu su, her ml kolajenaz 0.5 mg ekleyerek kolajenaz çözeltisi hazırlayın.
- ketamin / ksilazin anestezi çözeltisi hazırlayın (2: 1 hac / hac).
2. Böbrek Perfüzyon ve Ekstraksiyon
- ketamin / ksilazin intraperitoneal enjeksiyonu (75 mg / 12 mg / kg ağırlık) göre sıçan anestezisi. Dikkatle hayvan yeterince anestezi olup olmadığını kontrol etmek, cildin küçük bir kat tutam. Ardından, anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için veteriner merhemi gözleri kapsamaktadır. Not: 4-moninci Wistar sıçanları bu deneyde kullanılır.
- Sıçan tamamen uyuşturulduktan sonra, bir yatar pozisyonda bir cerrahi masanın üzerine yerleştirin.
- karın% 70 etanol uygulayın.
- Plevra ve karın boşlukları ortaya çıkarmak için, göğüs kafesine pubis, karın derisi ve periton aracılığıyla merkezi bir kesi yapmak.
- Tüm kan böbrekler kaldırılana kadar bir perfüzyon sistemi kullanılarak böbrek serpmek için abdominal aorta içine tuzlu su çözeltisi (% 0.9) enjekte edilir. kan serbest yardım karın düzeyde aort kesin.
- Renal hilus (renal ven, arter ve üreter) dan keserek sıçan hem böbrek çıkarın. Böbrek açarlar için dikkatle kapsül 11 ayıran, parmaklarını kullanarak böbrek kenarına basın.
- Hanks dengeli tuz çözeltisi içine böbrek yerleştirin.
3. Böbrek Sindirim ve Hücre Süspansiyon
- Küçük parçalar halinde makas ile böbrek yarısı kesilmiş ve koyun1.5 ml tüp içine adettir.
Not: Aşağıdaki tüm konsantrasyonlar 1 numune (1/2 sıçan böbrek) için hesaplanmıştır. - kolajenaz çözeltisi 1 ml ilave edilir ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. kollajenaz çözüm tüm doku kere emin olmak için ters çevirerek her 5 dk karıştırın.
- çözelti toplamak ve bir piston yardımıyla bir süzgeç (40 um) üzerinden geçmesi ve lekeleme tampon maddesi, 10 ml içinde tekrar süspansiyon.
- 15 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
- 1 ml ACK (Amonyum Klorür-Potasyum) Parçalama Tampon pelet yeniden askıya. 1 dakika, oda sıcaklığında 30 saniye sonra, reaksiyonu durdurmak için lekeleme tampon maddesi 10 ml ekleyin.
- 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
- Yeniden askıya tamponu (1 mi) boyama yeterli hacimde pelet ve bir süzgeç (30 um) kullanılarak hücre süspansiyonu filtre edin.
- Bir hemasitometre tripan mavisi dışlama kullanarak hücrelerin sayısını ve sta için 1.5 ml tüp 2 milyon hücre eklemekadencilik.
4. Hücre Boyama ve Sitometrisi Analizi
- 5 dakika boyunca 100 x g'de santrifüje hücreleri.
- Fc reseptörleri bloke etmek için 4 ° C'de 10 dakika süre ile: yeniden askıya sıçan serumu, 100 ul pelet (100 1 seyreltilmiş).
- 5 dakika boyunca boyama tamponu ve santrifüj 100 xg 1 ml ekleyerek yıkayın.
- canlı hücreler (: 1000 3) tespit etmek için ve çözelti, CD45 APC-Cy7 (1: 100), CD163 A647 (100 4) her bir durum için lekeleme tampon maddesi 100 ul hücre yüzeyi boyama için antikorlar karıştırın.
- karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika süre ile, antikor karışımı hücre pelletini yeniden askıya.
- 5 dakika boyunca 100 x g'de lekeleme tampon maddesi ve santrifüj 1 ml ekleyerek yıkayın. bu adımı yineleyin.
- karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika için tespit / Permeabilization çözeltisi 600 ul ekle.
- 5 dakika boyunca 170 x g'de 1 mi Permeabilization / Yıkama tamponu ve santrifüj ile 2 kez yıkanır.
- intracel için iyi: CD68 FITC antikoru (1.000 35) eklemeHer bir durum için Permeabilization / Yıkama tamponu, 100 ul lular boyama.
- CD68 antikor çözeltisi pelet yeniden askıya ve karanlıkta 4 ° C'de 50 dakika inkübe edilir.
- 5 dakika boyunca 170 x g'de 1 mi Permeabilization / Yıkama tamponu ve santrifüj ile yıkanır.
- , Permeabilization / Yıkama tamponu 100 ul pelet yeniden askıya CD86PE antikoru (35: 1000) ekleyin ve karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika süreyle inkübe edin.
- 5 dakika boyunca 100 x g'de tampon ve santrifüj Permeabilization / Wash 1 ml ekleyerek yıkayın.
- Permeabilization / Yıkama tampon 100 ul pelet yeniden askıya ve tüpün sitometri akışı geçmek.
- flow sitometri ile örnekleri analiz edin. Yan-dağınık ışık / ileri-dağınık ışık (SSC / FSC) penceresi kapılı canlı hücrelerde CD45 boyanma belirleyin. İkinci bir aşamada, CD68 + hücrelerinde CD86 ve CD163 ifadesini analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz böbrekteki makrofajlar infiltre artan varlığı ile ilişkili renal hasar inflamatuar deneysel modelinde makrofaj heterojenite analiz. Daha önce belirtildiği gibi 12 Bu modelde, böbrek hasarı, Wistar sıçanlarının 3 hafta için içme suyu aldosteronun (1 mg -1 kg-1 gün) artı tuz (NaCl,% 1), ilaç olarak verilmesi ile indüklenmiştir.
Deneylerimizde çizelgesi, Şekil 1 'de gösterilmiştir. İlk olarak, böbrek hücreleri izole edildi mekanik yöntemler ve kolajenaz (Şekil 1A) ile daha fazla enzimatik sindirim kullanılarak. Bundan sonra, eritrositler parçalanmıştır ve böbrek makrofajlar akım sitometrisi ile tespit edildi. Hücreler, zar algılama ve CD68 hücre içi boyanması için (Şekil 1B) için CD45, CD86 ve CD163 antikorları ile inkübe edildi. makrofaj p Son olarak, fenotipopulations Şekil 1C'de gösterdi şemaya göre analiz edilmiştir.
Böbrek makrofaj içerik CD45 ve CD68 (Şekil 2A) için çift pozitifliği ile hücrelerin seçilerek analiz edildi. (Yukarıda tarif protokolü kontrol grubu (toplam böbrek hücre başına + makrofajlar 0.57 ± 0.16 genel 0.25 ± 0.02,% CD45 + / CD68) ile karşılaştırıldığında aldosteron ile tedavi edilen farelerde gözlenmiştir CD45 + / CD68 + makrofajlarda artış kullanılarak Şekil 2) masa ekine bakın. Mor boya ile boyama akış sitometrisi ile tespit edildiği üzere, CD45 + / CD68 + makrofajlarda Hücre canlılığı, rutin olarak oldu% 95'ten (veriler gösterilmemiştir) .Thereafter, CD86 (M + -1 markeri) ve CD163 (M2 belirteci) sentezleme arasında değerlendirildi CD45 + / CD68 + hücreleri. Aldosteron idaresi CD45 + / CD68 + / CD86 + M1 içeriği arttımakrofajlar (2.87 ± 2.3 vs 1.36 ± 0.68;% CD45 + / CD68 + / CD86 + toplam CD45 + / CD68 + hücreler başına makrofajlar) (Şekil 2). Ancak, CD45 + / CD68 düşük sayısı + / CD163 + M2 makrofajlar hem aldosteron-tedavi ve kontrol gruplarında gözlendi. Daha önce 13 açıklandığı gibi düşük CD163 ifadesi deneysel protokol sırasında proteolitik dökülme ile ilişkili olup olmadığını analiz etmek için, biz, sıçan periton izole makrofajlarda kollajenaz sindirim dahil olmak üzere bu yordamı tekrarladı. Şekil 2B'de bildirildiği gibi, CD45 + / CD68 + periton makrofajlar seçilen antikorların programı doğrulayarak ve sıçan böbreğinde M1 / M2 makrofajlar karakterizasyonu için protokol etkinliğini teyit CD86 ve CD163 hem pozitif idi.
Bu sonuçları doğrulamak için,Yukarıdaki deneysel modellerde böbrek hasarı ile ilişkili inflamatuar yanıtı immünohistokimya ve gerçek zamanlı PCR ile incelenmiştir. Şekil 3'te belirtildiği gibi, kontrol ile karşılaştırıldığında CD68 + makrofajlar, aldosteron + tuz ile tedavi edilen sıçanlarda gözlenmiştir artmıştır. Daha sonra, makrofaj fenotip belirteçleri böbrek M1 / M2 makrofaj dağılımını karakterize etmek için belirlenmiştir. Arg1 veya IL-10 mRNA ekspresyonu (M2 makrofaj markerlerinin) aldosteron uygulanmasından sonra değişmedi ise artan iNOS mRNA ekspresyon ve IFN-γ (M + -1 işaretleri), aldosteron + tuz tedaviden sonra gözlenmiştir. Birlikte, bu sonuçlar aldosteron + tuz yönetim in vivo inflamatuar M1 makrofaj fenotipi aracılık ettiğini teyit etmektedir.
Şekil 1: Protokol Sitometrisi ile Böbrek Hücreleri İzolasyon ve Makrofaj Algılama. (B) böbrek hücre izolasyonu (A) ve makrofaj tespit g> şematik gösterimi. CD45, CD68, CD86 ve CD163 belirteçleri (C) farklı dağılımına göre farklı makrofaj fenotipleri Temsilcisi düzeni. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Aldosteron M1 ve M2 Böbrekler Makrofaj Göstergeler, Yan saçılan ışık / ileri-dağınık ışık (SSC / FSC) pencere (A kapılı canlı hücrelerde Sitometrisi ile CD45 boyama Temsilcisi nokta araziler Sıçanlarda sol ) kontrol ve aldosteron + tuz ile tedavi edilen hayvanlarda böbrek süspansiyonlardan. nokta araziler içinde kutu canlı hücreleri tanımlayanCD45 eksprese eden. Bu kutuya dahil Hücreler (sağ, A) CD68 + hücrelerde CD86 ve CD163 ifadesini belirlemek için analiz edildi. Daha önce kullanılan aynı strateji uygulayarak CD45, CD68, CD86 ve CD163 tespiti için pozitif kontrol olarak, periton makrofajları için nokta arsa. Veri SEM (B) ortalama ± olarak sunulmuştur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Aldosteron + Tuz İdaresi sonra İnflamatuar Yanıt. (A) CD68 boyama ve Örnek görüntüleri (B) ve kontrol aldosteron + tuz ile tedavi edilen sıçanlarda M1 belirteçler için RT-PCR (İNOS ve INFγ) ve M2 belirteçleri (ARG1 ve IL-10) ile ölçülen mRNA seviyelerinin niceliksel analizi. Veriler ifade vardıred ortalama ± SEM. * P <0.05 vs kontrolü. Ölçek çubuğu:. 100 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Makrofajlar, renal bozukluklar da dahil olmak üzere, farklı enflamatuar hastalıkların, önemli bir rol oynamaktadır, heterojen hücrelerdir. Her makrofaj ICSI'nin glomerülonefrit, diyabetik nefropati ve böbrek kanseri 14-16 belirtildiği gibi, böbrek hasarı gelişmesine farklı bir şekilde katkıda çünkü böbrek hastalığı makrofajlar alt gruplarının karakterizasyonu artan bir ilgi vardır. Akut böbrek hasarı erken evrelerinde, M1 makrofajlar bir üstünlüğü tübüler nekroz ve inflamasyon teşvik görülmektedir. Bununla birlikte, daha sonraki aşamalarda M2 makrofajların yüksek bir içeriği iltihabı gidermek ve dokunun yeniden katılma görülmektedir. M1, baskın olacak ve böylece artan ve inflamatuvar böbrek hasarı sürdürmekte rağmen kronik böbrek hastalığında, M1 ve M2 makrofajlar, hem aynı anda birlikte var. Bu nedenle, böbrek hastalığı makrofaj alt tiplerinin patofizyolojik rolü bilgimizi artırmak için önemlidir. Immünohistokimyasal çalışmalar sağlam bir şekilde 17 makrofaj alt kümelerinin yüzdesini belirleyemiyor. Nedenle, nicelik farklı makrofaj fenotipleri belirlemek ve böbrek inflamatuvar yanıt üzerine bu hücrelerin rolünü anlamak için yeni teknikler geliştirilmesi gerekmektedir.
Bu el yazması sıçanlarda flow sitometri böbrek makrofajlar alt kümelerinin sayısını ve fenotip belirlemek için bir protokol tanımlamaktadır. Bizim çalışmamızda, sıçanlar aldosteron uygulanması ile böbrek hasarının bir enflamatuar modeline tabi tutulmuştur. Akış sitometrisi ile belirlenir ve immünohistokimya ile teyit edildiği gibi, bu modelde, CD45 + ve C68 + makrofaj infiltrasyonu artış gözlemledi. Ayrıca, M1 makrofajlar (CD68 + / CD86 +), ancak M2 makrofaj zenginleşmesi, aldosteron ile tedavi edilmiş farelerde gözlenmiştir. Bu sonuçlar, M1 (iNOS ve IFN-y) mRNA ekspresyonunu ve M2 macroph belirlenerek teyit edildiYaş işaretleri (Arg1 veya IL-10). izolasyon protokol sırasında analiz bildirilen düşük hücre ölüm Flow sitometri. Bu tip birkaç doku ayrışma seviyesi hücre canlılığı ve yüzey belirteçleri algılama etkileyebilecek faktörler yanı sıra, süre ve Doku sindirimi (enzimatik, mekanik, vb) türü vardır. Aşırı sindirim hücre ölümleri ve makrofaj aktivasyonunu artırır ve ters etki düşük böbrek ayrılma kaynaklanabilir ise yüzey işaretleyici ifade azalır. protokol fare periton izole edilmiş makrofajlar içinde yürütülmüştür, ancak, CD86 ve CD163 geliştirilmiş olması, bu hücrelerde gözlenmiştir.
Bizim protokol aldosteron aracılı hipertansiyonu olan sıçanların böbreklerde makrofaj heterojenliği belirlemek için optimize edilmiştir ve bu nedenle, diğer inflamatuar böbrek hastalığı modellerinde tahmin edilebilmektedir. Bununla birlikte, bu prosedür, her deneysel koşul için adapte edilebilir enflamasyon değiştirir içinböylece kollajenaz doku sindirim hızını etkileyen doku bütünlüğü.
Toplam makrofaj içeriğinin belirlenmesi için dikkat etmek önemlidir, hücreler sabit ve CD68 antikoru 18 ile hücre içi etiketleme izin permeabilize edildi. sabitleme için protokol fluorochromes birincil antikorlar, özellikle fikoeritrin konjuge etkileyebilir formaldehit kullanımı dahil. Bu sorunu çözmek için, CD86-PE antikor ile inkübasyon tespiti / Permeabilization çözeltisi ve daha CD68 boyama ilave edildikten sonra gerçekleştirilmiştir. Diğer taraftan, aynı zamanda, mRNA sentezleme tahlilleri gibi makrofajlar izolasyondan sonra gerçekleştirilebilir diğer tahlillerde, müdahale olabilir formaldehit dikkat etmek önemlidir. Bununla birlikte, formaldehid sabit hücrelerden mRNA izole etmek için mevcut ticari kitler bulunmaktadır.
Özet olarak, bu protokol kantitatif bir renal makrofajların Fenotipik karakterizasyonu için bir yöntem tarif ederA.Ş. şekilde akım sitometri kullanarak. Genel olarak, burada açıklanan protokol sıçan böbreklerinde farklı makrofaj popülasyonları ayırmak için, kullanımı kolay, tekrarlanabilir ve yararlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminar flow hood | Faster | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Hettich | Or equivalent equipment | |
| Flow cytometer (FACSAria) | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum | BioWest | S1820-500 | |
| PBS 10x | LONZA | BE17-515Q | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 12/1/9001 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher Scientific | A10492-01 | |
| Flow cytometry strainers | BD Biosciences | 340626 | |
| Falcon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 352340 | |
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352052 | 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube |
| Centrifuge tubes | Corning centristar | 430791 | |
| Water bath | Memmert GmbH + Co. KG | WNE 7 | 37 °C |
| Fixation/Permeabilization Solution or Permeabilization/Wash Buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Rompum (Xylazine) | Bayer | Or equivalent | |
| Ketalar (Ketamine) | Pfizer | Or equivalent | |
| Hanks’ balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H8264-500ML | |
| Saline solution | Braun | 622415 | |
| Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7 | Biolegend | 202216 | Diluted 1:100 |
| Anti-CD68 (clone: ED1) FITC | Bio-RAD | MCA341F | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD86 (clone: 24F) PE | Biolegend | 200307 | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647 | Bio-RAD | MCA342R | Diluted 4:100 |
| Live/dead stain | Molecular Probes | L34955 | Diluted 3:1,000 |
References
- Gansevoort, R. T., et al. Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention. Lancet. 382, 339-352 (2013).
- Kon, V., Linton, M. F., Fazio, S. Atherosclerosis in chronic kidney disease: the role of macrophages. Nat. Rev. Nephrol. 7, 45-54 (2011).
- Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Exp. Nephrol. 128, 21-29 (2014).
- Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26, 1363-1377 (2015).
- Kinsey, G. R. Macrophage dynamics in AKI to CKD progression. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 209-211 (2014).
- Lech, M., et al. Macrophage phenotype controls long-term AKI outcomes--kidney regeneration versus atrophy. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 292-304 (2014).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat. Rev. Immunol. 8, 958-969 (2008).
- Ortiz, A., et al. Translational value of animal models of kidney failure. Eur. J. Pharmacol. 759, 205-220 (2015).
- Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of double negative alphabeta T cells from the. J. Vis. Exp. , (2014).
- Martin-Fernandez, B., et al. Aldosterone Induces Renal Fibrosis and Inflammatory M1-Macrophage Subtype via Mineralocorticoid Receptor in Rats. PLoS. One. 11, e0145946 (2016).
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. J. Vis. Exp. (e52749), (2015).
- Komohara, Y., et al. Macrophage infiltration and its prognostic relevance in clear cell renal cell carcinoma. Cancer Sci. 102, 1424-1431 (2011).
- Han, Y., Ma, F. Y., Tesch, G. H., Manthey, C. L., Nikolic-Paterson, D. J. Role of macrophages in the fibrotic phase of rat crescentic glomerulonephritis. Am. J. Physiol Renal Physiol. 304, F1043-F1053 (2013).
- Ndisang, J. F. Role of the heme oxygenase-adiponectin-atrial natriuretic peptide axis in renal function. Curr. Pharm. Des. 21, 4380-4391 (2015).
- Blackbeard, J., et al. Quantification of the rat spinal microglial response to peripheral nerve injury as revealed by immunohistochemical image analysis and flow cytometry. J. Neurosci. Methods. 164, 207-217 (2007).
- Strobl, H., Scheinecker, C., Csmarits, B., Majdic, O., Knapp, W. Flow cytometric analysis of intracellular CD68 molecule expression in normal and malignant haemopoiesis. Br. J. Haematol. 90, 774-782 (1995).
